TMEM16A通過激活NF-κB促進腦膠質瘤惡性進展的機制研究

【摘要】 目的 探討跨膜蛋白16A（TMEM16A）對腦膠質瘤惡性進展的影響及作用機制。方法 使用shRNA或慢病毒構建TMEM16A敲低的U87MG和LN229膠質瘤細胞系，并設置陰性對照組（Scrb shRNA）和shRNA組。使用GV141-TMEM16A質粒構建TMEM16A過表達細胞系，并設置空載體對照組（Vector）和TMEM16A過表達組。實時熒光定量PCR檢測TMEM16A和IκBα的mRNA表達。Western Blot和免疫組織化學染色檢測蛋白表達。CCK8、EdU、流式細胞術、劃痕實驗和Transwell實驗分析細胞活力、增殖、細胞周期、凋亡、遷移和侵襲等生物學特征。雙熒光素酶報告基因系統檢測TMEM16A對NF-κB活性的影響。放線菌酮追逐實驗和免疫共免疫沉淀研究TMEM16A活化NF-κB信號通路的機制。顱內小鼠腦膠質瘤模型評價TMEM16A在體對膠質瘤形成的影響。結果 與癌旁對照組織或與正常星形膠質細胞（NHA）相比，TMEM16A的表達在膠質瘤組織和細胞中顯著增加，并且TMEM16A的表達水平隨膠質瘤的等級增加而升高。與Scrb shRNA組相比，敲低TMEM16A能有效阻止U87MG和LN229細胞的增殖、遷移以及侵襲，并可引發細胞的周期性停止以及凋亡。Western Blot顯示，與Scrb shRNA組相比，TMEM16A敲低組細胞中，p21、p27、Bax、cl-caspase-3和E-cadherin表達明顯升高；cyclin D1、cyclin E1、CDK2、CDK4、Bcl-2、TWIST1、N-cadherin、Vimentin、Slug、MMP2和MMP9表達下調。此外，TMEM16A通過泛素化介導的IκBα蛋白降解促進NF-κB信號通路的激活。體內實驗結果表明，與Scrb shRNA組相比，TMEM16A敲低組小鼠膠質瘤的形成明顯受到抑制。結論 TMEM16A/NF-κB軸驅動腦膠質瘤的發生發展，并為膠質瘤的治療提供依據。

【關鍵詞】 膠質瘤；跨膜蛋白16A；NF-κB

【中圖分類號】 R739.41 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2024）05-0501-10

Transmembrane protein 16A promotes glioma malignancy via activation of nuclear factor κB signaling pathway LUO Xiaoquan， FENG Hao， SUN Mou， LI Chengke， XIA Xun. Department of Neurosurgery， Nanchong Central Hospital， Nanchong 637000， China

Corresponding author： XIA Xun

Abstract： Objective To explore the influence and the underlying mechanism of transmembrane protein 16A（TMEM16A） on glioma. Methods U87MG and LN229 glioma cell lines with TMEM16A knockdown were constructed by using shRNA or lentivirus， and negative control group（Scrb shRNA） and shRNA group were set up. TMEM16A overexpression was constructed by using the GV141-TMEM16A plasmid and empty vector control group（Vector） and TMEM16A overexpression group were set up. The mRNA levels of TMEM16A and IκBα were determined by quantitative real-time PCR（qRT-PCR）. Western Blot and immunohistochemistry（IHC） were conducted to analyze protein expressions. In vitro， the Cell Counting Kit-8， EdU， flow cytometry， wound healing， and Transwell assays were employed to measure glioma cells’ viability， proliferation， cycle， apoptosis， migration and invasion. An assay of dual-luciferase reporter was conducted to assess the influence of TMEM16A on NF-κB activation. NF-κB activation mechanism was ascertained by cycloheximide chase assay and coimmunoprecipitation（co-IP）. An intracranial mouse model was used to evaluate the effects of TMEM16A on glioma tumorgenesis in vivo. Results Compared with adjacent non-tumor tissues or normal human astrocytes（NHA）， TMEM16A were highly expressed in glioma tissues and cells. The expression level of TMEM16A increased with the grade of glioma. Compared to the Scrb shRNA group， knockdown of TMEM16A in U87MG and LN229 cells had a considerable inhibitory effect on viable， proliferative， migratory and invasive abilities and it can cause cell cycle arrest and apoptosis. Western Blot showed that compared with the Scrb shRNA group， the expression of p21， p27， Bax， cl-caspase-3， and E-cadherin was significantly increased and expression of cyclin D1， cyclin E1， CDK2， CDK4， Bcl-2， TWIST1， N-cadherin， Vimentin， Slug， MMP2， and MMP9 decreased. TMEM16A activated NF-κB signaling pathway by ubiquitination-mediated IκBα degradation in glioma cells. Compared to the Scrb shRNA group， knockdown of TMEM16A hindered glioma tumorgenesis in vivo. Conclusions The results provide strong evidence that TMEM16A/NF-κB axis drives glioma progression and provide the basis for the treatment of glioma.

Key words： glioma; TMEM16A; NF-κB

基金項目：2021年四川省醫學（青年創新）科研課題項目（Q21102）；四川省科技廳重點研發項目（2021YFG0316）

作者單位：637000 南充，南充市中心醫院神經外科（羅孝全，馮浩，孫謀，李承科）；成都醫學院第一附屬醫院神經外科（夏勛）

通信作者：李承科

腦膠質瘤是最常見的原發性腦腫瘤，其發病率、復發率和死亡率均較高^［1］，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）將其分為Ⅳ級^［2］。雖然膠質瘤治療的精準性和有效性均有很大提高^［3］，然而膠質母細胞瘤的中位生存期不到2年，壽命超過5年的患者不足5%^［4］，因此，探究膠質瘤可能的分子機制并確定新的治療靶標非常必要。跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A， TMEM16A）在多種惡性腫瘤中高表達，具有抵抗腫瘤細胞凋亡、促進免疫逃逸的功能^［5］。TMEM16A通過激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）促進膠質瘤的形成^［6］。NF-κB調節多種細胞學過程，廣泛參與癌癥進展^［7］。研究發現，IκBα的泛素化降解可活化NF-κB而促進膠質瘤的進展^［8］，TMEM16A具有泛素化調節作用^［9］。目前，TMEM16A是否能通過泛素化調節NF-κB信號通路分子而參與膠質瘤的形成尚不清楚，本研究旨在探討TMEM16A是否通過泛素化降解IκBα活化NF-κB進而促進膠質瘤的進展。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 收集72例來自南充市中心醫院膠質瘤患者手術切除的癌組織和癌旁對照組織，由兩位經驗豐富的病理專家進行WHO分級^［2］，其中Ⅰ級10例，Ⅱ級14例，Ⅲ級23例，Ⅳ級25例。另收集4例進行腦創傷組織切除術標本作為正常對照。所有患者術前均未進行放化療，且都已簽署知情同意書。本研究經南充市中心醫院醫學倫理委員會審查批準（審批號：2022023）。

1.2 細胞培養和轉染 A172、U87MG、U251、U118和LN229膠質瘤細胞系及正常人星形膠質細胞（normal human astrocytes，NHA;ATCC）在DMEM（Life Technologies）中培養，加入10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS;Life Technologies）和1%青霉素/鏈霉素（Life Technologies），在37 ℃和CO2條件下培養。

將靶向TMEM16A的短發卡RNA（shTMEM16A）及其對照（scramble shRNA，Scrb RNA;GenePharma）用Lipofectamine^TM 3000（Invitrogen）轉染U87MG和LN229細胞。shTMEM16A通過慢病毒感染獲得穩定敲低TMEM16A的細胞系。

1.3 實時熒光定量PCR（quantative real-time PCR，qRT-PCR） 總RNA用TRIzol（Invitrogen）提取并用First Strand Synthesis kit（TaKaRa）逆轉錄為cDNA。qPCR采用SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）試劑盒并用ABI Prism 7500系統（Applied Biosystems，CA，USA）擴增。2^-ΔΔCT法計算TMEM16A和IκBα的mRNA相對表達，GAPDH為內參。引物序列見表1。

1.4 Western Blot實驗 胞質蛋白和核蛋白分別用RIPA裂解液（碧云天）和核蛋白提取試劑盒（Millipore）提取。采用10% SDS-PAGE分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜（Millipore）上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，抗TMEM16A、p27、p21、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、Bcl-2、Bax、cleaved（cl）-caspase-3、caspase-3、phosphorylation（p）-IKKα、IKKα、p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Slug、TWIST、MMP2、MMP9、GAPDH（Abcam）和Lamin B（Cell Signaling Technology）一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。增強型化學發光工作液（Bio-Rad Laboratories）檢測免疫信號。

1.5 組織染色 蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色：小鼠腫瘤組織浸泡在10%福爾馬林中，石蠟包埋，進行連續切片。切片經二甲苯脫蠟后，濃度梯度酒精復水，HE染色液（碧云天）染色。免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）染色：切片經脫蠟復水后，加入抗原修復液及3% H2O2，分別孵育15 min，抗TMEM16A、p65、Ki-67和E-cadherin一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。DAB（邁新）染色3 min，蘇木精襯染細胞核，濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，光學顯微鏡（Olympus）拍照。

1.6 CCK8實驗 處理后的U87MG和LN229細胞在96孔板（5×10³/孔）中培養24 h。孵育24、48、72、96 h后，10 μL CCK-8（碧云天）處理2 h，酶標儀（BioTek Instrument）在450 nm處檢測吸光值。

1.7 EdU實驗 處理后的U87MG和LN229細胞在6孔板中培養，加入200 μL EdU（銳博）37 ℃處理2 h，細胞固定后，0.4% Triton X-100通透10 min。加入Apollo試劑和Hoechst各孵育30 min。熒光顯微鏡（Olympus）拍照，計算EdU陽性細胞率。

1.8 細胞周期實驗 細胞周期分析使用CycleTEST PLUS DNA檢測試劑盒（BD Biosciences）。收集不同處理組U87MG和LN229細胞制成單細胞懸液，加入碘化丙錠（propidium iodide，PI），FACSCalibur流式細胞儀（BD Biosciences）分析細胞周期分布。

1.9 細胞凋亡實驗 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（BD Biosciences）檢測細胞凋亡。收集不同處理組U87MG和LN229細胞，加入Annexin V結合緩沖液懸浮細胞，Annexin V-FITC和PI分別避光孵育15 min。FACScan流式細胞儀（BD Biosciences）測定細胞凋亡。

1.10 劃痕試驗 不同處理組U87MG和LN229細胞接種到6孔板，至80%～90%融合時用無菌200 μL移液槍尖刮除，PBS洗滌兩次。加入含1% FBS的DMEM，倒置顯微鏡（Olympus）觀察并在0 h和24 h拍照，評估細胞遷移率。

1.11 細胞遷移和侵襲實驗 Transwell小室（Millipore）檢測U87MG和LN229細胞遷移和侵襲能力。將Matrigel（30 μL;BD Biosciences）加入上室，凝固后，加入無血清DMEM重懸的細胞，下室中加入完全培養基。48 h后，10%福爾馬林固定細胞，結晶紫染色，熒光顯微鏡（Olympus）計數穿膜細胞數。除Transwell小室不包被Matrigel外，其余步驟同侵襲實驗。

1.12 雙熒光素酶報告基因系統實驗 含NF-κB啟動子的firefly-luciferase和Renilla reporter constructs（各100 ng;Promega）與Scrb shRNA/shRNA1或Vector/TMEM12A共轉染U87MG和LN229細胞。24 h后，雙熒光素酶報告基因試劑盒（Promega）檢測熒光素酶活性。不含啟動子的firefly-luciferase作陰性對照（negative control，NC）。

1.13 放線菌酮（cycloheximide，CHX）追逐實驗用Scrb shRNA/shRNA1或Vector/TMEM16A轉染細胞。48 h后，加入CHX （25 μg/mL），分別孵育0、8、16、24 h或0、4、8、12 h。制備細胞裂解液，Western Blot檢測蛋白表達。

1.14 免疫共沉淀實驗 細胞中加入IP裂解緩沖液（Thermo Fisher Scientific）和1%蛋白酶抑制劑混合物（Sigma-Aldrich）進行裂解。200 μg總裂解物（1 μg/μL）分別加入一抗（TMEM16A和IκBα）或IgG（4 μL）在4 ℃輕搖孵育過夜，Protein A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific）孵育2 h。免疫沉淀復合物進行Western Blot分析。

1.15 顱內小鼠腦膠質瘤模型 4周齡體質量約25 g的裸鼠（斯萊克實驗動物有限公司）在屏障環境中飼養，給予自由飲食和飲水。實驗按《實驗動物使用和管理指南》操作進行，并經南充市中心醫院醫學倫理委員會批準。用立體定向裝置（KDS310，KD Scientific）將Lenti-sh-RNA1或Lenti-Scrb shRNA感染的U87MG熒光素酶細胞（3×10⁵）植入裸鼠大腦。在第7、14、21和28天采用IVIS Lumina Ⅲ小動物活體成像系統（PerkinElmer）檢測腫瘤生長。28 d后麻醉處死裸鼠，分離腫瘤，制作石蠟切片，進行HE和IHC染色。

1.16 統計學分析 所有數據均來自3次重復實驗并用均數±標準差（x-±s）表示。兩組間比較采用雙尾t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析并采用Tukey檢驗進行多重比較。Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗。采用GraphPad Prism version 7.00進行結果分析。以Plt;0.05認為有統計學差異。

2 結 果

2.1 TMEM16A在膠質瘤組織中高表達 與癌旁對照組相比，TMEM16A mRNA和蛋白在膠質瘤組織中的表達明顯升高（圖1A和1C），且與膠質瘤分級正相關（圖1B和1D）。以上結果表明，TMEM16A的表達在膠質瘤中顯著升高，且與病理分級相關。

2.2 敲低TMEM16A抑制膠質瘤細胞增殖并誘導細胞周期停滯和凋亡 膠質瘤細胞中TMEM16A的mRNA和蛋白表達顯著高于NHA細胞，U87MG和LN229細胞中TMEM16A含量最高（圖2A、2B），用做后續實驗。三個靶向TMEM16A的shRNA均顯示了有效沉默，且shRNA1沉默效率最高（圖2C），用于后續實驗。與Scrb RNA組相比，下調TMEM16A顯著降低細胞活力（圖2D）和增殖（圖2E、2F）；增加G0/G1期細胞比例，減少S期比例（圖2G、2H）；增加凋亡細胞率（圖2I、2J）。shRNA1轉染后p21、p27、Bax和cl-caspase-3表達顯著增加，cyclin D1、cyclin E1、CDK2、CDK4和Bcl-2表達降低（圖2K）。這些結果表明，敲低TMEM16A抑制膠質瘤細胞增殖和周期進程并導致凋亡。

2.3 敲低TMEM16A減少膠質瘤細胞遷移和侵襲與對照組相比，敲低TMEM16A抑制U87MG和LN229細胞遷移（圖3A、3B）；并減少遷移（圖3C、3D）和侵襲（圖3E、3F）細胞數；降低TWIST1、Slug、N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白水平，而增加E-cadherin的表達（圖3G）。這些結果表明，沉默TMEM16A抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲。

2.4 TMEM16A活化膠質瘤細胞中NF-κB信號通路與Scrb RNA組相比，shRNA1轉染的U87MG和LN229細胞中熒光素酶活性顯著降低（圖4A）；與Vector組相比，TMEM16A過表達則增加熒光素酶活性（圖4B）。敲低/過表達TMEM16A導致p-IKKα、p-IκBα和p-p65水平降低/升高，IκBα蛋白升高/降低，IKKα和p65蛋白（圖4C）及IκBα mRNA表達不變（圖4D）。與Scrb shRNA組相比，TMEM16A敲低后IκBα半衰期延長約6 h；與Vector組相比，TMEM16A過表達后IκBα半衰期縮短約4 h（圖4E、4F）。TMEM16A敲低的細胞中IκBα的泛素化水平明顯低于Scrb shRNA組，而TMEM16A過表達的細胞中IκBα的泛素化水平顯著高于Vector組（圖4G）。這些數據表明，TMEM16A可能通過泛素化降解IκBα活化膠質瘤細胞中NF-κB信號通路。

2.5 敲低TMEM16A抑制體內膠質瘤的形成 與對照組相比，接種U87MG-shTMEM16A的動物體內腫瘤明顯較小（圖5A、5B），小鼠存活率增加（圖5C），腫瘤質量減小（圖5D）。與Scrb shRNA組相比，shTMEM16A組腫瘤惡性程度更低（圖5E），腫瘤組織中TMEM16A、p65和Ki-67表達顯著降低，E-cadherin表達增加（圖5F）。上述結果表明，TMEM16A下調可抑制體內膠質瘤的形成。

3 討 論

TMEM16在多種腫瘤中高表達且與惡性程度相關^［10］，可作為頭頸部腫瘤的治療靶點^［11］。TMEM16A過表達可作為結直腸癌患者預后不良的標志物^［12］。活化TMEM16A促進乳腺癌肺轉移^［13］。TMEM16A與mTOR通路互作影響肌動蛋白及膽管癌細胞存活、增殖和遷移^［14］。TMEM16A可激活口腔鱗狀細胞癌中Cdc42-NWASP信號通路引起細胞侵襲和轉移^［15］。TMEM16A在上皮性卵巢癌組織和細胞中高表達，抑制TMEM16A通過失活PI3K/Akt信號通路減少卵巢癌細胞增殖和侵襲^［16］。靶向TMEM16A抑制前列腺癌細胞增殖^［17］。研究發現，TMEM16A有助于膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲^［6］。本研究顯示，膠質瘤組織中TMEM16A表達升高，且與病理分級正相關，表明TMEM16A在膠質瘤中具有促癌作用。敲低TMEM16A可減少膠質瘤細胞增殖，阻滯細胞周期進程并誘導凋亡；上調p21、p27、Bax、cl-caspase-3的表達，下調cyclin D1、cyclin E1、CDK2、CDK和Bcl-2的水平，提示TMEM16A促進膠質瘤細胞增殖并抑制凋亡。上皮間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和細胞外基質降解是膠質瘤轉移的關鍵事件^［18-19］。本研究結果顯示，敲低TMEM16A抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲，減少TWIST1、Slug、N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的表達，而提高E-cadherin表達。由此可見，TMEM16A有助于EMT進程及細胞外基質降解而促進膠質瘤細胞遷移和侵襲，敲低TMEM16A可在體阻礙膠質瘤的形成。

據報道，NF-κB通路調控膠質瘤的形成^［20］。激活NF-κB可調節增殖、遷移、侵襲、免疫逃逸和化療抵抗等途徑促進腫瘤進展^［21］。它可上調cyclins、CDKs和Bcl-2的表達，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡^［22-23］；上調TWIST1、SNAIL等轉錄因子的表達，促進EMT^［24］；誘導細胞黏附分子和MMPs的表達，促進癌細胞轉移^［25］。在經典NF-κB通路中，正常條件下，p65與IκBα在細胞質中結合。細胞受到刺激后，IκBα被IKK磷酸化，然后通過泛素化被蛋白酶體降解。p65被釋放，快速進入細胞核并激活基因轉錄，這一過程的失調與許多疾病的發生有關^［26］。因此，調控IκBα-p65相互作用是控制NF-κB信號通路的關鍵步驟，抑制這一途徑是治療腫瘤的一種有效策略。研究證明，宮頸癌細胞中細胞內氯離子通道可正向調節NF-κB的活性^［27］。在A549和MCF-7細胞中，氯離子通道CLC-3通過激活NF-κB信號通路介導多藥耐藥^［28］。沉默CLC-3可抑制p65的核易位，降低NF-κB的轉錄活性，減少MMP-3和MMP-9的表達，從而抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲^［29］。TMEM16A通過活化NF-κB驅動膠質瘤的進展^［6］。然而，TMEM16A活化NF-κB的機制尚不清楚。本研究發現，敲低/過表達TMEM16A后，NF-κB熒光素酶活性降低/升高，IKKα、IκBα和p65的磷酸化水平降低/增加，提示NF-κB活性升高與TMEM16A過表達有關。TMEM16A敲低后IκBα半衰期延長，過表達TMEM16A則減少IκBα半衰期。敲低TMEM16A減少IκBα泛素化，過表達TMEM16A則增加IκBα泛素化。上述結果證實，TMEM16A可泛素化降解IκBα而活化NF-κB，進而驅動膠質瘤的形成。

綜上所述，本研究表明，TMEM16A在膠質瘤中高表達，且與腫瘤分級正相關。TMEM16A通過泛素化降解IκBα而激活NF-κB通路，促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。TMEM16A/NF-κB通路可能是膠質瘤治療的一個靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：羅孝全負責論文選題、實驗設計、分析數據、修改文稿；馮浩負責實施研究、采集數據、統計分析、起草文稿；孫謀負責實施研究、采集數據、統計分析；李承科負責實驗設計、研究項目管理、文稿審閱及修訂。

［參 考 文 獻］

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（收稿2024-07-05 修回2024-07-26）