產靈菌紅素沙雷氏菌R18的鑒定及基因組特性

摘要：采用形態學、生理生化和分子生物學方法對菌株R18進行菌種鑒定。通過基因組測序和生物信息學比較，進一步分析其分類地位和生物學特性，并在基因組水平上探討該菌株紅色素的合成基因簇和代謝路徑。結果表明：菌株R18最佳生長條件為溫度30～37 ℃，pH值6～8，NaCl質量濃度0～10 g·L-1；菌株R18與粘質沙雷氏菌模式菌株ATCC 13880的16S rDNA相似度為99.86%，基因組平均核苷酸均一性和數字DNA-DNA雜交值分別為98.73%，89.5%，均高于物種界定閾值，屬于同一個物種；菌株R18靈菌紅素合成基因簇全長35 021 bp，包含29個基因，其中，4個核心合成基因、10個補充的合成基因、1個調控基因、1個轉運基因及13個其他基因，具有完整的靈菌紅素合成代謝途徑。

關鍵詞： 粘質沙雷氏菌； 靈菌紅素； 菌種鑒定； 基因組特性

中圖分類號： Q 939.1文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0626-10

Identification and Genomic Characterization of Prodigiosin-Producing Serratia sp. R18

Abstract： Strain R18 was identified using morphological， physiological， biochemical and molecular biological methods. Its taxonomic status and biological properties were further analyzed by comparing genome sequencing and bioinformatics， and the synthetic gene cluster and metabolic pathway of the red pigment in this strain were explored at the genomic level. The results showed that the optimal growth conditions for strain R18 were temperature of 30-37 ℃， pH value of 6-8， and the mass concentration of NaCl of 0-10 g·L-1. Strain R18 shared a 16S rDNA similarity of 99.86% to Serratia marcescens type strain ATCC 13880， the genome average nucleotide identity value and the digital DNA-DNA hybridization value were 98.73% and 89.5%， respectively， both of which were higher than the species identification threshold and belong to the same specie. Strain R18 prodigiosin synthetic gene cluster had a total length of 35 021 bp and contained 29 genes including 4 core synthetic genes， 10 complementary synthetic genes， 1 regulatory gene， 1 transporter gene and 13 other genes， it had a complete prodigiosin synthesis metabolic pathway.

Keywords：Serratia marcescens； prodigiosin； bacterial identification； genomic characterization

沙雷氏菌屬于細菌界、變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科，該屬包含粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）、嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）、嗜昆蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila）和泉居沙雷氏菌（Serratia fonticola）等23個物種（https：∥lpsn.dsmz.de/genus/serratia），其中，粘質沙雷氏菌是模式種，包含產靈菌紅素的A1，A2/A6生物型和不產靈菌紅素的A3，A4，A5/A8及TCT等生物型。A3和A4生物型無處不在，A5/A8及TCT生物型主要來源于醫院病人臨床樣品，A1，A2/A6生物型主要分布于自然環境中［1］。粘質沙雷氏菌也是一類生防菌，可生產多種具抗生性代謝產物，如靈菌紅素、脂肽、碳青霉烯、細菌素等，具有抗菌、殺蟲、殺藻、抗瘧疾、抗腫瘤、免疫抑制、促進植物生長等作用［2-5］。產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌菌落呈紅色、酒紅色或粉紅色，無明顯擴散性，菌種資源容易從普通環境樣品中獲取，生物安全性較高，因此，近年來其成為高校“細菌畫”創作中使用頻率最高的菌種之一，第7屆全國微生物培養皿藝術大賽153幅作品中，有62幅作品將粘質沙雷氏菌作為“紅色顏料”進行作品創作，深受廣大師生好評［6］。

在籌辦華僑大學微生物培養皿藝術比賽時，從健康人體皮膚表面分離到一株產紅色素菌株R18，其菌落顏色鮮紅靚麗，是“細菌畫”創作的絕佳“顏料”。為了更安全且有針對性地將該菌株應用于微生物學實驗教學和學生科創活動中，本文采用形態學、生理生化和分子生物學方法對菌株R18進行菌種鑒定，通過基因組測序和生物信息學分析，進一步分析其分類地位和生物學特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 沙雷氏菌株R18來源于健康人類皮膚表面，保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中心，保藏號為MCCC 1K08643，生物危害等級為4類。

1.1.2 主要儀器和試劑 Multiskan FC型酶標儀（美國ThermoFisher公司）；Centrifuge5417R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；1-14型高速離心機（德國Sigma公司）；GE9612T-S型基因擴增儀（浙江省杭州市柏恒科技有限公司）；DT 93-3型微量振蕩器（江蘇省大唐醫療器械有限公司）。胰蛋白胨（英國OXOID公司）；酵母提取物（英國OXOID公司）；2×premix Taq（日本TaKaRa公司）；λ-Hind Ⅲ digest DNA marker（日本TaKaRa公司）；DL2000 DNA marker（日本TaKaRa公司）；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（北京市百泰克生物技術有限公司）；其他試劑為國產分析純。

1.1.3 培養基 1） LB培養基：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g，dH2O 100 mL，pH值為7.2～7.8；2） 牛奶瓊脂平板：蛋白胨0.1 g，酵母提取物0.02 g，NaCl 1 g，瓊脂2 g，市售脫脂牛奶50 mL，dH2O 50 mL；3） 淀粉/吐溫80瓊脂平板：蛋白胨0.1 g，酵母提取物0.02 g，NaCl 1 g，瓊脂2 g，淀粉/吐溫80 0.2 g，dH2O 100 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》［7］進行菌落形態、菌體形態、生長溫度范圍等生理生化特征測定。使用細菌16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）［8］進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，PCR產物使用10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并委托擎科科技有限公司進行DNA序列測定。所得序列校正后，在EzBioCloud數據庫（http：∥eztaxon-e.ezbiocloud.net）進行同源性分析［9］，從數據庫下載相近菌種的16S rDNA序列。使用DNAMAN 5.1軟件和MEGA 7軟件，采用鄰近連接法構建系統進化樹［10］。

1.2.2 基因組測序和拼裝 采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取細菌基因組DNA，使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop one型分光光度計和Qubit 3.0型熒光光度計檢測DNA樣品的質量濃度、純度和降解程度。委托廣東省美格基因科技有限公司進行基因組測序分析。采用NEB Next注冊商標" Recalbon○C Ultra DNA Library Prep Kit試劑盒（美國New England Biolabs公司）構建測序文庫，使用Illumina Novaseq 6000測序平臺（美國New England Biolab公司）進行高通量測序，測序原始數據通過FastQC v0.11.9軟件［11］和Trimmomatic v0.36軟件［12］進行質控，并去除低質量數據，采用SPAdes v3.9.0軟件［13］拼接構建contigs/scaffolds（gt;500 nt），并用QUAST v5.0.2軟件［14］評估拼接質量。

1.2.3 基因預測和功能注釋 采用GeneMarkS v4.17軟件（http：∥topaz.gatech.edu/GeneMark/）［15］進行編碼基因預測。采用tRNAscan-SE v1.3.1軟件［16］預測tRNA基因，采用RNAmmer v1.2軟件［17］預測rRNA基因，采用Rfam數據庫Blast程序（https：∥rfam.org/）［18］預測snRNA基因。采用BLAST v2.14.1軟件（https：∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST/）將編碼基因與Gene Ontology（GO）［19］，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）［20-21］，Cluster of Orthologous Groups of Proteins（COG）［22］，Non-Redundant Protein Database（NR）［23］，Carbohydrate-Active EnZymes Database（CAZy）［24］數據庫進行比對，獲得基因功能注釋信息。

1.2.4 比較基因組學分析 使用EzBioCloud中的在線工具ANI Calculator（https：∥www.ezbiocloud.net/tools/ani）分析菌株R18與近源物種的基因組平均核苷酸均一性（gANI）［25］。使用Genome-to-Genome Distance Calculation（GGDC） version 2.1 formula 2（https：∥ggdc.dsmz.de/distcalc2.php）分析菌株R18與近源物種的基因組同源性，即數字DNA-DNA雜交（dDDH）值［26］。

1.2.5 次級代謝產物合成基因簇分析 采用antiSMASH 7.0在線工具（https：∥antismash.secondarymetabolite. org/）對菌株R18 中的次級代謝產物合成基因簇進行預測［27］。

1.2.6 GenBank登錄號 菌株R18 的16S rDNA和基因組序列已提交到GenBank數據庫，登錄號分別為OR043023，JASKOU000000000.1。

2 實驗結果與分析

2.1 菌株形態及生理生化特征

菌株R18不同條件下的生長狀況，如圖1所示。圖1中：t為時間；D（620）為吸光度；ρ（NaCl）為NaCl的質量濃度；θ為溫度。

菌株R18置于LB平板（LB平板直徑=80 mm），在30 ℃條件下培養24 h后，形成紅色菌落，直徑2～4 mm，菌落表面光滑濕潤、邊緣整齊、突起且不透明（圖1（a））。菌體為革蘭氏染色陰性，形態近球形或短棒狀，寬0.4～0.5 μm，長0.4～0.8 μm；氧化酶和過氧化氫酶陽性，產胞外酯酶和蛋白酶，不產淀粉酶。

菌株R18在溫度20～37 ℃，pH值6.0～9.0，NaCl質量濃度0～90 g·L-1條件下均可生長，最佳生長條件為溫度30～37 ℃，pH值6.0～8.0，NaCl質量濃度 0～10 g·L-1（圖1（b）～（d））。菌株R18的形態和各類生理生化特征與模式菌株S. marcescens ATCC 13880一致［1］。

2.2 16S rDNA系統發育分析

菌株R18 16S rDNA基因序列全長1 530 bp，在EzBioCloud數據庫中的比對結果表明，菌株R18屬于Serratia屬，與模式菌株S. marcescens ATCC 13880和S. nematodiphila DSM 21420相似度最高，均為99.86%。系統發育分析也顯示3個菌株親緣關系最近，處于同一個進化分支。

采用鄰近連接法構建系統進化樹， 沙雷氏菌R18與其近源種的16S rDNA系統發育樹，如圖2所示。

圖2中：節點數值為大于40%的Bootstrap值；括號內為GenBank登錄號；比例尺為進化距離。

2.3 沙雷氏菌R18基因組比較分析

基因組測序獲得8 037 186個測序片段（reads）共1 205 577 900 nt的原始數據，去除低質量片段后，可得7 446 608個reads（1 098 126 252 nt），序列片段拼裝成23個重疊群（contigs），菌株R18基因序列總長度為5 046 985 bp，GC含量（GC含量是指DNA序列中鳥嘌呤（guanine）和胞嘧啶（cytosine）兩種堿基的總比例）為59.7%，基因組測序深度為217×，預測有4 872個編碼基因、85 tRNA基因、1個16S rRNA基因、6個5S rRNA基因和43個sRNA基因。菌株R18與各近源物種基因組大小差異不大（標準差σ=0.16），GC含量的比例也較為接近（σ=0.58），但編碼的基因數量存在較大差異（σ=175.25），可能與測序的完整度、質粒的存在狀況有關。

沙雷氏菌R18與其近源物種的基因組特征，如表1所示。

表1中：1為菌株R18；2為S. marcescens ATCC 13880（GCA_006974205.1）；3為S. nematodiphila DSM 21420（GCA_000738675.1）；4為S. bockelmannii S3（GCA_008011855.1）；5為S. surfactantfaciens YD25（GCA_001642805.2）；6為S. ureilytica C7（GCA_008122445.1）。

沙雷氏菌R18與其近源物種的gANI值/dDDH值，如表2所示。表2中：1～6的含義與表1相同。

由表2可知：菌株R18與4個近源菌種基因組gANI值均高于94%，基因組的相似度較高，其中，與S. marcescens ATCC 13880和S. nematodiphila DSM 21420的gANI值高于95%～96%的物種界定閾值［28-30］，分別為98.73%，96.98%；dDDH值分析結果也表明菌株R18，S. marcescens ATCC 13880和S. nematodiphila DSM 21420三者之間的dDDH值高于同一個物種界定閾值（70%）［31］。

由此可見，菌株R18，ATCC 13880和DSM 21420屬于同一個物種S. marcescens。菌株ATCC 13880和DSM 21420之間的gANI值和dDDH值分別為96.93%，73.40%，其中，dDDH值符合亞種界定閾值（小于79%～80%）的要求［32］，故S. nematodiphila可以重新歸類為S. marcescens的一個亞種。該結果與文獻［33］的結果（65.1%）不一致，主要原因在于計算DNA-DNA雜交（DDH）值的方法不同。文中采用的基于基因組序列進行的數字化DDH值計算，相較于傳統的濕實驗室DDH分析方法更具準確性、可重復性和可比性［31］，是基因組大數據時代中可靠的替代方法，具有更高的分辨率和可信度。

2.4 沙雷氏菌R18基因組注釋

沙雷氏菌R18基因組COG，GO，CAZy和KEGG功能分類，如圖3所示。

由圖3（a）及相關分析可知：菌株R18共注釋到4 630個基因，注釋率為95%；COG數據庫的26種功能組中，與氨基酸轉運與代謝、糖類轉移及代謝和轉錄相關的基因數量最多，分別為480（10.4%），421（9.1%）和446（9.6%），沒有發現與核結構和染色質結構及動力學有關的基因，另有180個未知功能基因。

由圖3（b）及相關分析可知：菌株R18共有2 774個基因在GO數據庫中被注釋，GO數據庫按照細胞組分、生物學過程和分子功能3個方面對蛋白進行注釋，而生物學過程、細胞組分和分子功能分支分別為7，2，9個，共計18個分支；大部分基因具有多功能，可以被同時注釋在不同組分或功能過程分支中，2 774個基因共被注釋了6 529次，其中，2個基因被注釋了9次，7個基因被注釋了8次，17個基因注釋了7次，46個基因被注釋了6次，62個基因被注釋了5次，236個基因被注釋了4次，565個基因被注釋了3次，1 213個基因被注釋2次，626個基因被注釋1次；在細胞組分中，共848個基因得到注釋；生物學途徑類共2 851個基因得到注釋，涉及細胞內過程與代謝過程的基因最多，分別為893，924個；分子功能分支共2 830個基因得到注釋，涉及結合和催化活性的基因最多，分別為908，1 296個。

由圖3（c）及相關分析可知：菌株R18的基因組中共有155個基因編碼的蛋白質結構域屬于CAZy家族，包括糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）家族的蛋白54個、糖苷轉移酶家族的蛋白（glycosyl transferases，GTs）45個、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）22個、裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）2個、輔助酶（auxiliary activities，AA）16個、碳水化合物結合組件（carbohydrate-binding modules，CBMs）16個。

由圖3（d）及相關分析可知：菌株R18 的4 587個基因富集在215條KEGG代謝通路中占菌株基因總數的94.2%；基因數大于25的代謝通路有40個；KEGG富集分析顯示，ABC轉運蛋白、雙組分調節系統、氨基酸生物合成、碳代謝是主要的4類代謝通路，分別包含236，138，134和114個基因獲得注釋。

2.5 次級代謝產物合成基因簇分析

沙雷氏菌R18次級代謝物基因簇，如表3所示。通過antiSMASH軟件預測分析，在菌株R18基因組中共檢測到10個與次級代謝產物合成相關的基因簇。這些基因簇可能編碼的代謝產物包括以非核糖體肽合成酶途徑（non-ribosomalpeptide synthetase，NRPS）合成的小菌素（microcin）、紫桿菌素（viobactin）等，以聚酮合酶途徑（polyketide biosynthase，PKS）合成的耶爾森桿菌素（yersiniabactin）、靈菌紅素（prodigiosin），以及硫肽類抗生素（thiopeptide）的O-抗原（O-antigen）和氧化還原輔因子（redox-cofactor）的蘭卡殺菌素（lankacidin）等。

這些代謝產物與抗菌、抗癌、殺蟲等功能密切相關，另有2個基因簇（cluster 3.2，cluster 3.3）無法匹配到已知基因簇，顯示出這些基因簇具有產生新代謝物的潛能。以上基因簇中，prodigiosin，ririwpeptide，trichrysobactin和viobactin的合成基因簇與已知基因簇的相似性分別為100%，100%，46%和46%，其余的則低于20%。由此可見，從基因組水平看，菌株R18具有生產多種具有拮抗作用的次級代謝產物的功能，對其環境競爭力和適應力都具有重要意義。

2.6 靈菌紅素基因簇分析

與產紅色素現象相對應，菌株R18含有完整的靈菌紅素合成基因簇，處于ctg002拼裝片段上，全長跨度35 021 bp，包含29個基因，其中，包含4個核心合成基因、10個補充的合成基因、1個調控基因、1個轉運基因及13個其他基因。

沙雷氏菌R18和粘質沙雷氏菌ATCC 13880靈菌紅素合成基因簇的比較，如圖4所示。

由圖4可知：基因簇序列與粘質沙雷氏菌模式菌株ATCC 13880有100%的一致性；該基因簇與模式菌株ATCC 13880還存在4處小片段未知功能基因差異和一處基因位置偏差（箭頭），故推測其基因組上存在基因跳躍的現象，這可能與粘質沙雷氏菌不同顏色自然突變株的高發生率有關。

沙雷氏菌R18靈菌紅素合成代謝途徑，如圖5所示。

由圖5可知：菌株R18完整的靈菌紅素合成代謝途徑包括3個部分：2-甲基-3-戊基吡咯（MAP）、4-甲氧基-2，2-二吡咯-5-羧甲基乙醛（MBC）的合成，以及在ATP的存在下靈菌紅素縮合酶PigC催化MAP和MBC合成靈菌紅素，這與早期的研究結果一致［34-35］。

3 結論

采用形態學、生理生化、分子生物學及基因組測序分析的方法對菌株R18進行物種鑒定和生物學特性分析，并著重分析菌株R18次級代謝產物靈菌紅素的基因簇及代謝途徑。研究結果表明，菌株R18屬于Serratia屬，與模式菌株S. marcescens ATCC 13880和S. nematodiphila DSM 21420的16S rDAN相似度皆為99.86%，3個菌株處在同一個進化分支上。gANI值和dDDH值分析結果也表明，3個菌株基因組的相似度極高，屬于同一個物種S. marcescens。

基因組序列注釋有助于深入了解菌株R18生命現象的基因本質，尤其是了解各類次級代謝產物的基因簇和代謝途徑，有利于探索它們的調控機理，為基因改造和生產應用奠定基礎。粘質沙雷氏菌生產的靈菌紅素是目前研究較為清楚的次級代謝產物，代謝途徑包括2-甲基-3-戊基吡咯（MAP）、4-甲氧基-2，2-二吡咯-5-羧甲基乙醛（MBC）的合成，以及在ATP的存在下靈菌紅素縮合酶PigC催化MAP和MBC合成靈菌紅素。通過antiSMASH軟件預測的菌株R18靈菌紅素基因簇由29個基因組成，包含了PigA-PigN及轉運、調控等相關基因。

致謝： 廈門市金安小學李昊城同學為本研究提供菌種，從他皮膚表面分離得到實驗菌株R18。

參考文獻：

［1］ GRIMONT F，GRIMONT P A D，GENUS X X X I V.Bergey′s manual of systematic bacteriology［M］.2nd ed.Berlin：Springer，2005.

［2］ ARAJO R G，ZAVALA N R，CASTILLO-ZACARAS C，et al.Recent advances in prodigiosin as a bioactive compound in nanocomposite applications［J］.Molecules，2022，27（15）：4982.DOI：10.3390/molecules27154982.

［3］ ESPONA-FIEDLER M，MANUEL-MANRESA P，BENTEZ-GARCA C，et al.Antimetastatic properties of prodigiosin and the BH3-mimetic obatoclax （GX15-070） in melanoma［J］.Pharmaceutics，2022，15（1）：97.DOI：10.3390/pharmaceutics15010097.

［4］ CHEN P，WU H，BIAN T，et al.Prodigiosin improves acute lung injury in a rat model of rheumatoid arthritis via down-regulating the nuclear factor kappaB/nucleotide-binding domain， leucine-rich-containing family， pyrin domain-containing-3 signaling pathway［J］.Journal of Physiology and Pharmacology，2023，74（1）：43-54.DOI：10.26402/jpp.2023.1.05.

［5］ YOUNAS H，NAZIR A，BAREEN F E，et al.Metabolic profile and molecular characterization of endophytic bacteria isolated from Pinus sylvestris L.with growth-promoting effect on sunf-lower［J］.Environmental Science and Pollution Research，2023，30（14）：40147-40161.DOI：10.1007/s11356-022-25118-7.

［6］ 中國輕工業聯合會，中國生物發酵產業協會.第一屆菌種培養職業技能競賽暨第七屆微生物培養皿藝術大賽［EB/OL］.（2023-07-05）［2023-11-20］.https：∥vote.isv.youzan.com/h5？banner_id=f.110709144～image_ad.5～0～30rBitpJamp;reft=1697538254536amp;spm=f.110709144#/h5/1681269487132774/1/122509290/0.

［7］ 東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統鑒定手冊［M］．北京：科學出版社，2001.

［8］ DELONG E F.Archaea in coastal marine environments［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89（12）：5685-5689.DOI：10.1073/pna.89.12.5685.

［9］ KIM O S，CHO Y J，LEE K，et al.Introducing EzTaxone： A prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（Pt3）：716-721.DOI：10.1099/ij.0.038075-0.

［10］ KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7： Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets［J］.Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.DOI：10.1093/molbev/msw054%20.

［11］ CHEN Shifu，ZHOU Yanqing，CHEN Yaru，et al.fastp： An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor［J］.Bioinformatics，2018，34（17）：i884-i890.DOI：10.1093/bioinformatics/bty560.

［12］ BOLGER A M，LOHSE M，USADEL B.Trimmomatic： A flexible trimmer for Illumina sequence data［J］.Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120.DOI：10.1093/bioinformatics/btu170.

［13］ BANKEVICH A，NURK S，ANTIPOV D，et al.SPAdes： A new genome assembly algorithm and its applications to single cell sequencing［J］.Journal of Computational Biology，2012，19（5）：455-477.DOI：10.1089/cmb.2012.0021.

［14］ GUREVICH A，SAVELIEV V，VYAHHI N，et al.QUAST： Quality assessment tool for genome assemblies［J］.Bioinformatics，2013，29（8）：1072-1075.DOI：10.1093/bioinformatics/btt086.

［15］ BESEMER J，LOMSADZE A，BORODOVSKY M.GeneMarkS： A self-training method for prediction of gene starts in microbial genome： Implications for finding sequence motifs in regulatory regions［J］.Nucleic Acids Research，2001，29（12）：2607-2618.DOI：10.1093/nar/29.12.2607.

［16］ LOWE T M，EDDY S R.tRNAscan-SE： A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence［J］.Nucleic Acids Research，1997，25（5）：955-964.DOI：10.1093/nar/25.5.955.

［17］ LAGESEN K，HALLIN P，RDLAND E A，et al.RNAmmer： Consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes［J］.Nucleic Acids Research，2007，35（9）：3100-3108.DOI：10.1093/nar/gkm160.

［18］ GARDNER P P，DAUB J，TATE J G，et al.Rfam： Updates to the RNA families database［J］.Nucleic Acids Research，2009，37（Database issue）：D136-D140.DOI：10.1093/nar/gkn766.

［19］ ASHBURNER M，BALL C A，BLAKE J A，et al.Gene ontology： Tool for the unification of biology［J］.Nature Genetics，2000，25（1）：25-29.DOI：10.1038/75556.

［20］ KANEHISA M，GOTO S，KAWASHIMA S，et al.The KEGG resource for deciphering the genome［J］.Nucleic Acids Research，2004，32（Database issue）：D277-D280.DOI：10.1093/nar/gkh063.

［21］ KANEHISA M，GOTO S，HATTORI M，et al.From genomics to chemical genomics： New developments in KEGG［J］.Nucleic Acids Research，2006，34（Database issue）：D354-D357.DOI：10.1093/nar/gkj102.

［22］ TATUSOV R L，FEDOROVA N D，JACKSON J D，et al.The COG database： An updated version includes eukaryotes［J］.BMC Bioinformatics，2003，4（1）：41.DOI：10.1186/1471-2105-4-41.

［23］ LI Weizhong，JAROSZEWSKI L，GODZIK A.Tolerating some redundancy significantly speeds up clustering of largeprotein databases［J］.Bioinformatics，2002，18（1）：77-82.DOI：10.1093/bioinformatics/18.1.77.

［24］ CANTAREL B L，COUTINHO P M，RANCUREL C，et al.The carbohydrate-active EnZymes database （CAZy）： An expert resource for glycogenomics［J］.Nucleic Acids Research，2009，37（Database issue）：D233-D238.DOI：10.1093/nar/gkn663.

［25］ YOON S H，HA S M，LIM J，et al.A large-scale evaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2017，110（10）：1281-1286.DOI：10.1007/s10482-017-0844-4.

［26］ MEIER-KOLTHOFF J P，SARD C J，PEINADO-OLARTE R L，et al.TYGS and LPSN： A database tandem for fast and reliable genome-based classification and nomenclature of prokaryotes［J］.Nucleic Acids Research，2022，50（Database issue）：D801-D807.DOI：10.1093/nar/gkab902.

［27］ BLIN K，SHAW S，AUGUSTIJN H E，et al.AntiSMASH 7.0： New and improved predictions for detection， regulation， chemical structures and visualisation［J］.Nucleic Acids Research，2023，51（W1）：W46-W50.DOI：10.1093/nar/gkad344.

［28］ KIM M，OH H S，PARK S C，et al.Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2014，64（Pt2）：346-351.DOI：10.1099/ij.0.059774-0.

［29］ CHUN J，OREN A，VENTOSA A，et al.Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2018，68（1）：461-466.DOI：10.1099/ijsem.0.002516.

［30］ RICHTER M，ROSSELL-MRA R.Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic speciesdefinition［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（45）：19126-19131.DOI：10.1073/pna.0906412106.

［31］ MEIER-KOLTHOF J P，AUCH A F，KLENK H P，et al.Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions［J］.BMC Bioinformatics，2013，14：60.DOI：10.1186/1471-2105-14-60.

［32］ MEIER-KOLTHOFF J P，HAHNKE R L，PETERSEN J，et al.Complete genome sequence of DSM 30083T， the type strain （U5/41T） of Escherichia coli， and a proposal for delineating subspecies in microbial taxonomy［J］.Standards in Genomic Sciences，2014，9：2.DOI：10.1186/1944-3277-9-2.

［33］ ZHANG Chongxing，YANG Shouyun，XU Mingxu，et al.Serratia nematodiphila sp. nov.associated symbiotically with the entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis （Rhabditida： Rhabditidae）［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59（Pt7）：1603-1608.DOI：10.1099/ij.0.65718-0.

［34］ HARRIS A K P，WILLIAMSON N R，SLATER H，et al.The Serratia gene cluster encoding biosynthesis of the red antibiotic， prodigiosin， shows species-and strain-dependent genome context variation［J］.Microbiology，2004，150（Pt11）：3547-3560.DOI：10.1099/mic.0.27222-0.

［35］ LI Peishan，HE Shufen，ZHANG Xuejiao，et al.Structures， biosynthesis， and bioactivities of prodiginine natural products［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2022，106（23）：7721-7735.DOI：10.1007/s00253-022-12245-x.