超臨界CO2流體技術制備脫細胞外基質材料及其生物醫學應用

摘要： 脫細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）材料在組織工程和再生醫學中具有重要應用，超臨界CO2流體（supercritical CO2 fluid， SCF-CO2）技術已被證明可用于dECM材料的制備。文中綜述了SCF-CO2的基本原理、SCF-CO2脫細胞及其滅菌機制，介紹了輔助溶劑的使用與預處理技術對SCF-CO2脫細胞的影響，以及dECM材料的生物醫學應用。結果表明：與常規方法相比，具有高滲透性、高擴散性的SCF-CO2能更有效地保持細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的結構完整性和生物活性，同時展現出高效滅菌的優勢，且制備的dECM材料在組織修復和再生醫學領域具有顯著應用潛力。

關鍵詞： 超臨界CO2流體；脫細胞外基質；超臨界滅菌；組織工程

中圖分類號： R 318文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0551-08

Supercritical CO2 Fluid Technology-Assisted Fabrication of Decellularized Extracellular Matrix Materials and Biomedical Applications

Abstract： Decellularized extracellular matrix （dECM） materials play a significant role in tissue engineering and regenerative medicine. Supercritical CO2 fluid （SCF-CO2） technology has been proven to be applicable in the preparation of dECM materials. By reviewing relevant literature in recent years， this paper summarizes the basic principles of SCF-CO2， the mechanisms of decellularization and sterilization by SCF-CO2， and discusses the impact of auxiliary solvents and pretreatment techniques on SCF-CO2-assisted decellularization， as well as the biomedical applications of dECM materials. The results show that， compared with conventional methods， SCF-CO2 with high permeability and high diffusivity could maintain the structural integrity and biological activity of extracellular matrix （ECM） more effectively and show the advantage of high sterilization efficiency. Moreover， the prepared dECM materials have significant potential for application in the field of tissue repair and regenerative medicine.

Keywords： supercritical carbon dioxidefluid； decellularized extracellular matrix； supercritical sterilization； tissue engineering

生物材料在組織工程與再生醫學領域發揮著重要作用，具有巨大的臨床應用前景。隨著生物醫學工程技術的快速發展，脫細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）材料因其獨特的生物相容性、低免疫原性和生物活性，在再生醫學、組織工程和藥物遞送等領域展現出巨大的應用潛力。dECM材料通過去除具有免疫原性的細胞成分、同時保留天然細胞外基質（extracellular matrix， ECM）成分和結構以兼具生物相容性和生物活性。然而，傳統的脫細胞方法，如使用極性洗滌劑或強酸強堿溶液，可能會導致多糖的損失和蛋白質結構的改變；使用生物酶會因濃度過高或作用時間過長破壞生物活性物質且成本高昂。超臨界CO2流體（supercritical CO2 fluid， SCF-CO2）技術利用CO2在超臨界狀態下的高滲透性、高擴散性和對極性組分（如蛋白質和多糖）的低反應性，有效地防止了在組織提取過程中生物分子的變性，從而最大限度地保留了ECM的天然成分和結構，因此成為一種可能的脫細胞方法 ［1］。此外，溫和、綠色的SCF-CO2在dECM材料的滅菌中也展現出了獨特的優勢。本文綜述了SCF-CO2的基本原理、SCF-CO2脫細胞及其滅菌機制，介紹了輔助溶劑的使用與預處理技術對SCF-CO2脫細胞的影響，以及dECM材料的生物醫學應用。

1 SCF-CO2概述

超臨界流體技術是一種利用物質在超臨界狀態下的特殊性質進行材料加工和化學合成的技術。當一種特定物質的溫度和壓力達到其臨界點之上時，如果對該氣體狀態的物質施加壓力，它不會轉變為液態，只是密度會增加，展現出類似液體的特性，同時仍然保持氣體的一些性質，這種介于兩者之間的一種特殊流體狀態被稱為超臨界流體狀態 ［2］。超臨界流體技術可以使用多種不同的流體作為溶劑，如水、甲醇、乙醇、丙烷和二氧化碳等，每種流體都有其獨特的物理和化學性質，適用于不同的應用。其中，二氧化碳是最常用的超臨界流體，因為它達到超臨界狀態的條件相對溫和（臨界溫度約為31.3 ℃，臨界壓力約為7.38 MPa），且對環境友好，具有較低的粘度、較高的擴散性以及很好的溶解能力。

SCF-CO2因其獨特的物理和化學特性，在材料加工領域有著廣泛的應用，主要包括SCF-CO2萃取、SCF-CO2造粒、SCF-CO2發泡三個方面。SCF-CO2萃取技術是一種利用SCF-CO2為萃取劑，從液體或固體中萃取出特定成分的技術 ［3］。SCF-CO2萃取在接近室溫的條件下操作，可以最大限度地保留食品的原有風味和營養成分，因此被廣泛應用于在食品工業提取香料、油脂和色素等成分 ［4］。在醫藥與化妝品工業中，SCF-CO2萃取技術被用于提取藥物有效成分，可以保證產品的純天然性和無化學污染。SCF-CO2造粒技術是將溶質溶解于超臨界流體中，通過特制的噴嘴進行快速降壓膨脹，使溶質瞬間形成大量的晶核并生長成微粒，從而制備出粒度均勻、分布狹窄的超細微粒 ［5］，廣泛應用于材料科學和生物醫藥領域制備高性能超細微粒材料和藥物微納米顆粒。SCF-CO2發泡技術利用超臨界流體的溶解和膨脹性質，在材料內部形成均勻分布的氣泡結構，以制備出輕質、高強度的發泡材料 ［6］，適宜于建筑材料和汽車工業領域制備輕質、隔熱、隔音的發泡板材，輕量化、高性能的發泡零部件等，以及在生物醫藥領域制備具有良好生物相容性的多孔支架，可用于組織工程和再生醫學 ［7］。

近年來，在生物醫學領域，SCF-CO2因其低粘度和高擴散性被廣泛地用于dECM材料的制備，可以有效去除具有免疫原性的細胞成分并最大限度保留其生物活性成分。與傳統的化學洗滌劑相比，SCF-CO2的使用能夠減少對ECM成分的損害，并且有效避免因洗滌劑殘留引起的細胞毒性。此外，SCF-CO2也因其獨特的物理和化學性質，在dECM材料的滅菌中也展現出了顯著優勢 ［8］。

2 SCF-CO2在dECM材料中的應用

SCF-CO2制備dECM材料及其生物醫學應用，如圖1所示。

2.1 SCF-CO2用于脫細胞

dECM作為一種新興的生物材料，近年來在組織工程和再生醫學領域受到了廣泛關注。dECM是通過去除組織或器官中的細胞成分，保留其ECM的結構和成分得到的。dECM材料的來源廣泛，包括皮膚、心臟、血管、骨骼、軟骨等多種組織和器官。這些組織和器官經過脫細胞處理后，可得到富含膠原蛋白、糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）、生長因子等生物活性物質的dECM ［9］，對于細胞的增殖、遷移、黏附和分化具有重要影響，為組織工程和再生醫學提供了理想的生物材料。傳統上，動物組織的脫細胞過程涉及物理、化學和生物方法的多種組合，如使用酸堿溶劑、洗滌劑、生物酶處理或通過反復凍融來實現 ［10］。然而，在這些脫細胞方法中，為防止因化學試劑引起ECM成分的損失降解是一個挑戰。ECM中的一些關鍵物質，例如糖蛋白和生長因子，對于組織再生至關重要，但它們可能會因洗滌劑的表面活性作用而變性或被移除。SCF-CO2作為一種溫和的處理方法，可以在較低的溫度和壓力下有效地去除細胞成分，同時避免對ECM結構的破壞。如圖2所示，SCF-CO2滲透擴散至原始組織細胞內，將細胞脹大破裂使細胞內容物流出，留下ECM成分與結構。

基于SCF-CO2制備的dECM材料具有優異的生物相容性、低免疫原性和生物活性，在組織工程、再生醫學和藥物遞送等領域具有廣泛的應用前景 ［11］。CO2分子是非極性的，但在超臨界狀態下，其溶劑特性可以發生變化，如SCF-CO2能夠溶解一些通常難溶于非極性溶劑的極性物質 ［12］。SCF-CO2通過滲透進入組織，利用其溶解能力將細胞內的部分成分溶解，從而實現細胞內容物的去除。此外，SCF-CO2可以增加細胞膜的流動性，加速細胞膜破裂，釋放細胞內容物，進一步促進脫細胞過程。由于不涉及化學試劑的使用，SCF-CO2脫細胞在去除DNA的同時可以較大程度地保留ECM，相較于傳統的脫細胞方法展現出了明顯的優勢。SCF-CO2脫細胞技術是一種綠色高效的脫細胞方法，然而，SCF-CO2本身可能不足以完全去除組織中的所有細胞成分，特別是當組織結構復雜或細胞間連接緊密時 ［13］。因此，研究通過引入輔助溶劑和優化預處理步驟等方法，可以進一步提升SCF-CO2脫細胞的效率。

2008年，Sawada等 ［14］首次嘗試使用SCF-CO2進行豬主動脈的脫細胞。但是單獨使用SCF-CO2不能完全去除細胞核，而添加乙醇作為輔助溶劑后可以成功地從主動脈徹底去除細胞核。輔助溶劑的作用機制是通過與SCF-CO2混合，降低其表面張力，增加其溶解極性分子的能力。這些溶劑可以是極性小分子、表面活性劑或酶，它們能夠與細胞膜相互作用，削弱細胞間的連接，從而促進細胞的分離和去除。例如，表面活性劑可以降低細胞膜的穩定性，使得SCF-CO2更容易滲透進入細胞并去除細胞成分。在一項軟骨組織的脫細胞研究中 ［15］，以乙醇為助溶劑使用SCF-CO2進行脫細胞處理，不僅成功去除了DNA，而且在dECM中培養的軟骨細胞，其COL-Ⅱ和聚集蛋白的基因表達水平有所增加，表明細胞在培養過程中保持了較高的活性。此外，將上述軟骨dECM材料應用于軟骨缺損的體內實驗，觀察到植入的dECM材料與周圍的天然組織實現了良好的整合。在Anton團隊的研究中，通過使用親CO2洗滌劑（Ls-54）與SCF-CO2共溶劑成功進行了軟骨、肌腱和皮膚的脫細胞 ［16］。

另外，使用輔助溶劑的另一個重要考慮是它們的生物相容性和環境影響。理想的輔助溶劑應該具有良好的生物相容性，不會對后續的細胞培養或組織工程應用產生負面影響。此外，考慮到成本和環境可持續性，輔助溶劑的回收和再利用也是重要的考量因素。盡管使用輔助溶劑可以顯著提高SCF-CO2脫細胞的效率，但仍存在一些問題和限制，如當組織結構致密時，即使使用輔助溶劑也需要較長的處理時間，且某些輔助溶劑可能難以從最終產品中完全去除。因此，研究人員需要不斷探索優化脫細胞過程，以實現更高效、經濟的脫細胞技術。

為了使SCF-CO2和輔助溶劑能夠更好地通過滲透和溶解作用將細胞成分從ECM中分離出來，選擇合適的預處理方法是關鍵的一步 ［13］。預處理的目的是使組織更易于SCF-CO2處理，從而提高脫細胞效率并減少對ECM成分的損害。常見的預處理方法主要包括物理處理和化學處理兩種方式。物理預處理技術包括凍融循環、機械攪拌或壓力處理。凍融循環通過冷凍和融化的過程破壞細胞膜，釋放細胞內容物，為SCF-CO2的滲透創造通道；機械攪拌通過物理方式促進SCF-CO2與組織接觸，加速細胞成分的去除；壓力處理通過改變細胞的結構完整性，幫助SCF-CO2更深入地滲透到組織內部。化學預處理通常涉及使用低濃度的表面活性劑或酶，低濃度的非離子表面活性劑（如Triton X-100）可以輕微破壞細胞膜，有助于SCF-CO2的滲透和細胞內容物的去除；特定的酶，如膠原酶或透明質酸酶，可以特異性地分解ECM中的某些成分，促進細胞內容物的分離和去除。要注意的是，酶處理需要精確控制用量，以避免過度破壞ECM。

聯合預處理方法結合了物理和化學處理的優勢，通過相互補充提高脫細胞效率，同時減少對ECM的損害。例如，可以先使用凍融循環或機械攪拌破壞細胞結構，再使用低濃度的化學試劑進一步促進細胞的去除。預處理條件的優化同樣重要，需要根據具體的組織類型和所需的ECM特性進行調整。這包括確定最佳的凍融循環次數，機械攪拌的強度、時間和壓力處理的參數，以及化學試劑的濃度和處理時間等。SCF-CO2應用于脫細胞的研究結果，如表1所示。

2.2 SCF-CO2用于滅菌

對于dECM材料的臨床轉化和實施，除了成功制備以外，還必須包括有效的滅菌方法。在材料植入體內之前，最關鍵的步驟是確保其經過徹底的滅菌處理，以避免因植入物引起的感染和免疫反應，從而提高植入的成功率及安全性。選擇滅菌技術必須綜合考慮脫細胞組織移植物的大小、復雜性，以及對結構完整性和ECM的影響。常用的滅菌技術包括γ輻照、電子輻照及環氧乙烷（ETO）處理。γ輻照是一種冷過程，使用放射性同位素鈷60作為輻射源，可以在無需額外處理的情況下對濕物料進行滅菌，適合于熱敏感的生物材料。然而，輻照過程可能會對ECM的膠原蛋白網絡造成一定程度的損害 ［23］。電子輻照也是一種冷殺菌工藝，使用電子加速器作為輻射源，與伽馬輻照相似，能夠有效破壞微生物DNA，但同樣也可能對ECM造成損傷。ETO是一種烷基化劑，將材料暴露于ETO氣體中能夠通過破壞DNA來阻止微生物的復制，但由于其在材料中的滲透性有限，僅能作用于材料表面，可能需要額外的步驟以確保完全滅菌 ［24］。

1951年，Fraser首次報告SCF-CO2作為一種滅菌方法 ［25］。在后來研究中，SCF-CO2殺菌作用被大量的文獻證明，并廣泛應用于食品、醫療等領域中。SCF-CO2是一種具有化學惰性、易獲得、溶解能力高、粘度低以及高擴散系數等物理化學性質的物質，能夠不受多孔隙及結構較復雜材料的影響，穿透材料后可作用在病原微生物上，對細菌、酵母菌、霉菌、病毒等微生物具有很好的殺滅能力 ［26］。

多年來，一些研究人員一直致力于了解SCF-CO2滅菌作用背后的機制。根據Garcia-Gonzalez等 ［27］的假設，SCF-CO2滅菌涉及H2CO3的形成和解離，擴散進細胞膜內后會增加膜的流動性與通透性；同時，也會使細胞內的pH值降低，導致關鍵酶的失活、細胞代謝受抑制，最終導致細胞平衡紊亂、細胞成分流失，實現滅菌效果。SCF-CO2滅菌過程，如圖3所示

因此，SCF-CO2為脫細胞外基質材料的滅菌提供了一種非熱、非化學的方法。但在大部分情況下，SCF-CO2本身不足以使全部的病原體滅活，所以SCF-CO2可以與抗菌劑、氧化劑等輔助劑結合使用，進一步提高滅菌效果和效率 ［28］。有研究顯示，添加低劑量過氧乙酸的SCF-CO2處理可有效滅活細菌，同時保持生物力學性能，這創造了在一個步驟過程中整合脫細胞和滅菌的可能性，從而提高了效率。

de Wit等 ［8］采取三種方法對使用SCF-CO2制備的豬氣管脫細胞支架材料進行滅菌，分別是NaOH清洗后γ射線照射滅菌、僅有γ射線照射滅菌，以及SCF-CO2配合低劑量過氧乙酸滅菌。研究結果顯示，與γ射線滅菌相比，用SCF-CO2滅菌后支架材料的功能結果更接近于原始氣管。在Ryan等 ［29］的研究中比較了SCF-CO2、電解水、γ射線、乙醇-過氧乙酸和過氧化氫方法對脫細胞豬心臟主動脈瓣無菌性和機械完整性的影響。通過組織學、微生物培養和電子顯微鏡分析，發現乙醇-過乙酸和SCF-CO2處理的瓣膜是無菌的，而且SCF-CO2處理的瓣膜尖端拉伸性能高于其他技術處理的瓣膜，且在用SCF-CO2滅菌處理的脫細胞瓣膜中發現了優異的無菌性和完整性。綜上所述，SCF-CO2為dECM材料提供了一種理想的滅菌方法。

3 dECM材料的生物醫學應用

3.1 3D打印

在3D生物打印領域，dECM溶液可以通過改變溫度和離子濃度形成固態作為生物墨水，為細胞生長、遷移和分化提供理想的支持環境，為構建具有生物活性的組織或器官提供了可能 ［30］。通過將dECM與其他生物材料或細胞結合，可以打印出與原生組織相似的結構，為組織工程和再生醫學提供了新的解決方案。Daniel等 ［31］的工作中突出了基于SCF-CO2來提取由不同細胞類型（人真皮成纖維細胞、脂肪干細胞）組成的細胞片的ECM成分，用于制備dECM生物墨水的優勢，并開拓了dECM生物墨水在打印組織樣結構開發中的前景。

3.2 水凝膠

dECM水凝膠的形成是一種基于膠原蛋白的自組裝過程，同時受到其他的蛋白成分、GAGs以及蛋白多糖的影響。dECM干燥粉末經胃蛋白酶消化后，通過調節pH值、鹽離子濃度與溫度以誘導形成凝膠。dECM水凝膠結合了dECM的生物活性和水凝膠的吸水性，具有模擬生理基質環境，促進細胞粘附、浸潤和增殖的能力 ［32］。在皮膚創面修復、軟骨再生等領域，dECM水凝膠能夠作為傷口敷料或細胞載體，加速組織的修復和再生，從而促進細胞的增殖和分化。Seo等 ［1］開發了一種使用SCF-CO2-乙醇共溶劑系統代替洗滌劑處理方法的心臟組織脫細胞方法，所制備的心臟dECM水凝膠有效促進了血管生成。

3.3 組織工程支架

dECM材料還可作為組織工程支架，能夠支持細胞的粘附和增殖，為細胞的生長和組織的形成提供模板 ［33］。在骨缺損修復、神經修復再生等領域中，dECM生物支架已被廣泛應用。超臨界脫細胞過程可以能夠保持動物組織原有的三維結構，有效去除組織內的抗原性細胞和遺傳物質。因此，采用SCF-CO2進行脫細胞的多種組織已被廣泛應用于組織工程支架，以促進受損部位的修復再生。

Wang等 ［34］報道了一種用SCF-CO2技術從豬皮中制備脫細胞真皮基質的方法，實驗結果顯示4 cm×3 cm的全層創面經dECM處理后，創面缺損未出現組織學類型的異常纖維化或細胞團簇。有研究表示，SCF-CO2處理后的脫細胞組織也可用于角膜移植實驗。即使在豬與兔的異種移植實驗中，移植的SCF-CO2脫細胞組織也沒有表現出任何細胞毒性或炎癥反應。經過板層角膜移植術，將眼睛的基質部位移除并用植入物代替，觀察到脫細胞組織和原生眼組織完全融合，脫細胞組織被角質形成細胞浸潤，未觀察到免疫細胞識別和分化 ［35］。此外，使用SCF-CO2對神經組織進行脫細胞，能更有效地保留神經組織中的ECM成分，植入后能夠為軸突提供物理引導和化學信號，促進受損神經的再生和修復。Kim等 ［21］的研究表明，基于SCF-CO2的方法比傳統的化學脫細胞能夠更好地保存ECM成分和機械性能，以及更好地促進細胞反應。

4 結論與展望

綜上所述，SCF-CO2因其獨特的物理和化學性質，如高滲透性、高擴散性以及綠色高效等特點，在dECM材料的制備過程中發揮了至關重要的作用。深入了解SCF-CO2脫細胞和滅菌原理，不僅能夠更好地掌握其在dECM材料制備中的核心作用機制，還有助于進一步優化SCF-CO2的應用工藝，這對于對提高dECM材料的制備效率、降低生產成本，以及促進dECM材料的產品開發、臨床應用與產業化具有重要意義。

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