5′tRF-LysCTT對小鼠心肌細胞鐵死亡的調控作用及其機制

［摘要］ 目的

探究tRNA衍生的小RNA（tsRNA）對小鼠心肌細胞鐵死亡的調控作用及其機制。

方法 采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測8周齡C57BL/6J小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腦、肌肉中5′tRF-LysCTT的相對表達水平。將原代心肌細胞分為A～D組，A組細胞使用完全培養基培養60 h，B組先使用完全培養基培養24 h，再依次進行饑餓處理12 h，H/R處理24 h，C組和D組細胞分別轉染antagomir-NC和antagomir-5′tRF-LysCTT，并于轉染24 h后再依次進行饑餓（12 h）和H/R處理（12 h）；將原代心肌細胞分為E～G組，E組細胞使用完全培養基培養24 h，F組細胞轉染agomir-NC 24 h，G組心肌細胞轉染agomir-5′tRF-LysCTT 24 h。采用RT-qPCR檢測A～G組小鼠心肌細胞中5′tRF-LysCTT和Ptgs2、Gpx4、Slc7a11的相對表達水平，分別采用亞鐵離子比色法測試盒、脂質活性氧（ROS）染色、CCK8試劑盒檢測A～G組小鼠心肌細胞內亞鐵離子相對水平、ROS水平及心肌細胞的存活率，采用普魯士藍染色試劑盒觀察A～G組小鼠心肌細胞內鐵離子沉積情況。

結果 RT-qPCR檢測結果顯示，與肝臟、脾臟、腎臟、大腦、肌肉中相比較，小鼠心臟中5′tRF-LysCTT表達水平最高（F=16.21，t=3.81～7.93，Plt;0.05）。D組與B組相比，心肌細胞內5′tRF-LysCTT和Ptgs2相對表達水平降低、Gpx4以及Slc7a11相對表達水平升高、亞鐵離子相對水平和ROS水平降低，心肌細胞的細胞存活率升高（t=3.26～15.61，Plt;0.05），細胞內鐵離子沉積明顯增多，而C組與B組相比，細胞內的上述指標的水平差異無顯著性（P＞0.05）。G組與E組相比，心肌細胞內5′tRF-LysCTT和Ptgs2相對表達水平升高、Gpx4和Slc7a11相對表達水平降低、亞鐵離子相對水平和ROS水平升高，心肌細胞的細胞存活率降低（t=3.57～91.84，Plt;0.05），細胞內鐵離子沉積明顯減少，而F組與E組相比，細胞內的上述指標的水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。

結論 5′tRF-LysCTT對于小鼠心肌細胞鐵死亡具有調控作用，敲低細胞內5′tRF-LysCTT可以抑制H/R誘導的心肌細胞鐵死亡，而過表達5′tRF-LysCTT可促進心肌細胞鐵死亡的發生。

［關鍵詞］ RNA，轉移；RNA，非翻譯小片段；低氧；心肌再灌注損傷；肌細胞，心臟；鐵死亡

［中圖分類號］ R329.2;R542.2

［文獻標志碼］ A

Regulatory effect of 5′tRF-LysCTT on ferroptosis in mouse cardiomyocytes and its mechanism

ZHAO Yan， WANG Kai， CHENG Xueli， WANG Kun

（Institute of Translational Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the regulatory effect of tRNA-derived small RNA （tsRNA） on ferroptosis in mouse cardiomyocytes and its mechanism.

Methods RT-qPCR was used to measure the relative expression level of 5′tRF-LysCTT in the heart， liver， spleen， kidney， brain， and muscle of C57BL/6J mice aged 8 weeks. Primary cultured cardiomyocytes were divi-

ded into groups A， B， C， and D： the cardiomyocytes in group A were cultured in a complete medium for 60 h; those in group B were cultured in a complete medium for 24 h， followed by starvation treatment for 12 h and H/R treatment for 24 h; those in groups C and D were transfected with antagomir-NC and antagomir-5′tRF-LysCTT， respectively， and were given starvation treatment （12 h） and H/R treatment （12 h） after 24 h of transfection. Primary cultured cardiomyocytes were divided into groups E， F， and G： the cardiomyocytes in group E were cultured in a complete medium for 24 h; those in group F were transfected with agomir-NC for 24 h; those in group G were transfected with agomir-5′tRF-LysCTT for 24 h. RT-qPCR was used to measure the relative expression levels of 5′tRF-LysCTT， Ptgs2， Gpx4， and Slc7a11 in mouse cardiomyocytes of groups A-G; ferrous ion colorimetric test kit， lipid reactive oxygen species （ROS） staining， and CCK8 assay kit were used to measure the relative content of ferrous ions， ROS level， and the survival rate of cardiomyocytes in groups A-G; Prussian blue staining was used to observe iron ion deposition in cardiomyocytes.

Results RT-qPCR showed that the expression level of 5′tRF-LysCTT in heart was significantly higher than that in the liver， spleen， kidney， brain， and muscle （F=16.21，t=3.81-7.93，Plt;0.05）. Compared with group B， group D had significant reductions in the relative expression levels of 5′tRF-LysCTT and Ptgs2， significant increases in the relative expression levels of Gpx4 and Slc7a11， significant reductions in the relative content of ferrous ions and ROS level， and a significant increase in the survival rate of cardiomyocytes （t=3.26-15.61，Plt;0.05）， as well as a significant increase in iron ion deposition in cardiomyocytes， while there were no significant differences in the above indicators between group C and group B （Pgt;0.05）. Compared with group E， group G had significant increases in the relative expression levels of 5′tRF-LysCTT and Ptgs2， significant reductions in the relative expression levels of Gpx4 and Slc7a11， significant increases in the relative content of ferrous ions and ROS level， and a significant reduction in the survival rate of cardiomyocytes （t=3.57-91.84，Plt;0.05）， as well as a significant reduction in iron ion deposition in cardiomyocytes， while there were no significant differences in the above indicators between group F and group E （Pgt;0.05）.

Conclusion 5′tRF-LysCTT can regulate ferroptosis in mouse cardiomyocytes， and knockdown of 5′tRF-LysCTT can inhibit cardiomyocyte ferroptosis induced by H/R， while overexpression of 5′tRF-LysCTT can promote cardiomyocyte ferroptosis.

［KEY WORDS］ RNA， transfer; RNA， small untranslated; Hypoxia; Myocardial reperfusion injury; Myocytes， cardiac; Ferroptosis

缺血性心臟病是一種死亡率很高的心血管疾病［1］，臨床常用的治療方式是再灌注治療，但可能會引起心肌細胞的缺血再灌注損傷，這也是目前臨床中亟待解決的難題。研究發現，心肌細胞中tRNA衍生的小RNA（tsRNA）與心血管疾病息息相關，通過調節RNA結合蛋白［2］、誘導表觀遺傳修飾［3］等方式參與各種心血管疾病的發生。作為一種新型tsRNA，研究發現5′tRF-LysCTT在心肌缺血大鼠心肌細胞中表達上調，推測其參與心肌缺血性損傷的機制可能與大分子代謝有關［4］，提示tsRNA也許可以成為心血管疾病的潛在診斷標志物。

鐵死亡由DIXON等［5］于2012年首次提出，是一種鐵依賴性脂質過氧化的細胞死亡過程。心肌細胞缺血再灌注損傷發生時與心肌細胞鐵死亡發生時的特征一致［6］。目前研究表明，心力衰竭時GPX4下調也會引起心肌細胞的鐵死亡［7］，而tsRNA可能會影響GPX4、SLC7A11等與鐵死亡相關的蛋白合成［8］，但目前有關tsRNA在心肌細胞鐵死亡過程中的調控作用及其具體機制尚不明確。本研究通過敲低和過表達原代心肌細胞中的5′tRF-LysCTT，探究5′tRF-LysCTT對缺氧/復氧（H/R）誘導的心肌細胞鐵死亡的調控作用，為心肌細胞缺血再灌注損傷的治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1～3日齡乳鼠（青島大任富城畜牧有限公司），8周齡C57BL/6J小鼠（濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒（上

海翌圣生物科技股份有限公司），特異性antagomir/

agomir以及其陰性對照（NC）（上海吉瑪制藥技術有限公司），亞鐵離子比色法試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），C11 BODIPY 581/591脂質過氧化熒光探針（武漢愛博泰克生物科技有限公司），普魯士藍染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），CCK8試劑盒及其試劑（上海陶術生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代心肌細胞和小鼠組織的獲取 乳鼠斷頸處死后，無菌條件下取出心臟，PBS洗滌3次。剪碎心臟組織置于錐形瓶中，用含膠原酶和胰液素的消化液（現用現配）37 ℃下消化至無明顯組織塊。收集含細胞的消化液以1 000 r/min離心5 min，用DMEM-F12完全培養基重懸細胞沉淀。過濾細胞混懸液至培養皿，在細胞培養箱內靜置1.5 h后，以1 000 r/min離心5 min，用DMEM-F12完全培養基重懸細胞沉淀，接種至新的細胞培養皿培養。

將3只8周齡C57BL/6J小鼠以乙醚氣霧麻醉后，斷頸處死，剝離出心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腦、肌肉等組織器官，于-80 ℃保存備用。

1.2.2 細胞培養與分組處理 將原代心肌細胞接種于細胞6孔板、24孔板、96孔板、10 cm培養皿中，用DMEM-F12完全培養基（含5% FBS和1%雙抗）于37 ℃含體積分數0.05 CO2細胞培養箱內培養24 h。待細胞密度約達60%時分為A～D組，A組細胞使用DMEM-F12完全培養基培養60 h；B組細胞先使用DMEM-F12完全培養基培養24 h，C、D組參照Lipo8000說明書分別轉染antagomir-NC、antagomir-5′tRF-LysCTT 24 h，后B～D組更換為無糖無血清培養基繼續培養12 h，置于厭氧培養箱中缺氧處理18 h，再更換為DMEM-F12完全培養基復氧培養6 h。將細胞密度約達60%時的原代心肌細胞分為E～G組，E組用DMEM-F12完全培養基培養24 h，F組轉染agomir-NC 24 h，G組轉染agomir-5′tRF-LysCTT 24 h。

1.2.3 RT-qPCR檢測小鼠各器官組織中5′tRF-LysCTT的相對表達水平以及心肌細胞中5′tRF-LysCTT、Ptgs2、Gpx4、Slc7a11的相對表達水平

將接種于6孔板中處理結束后的A～G組細胞，使用Trizol試劑提取細胞中的RNA。將細胞中提取的RNA按照反轉錄試劑盒說明書的要求進行反轉錄。以cDNA為模板，進行RT-qPCR。每組設置３個復孔，實驗重復３次，采用2－△△CT方法計算心肌細胞中5′tRF-LysCTT（U6作為內參）及Ptgs2、Gpx4、Slc7a11（GAPDH為內參）的相對表達水平。取各組小鼠的內臟器官組織置于EP管中，加入組織研磨珠及Trizol試劑，研磨以后提取組織中的RNA，按照上面的方法，檢測各器官組織中5′tRF-LysCTT

的相對表達水平。引物名稱及序列見表1。

1.2.4 心肌細胞中亞鐵離子相對水平檢測 將接種于直徑10 cm培養皿中處理結束后的A～G組細胞收集于EP管中，加入裂解液冰浴裂解細胞，取上清液和顯色液混合，于37 ℃下水浴10 min后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液按照說明書要求的步驟，檢測各組細胞中亞鐵離子相對水平。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.5 心肌細胞中ROS水平檢測 將接種于24孔板中處理結束后的A～G組細胞，用PBS洗滌3次后，每孔中加入C11 BODIPY 581/591探針染液100 μL，染色1 h，吸出染液，用PBS洗滌3次；加入100 μL DAPI染色5 min，用PBS洗滌3次后封片。使用普通熒光顯微鏡采集相關圖像，用Image J軟件測量計算相對熒光強度。以相對熒光強度表示細胞中ROS水平。實驗重復3次，結果取均值。

1.2.6 CCK8檢測心肌細胞的細胞存活率 將接種于96孔板中處理結束后的A～G組細胞，吸除培養基，按照1∶9的比例配制CCK8試劑與DMEM-F12培養基的混合培養液，取100 μL混合培養液加入各孔中，37 ℃下培養2～4 h，用酶標儀檢測波長450 nm處吸光度，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組吸光度均值－空白組吸光度均值）/（對照組吸光度均值－空白組吸光度均值）×100%。

1.2.7 普魯士藍染色觀察心肌細胞內鐵離子的沉

積情況 將接種于10 cm培養皿中處理結束后的A～G組細胞，用PBS洗滌3次，以4%多聚甲醛固定10～20 min，普魯士藍染色液染色30 min，核固紅染色液染色5 min。在梯度乙醇和二甲苯中各浸泡10 s后，滴加中性樹脂封片，待樹脂凝固后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學分析

使用Graphpad Prism軟件進行統計學分析，計量結果以x-±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 小鼠各器官組織中5′tRF-LysCTT表達情況

RT-qPCR檢測結果顯示，小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腦、肌肉組織當中的5′tRF-LysCTT相對表達水平分別為1.01±0.18、0.28±0.13、0.18±0.03、0.19±0.05、0.01±0.01、0.53±0.29，5′tRF-LysCTT在心臟組織中的表達最高（F=16.21，t=3.81～7.93，Plt;0.05）。

2.2 敲低5′tRF-LysCTT對H/R誘導的心肌細胞鐵死亡的影響

A～D組原代心肌細胞中5′tRF-LysCTT、Ptgs2、Gpx4、Slc7a11的相對表達水平，亞鐵離子相對水平，ROS水平及細胞存活率比較，均有顯著性差異（F=15.50～368.70，Plt;0.05）。與B、C組相比，D組細胞中5′tRF-LysCTT、Ptgs2相對表達水平明顯下調，Gpx4、Slc7a11相對表達水平明顯上調，亞鐵離子相對水平、ROS水平顯著下降，細胞存活率顯著升高（t=2.73～15.61，Plt;0.05）；與B組相比，A組細胞的上述指標差異顯著（t=5.30～28.96，Plt;0.05），而C組細胞上述指標差異無顯著性（P＞0.05）。見表2。與B組相比較，D組細胞內鐵離子沉積明顯減少（圖1），圖中箭頭所指的藍點即為染色的鐵離子。

2.3 過表達5′tRF-LysCTT對心肌細胞鐵死亡的影響

E～G組原代心肌細胞當中5′tRF-LysCTT、Ptgs2、Gpx4、Slc7a11的相對表達水平，亞鐵離子相對水平，ROS水平及細胞存活率比較，有顯著性差異（F=9.99～5 329.00，Plt;0.05）。與E、F組相比，G組細胞中5′tRF-LysCTT、Ptgs2相對表達水平明顯上調，Gpx4、Slc7a11相對表達水平明顯下調，亞鐵離子相對水平、ROS水平顯著上升，細胞存活率明顯降低（t=3.57～91.84，Plt;0.05）；與E組相比，F組細胞上述指標差異無顯著性（P＞0.05）。見表3。與E組相比，G組細胞內鐵離子沉積明顯增多（圖2），圖中箭頭所指藍點即為染色的鐵離子。

3 討" 論

在我國缺血性心臟病患病率較高，并呈逐年上升和年輕化趨勢，及時預防和治療，對患者生活質量的保障及壽命的延長至關重要［9］，建立有效的預防和治療機制是降低心血管疾病發生的重要措施［10］。血液供應不足的心肌組織，再灌注恢復血液后［11］，會引發心肌細胞壞死［1］、凋亡［12］、鐵死亡［13］，導致大量心肌細胞死亡。

tsRNA作為新型非編碼小RNA，分為tiRNA和tRF兩類［14］，對細胞增殖［15］、凋亡［16］及細胞內蛋白質翻譯［17］等均有影響，參與腫瘤［18］、神經疾病［19］等多種疾病的發生和發展。機體的衰老、代謝紊亂等都可能誘導tsRNA的產生［20］。tsRNA在心肌肥大［21］、動脈粥樣硬化［22］、主動脈夾層［23］等疾病發生過程中發揮調控作用。SHEN等［21］研究發現，在異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟肥大模型中，心臟組織中tRF會發生特異性分裂，促進心肌細胞的心鈉素、腦鈉肽、β-肌球蛋白重鏈的表達。在皮下注射異丙腎上腺素致心肌肥大模型大鼠中，心肌細胞內的tRF表達顯著增高，其子代小鼠的心臟組織中也同樣高表達tRF，同時子代大鼠還伴有心肌細胞凋亡、心肌纖維斷裂、心臟組織內肥大基因表達水平升高等情況［21］。以上研究表明，tsRNA在心肌細胞鐵死亡過程中發揮著關鍵性作用，但具體機制尚不明確。本研究通過預實驗發現，在小鼠心臟缺血再灌注損傷模型中，有多個顯著差異表達的tsRNA，但是5′tRF-LysCTT異常表達程度較高。以此為基礎，本研究通過檢測5′tRF-LysCTT在正常小鼠不同組織中的表達水平，發現與肝臟、脾臟、腎臟、大腦、肌肉組織相比，5′tRF-LysCTT在心臟組織中表達峰度最高，進一步表明5′tRF-LysCTT可能與心肌細胞存在一定的關聯。

鐵死亡是一種程序性細胞死亡，主要特點為細胞內鐵離子穩態失衡，細胞內的ROS和脂質過氧化物顯著增多［24］。心肌細胞鐵死亡時會產生過量的游離鐵離子，這些鐵離子能通過芬頓反應增加羥基自由基的產生，引起心肌細胞內ROS水平升高，對心肌細胞造成氧化損傷［25］。正常情況下，胱氨酸可通過胱氨酸/谷氨酸逆向轉運系統（由SLC7A11和SLC3A2兩種亞基組成）轉移至細胞內合成谷胱甘肽，GPX-4（谷胱甘肽依賴酶）可將谷胱甘肽轉化為氧化型谷胱甘肽，進而清除細胞呼吸和代謝過程中產生的過量過氧化物和羥自由基［26］。在心肌細胞內，谷胱甘肽的耗竭和GPX4活性降低，使脂質過氧化物不能通過GPX4轉化為脂醇，致心肌細胞內產生過多的鐵蛋白和ROS，從而導致心肌細胞發生鐵死亡［27］。心肌細胞缺血再灌注損傷發生時與心肌細胞鐵死亡發生時的特征一致，即均存在ROS水平升高及游離鐵離子增多［28］，由此可以推測心肌細胞缺血再灌注損傷時也發生了鐵死亡。為了驗證心肌缺血再灌注損傷會誘導鐵死亡的發生，本研究通過H/R處理原代心肌細胞以模擬心肌缺血再灌注損傷，結果顯示，與A組細胞相比，B組心肌細胞中亞鐵離子含量明顯上調，ROS水平明顯增強，鐵離子沉積明顯增多，細胞存活率下降，表明H/R處理后原代心肌細胞發生鐵死亡。同時本研究還發現，經H/R處理后的心肌細胞中Ptgs2相對表達水平明顯上調，Gpx4和Slc7a11相對表達水平明顯下調。研究顯示，對心臟缺血再灌注小鼠采用利普洛司他汀-1（鐵死亡抑制劑）處理，發現小鼠心臟組織中的GPX4蛋白水平較處理前顯著升高，心肌細胞線粒體中ROS也較處理前顯著降低［29］，說明利普洛司他汀-1通過抑制心肌細胞鐵死亡，提升了心肌細胞中GPX4蛋白水平，保護心肌細胞免受缺血再灌注損傷。有研究對C75BL/6小鼠的心臟進行缺血再灌注（30 min/24 h）手術后，提取小鼠心臟組織中的RNA，發現與假手術組相比，手術組小鼠心臟組織中Ptgs2表達水平明顯升高；如果小鼠術前24 h或2 h分別給予鐵蛋白抑制劑或鐵螯合劑預處理后再進行缺血再灌注手術，結果顯示與手術組小鼠相比，術前預處理組小鼠的心肌梗死面積顯著減少［30］。本研究的結果與上述文獻報道結果一致，說明心肌細胞鐵在死亡發生時，其細胞內的Ptgs2表達水平會出現明顯上調，Gpx4和Slc7a11表達水平明顯下調。

為進一步探討5′tRF-LysCTT在H/R誘導心肌細胞發生鐵死亡過程中的生物學功能，本研究通過轉染antagomir-5′tRF-LysCTT，以敲低心肌細胞中5′tRF-LysCTT的水平，結果顯示，敲低心肌細胞中的5′tRF-LysCTT后，與B、C組相比，D組心肌細胞中亞鐵離子含量下調，ROS水平降低，鐵離子沉積明顯減少，Ptgs2相對表達水平下調，Gpx4和Slc7a11相對表達水平上調，細胞存活率升高。然后本研究又通過轉染agomir-5′tRF-LysCTT，以過表達心肌細胞中的5′tRF-LysCTT水平，結果顯示，與E、F組相比，G組心肌細胞中亞鐵離子含量明顯上調，ROS水平明顯升高，鐵離子沉積增多，Ptgs2相對表達水平明顯上調，Gpx4和Slc7a11相對表達水平明顯下調，細胞存活率降低。提示5′tRF-LysCTT可能對心肌細胞的鐵死亡具有調控作用。

綜上所述，H/R會誘導心肌細胞發生鐵死亡，敲低5′tRF-LysCTT會抑制H/R誘導的心肌細胞鐵死亡，過表達5′tRF-LysCTT能促進心肌細胞發生鐵死亡，5′tRF-LysCTT可能對心肌細胞的鐵死亡具有調控作用，由此可以推測，5′tRF-LysCTT或許可以成為治療心肌缺血再灌注損傷的新靶點。后續將通過質譜分析尋找5′tRF-LysCTT的下游靶點，探索5′tRF-LysCTT與下游靶分子共同調控心肌細胞鐵死亡的作用及其機制，為臨床研究提供參考依據。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有實驗均已通過青島大學實驗動物福利倫理委員會的審核批準（文件號20220305C5790-20240601003）。所有實驗過程均遵照《實驗動物福利倫理原則》的條例進行。

作者聲明：趙炎、王凱、程雪麗參與了研究設計；趙炎、王昆參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）