香蕉枯萎病菌內源報告基因Foc4carS的鑒定及其應用

關鍵詞：香蕉枯萎菌Foc4；Foc4carS 基因；類胡蘿卜素；基因敲除；CRISPR/Cas9 基因編輯

中圖分類號：S436.68 文獻標志碼：A

鐮刀菌屬（Fusarium）真菌是主要的植物病原菌，能夠產生多種次生代謝產物，次生代謝產物可以分為聚酮類（黃色鐮刀菌素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等）、非核糖體多肽類（鐵載體等）和萜類（單端孢霉烯和類胡蘿卜素等）3 種主要的類型[1-2]。在萜類化合物中，類胡蘿卜素生物合成的主要產物是羧基葉黃素鏈孢霉黃素（carboxylicxanthophyll neurosporaxanthin， NX），由香葉酰焦磷酸鹽通過carRA、carB、carT、carD 四種結構基因編碼不同的酶參與類胡蘿卜素的生物合成，類胡蘿卜素的生物合成相關基因受到光照的正調控表達[3-6]。此外，這些真菌還產生少量的β-胡蘿卜素（β-carotene），β-胡蘿卜素可能被CarX 加氧酶裂解產生視網膜，即視紫紅質的發色團[7-8]。

carS 基因通過調控下游car 結構基因參與調控鐮刀菌類胡蘿卜素的生物合成。在水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）中利用化學誘變劑[甲基硝基亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine，MNNG）]首次獲得了類胡蘿卜素過量表達的carS 突變體，carS 突變體菌落呈深橙色[9]。carS基因在結構和功能上保守，將水稻惡苗病菌（F.fujikuroi）的carS 基因回補到F. oxysporum 的carS突變體中，可以恢復類胡蘿卜素的生物合成[4]；在尖孢鐮刀菌番茄專化型（F. oxysporum f. sp.lycopersici strain 4287， Fol ） 上也鑒定到編碼RING-finger 的carS 基因，敲除carS 后的突變體菌株出現深橙色菌落顏色，carS 基因通過負調控下游car 結構基因控制類胡蘿卜素的生物合成[5]。此外，carS 受到上游lncRNA carP 的負調控表達[10]。敲除carP 后carS 上調表達，突變株出現白化表型，通過轉錄組測序以及重新導入carP 到敲除突變體的表型分析表明，carP 只有在插入carS 上游表型才能夠恢復，因此，carP 是順式調控因子，通過負調控carS 基因參與調控鐮刀菌屬Fusarium的類胡蘿卜素生物合成[11]。在有光照的情況下，carS 的mRNA 水平更高，氮饑餓無明顯變化，在熱休克或氧化應激后，carS 的mRNA 水平明顯下降，這表明存在不同的激活機制。CarS 突變體的孢子比野生型的孢子對H2O2 的抗性更強，然而，該突變體在生長水平上表現出更強的H2O2 敏感性，這可能是由于CarS 參與調節具有過氧化氫酶結構域的基因[12]。

CRISPR/Cas9 是一種存在于細菌和古菌中保守的獲得性免疫防御機制，近年來已被開發成為一種方便靈活的基因組編輯技術，可直接在基因組上進行DNA 序列的敲除、插入、定點突變以及組合編輯等[13-15]。王艷瑋等[16]在香蕉枯萎菌Foc4中克隆鑒定出Foc4Bik1 基因，通過同源重組修復（homology directed repair， HDR）的方式進行Foc4Bik1 基因編輯，獲得ΔFoc4Bik1（HDR）基因編輯敲除子，該ΔFoc4Bik1（HDR）基因編輯敲除子呈現白色菌落表型。本研究以香蕉枯萎菌Foc4 為研究對象，通過獲得Foc4carS 基因的敲除和回補突變體，測定突變體的生物學表型和致病力，明確Foc4carS 基因功能，同時構建以Foc4carS 為靶標基因的體內表達Cas9 和sgRNA的質粒型CRISPR/Cas9 基因編輯體系，并以此評估在香蕉枯萎菌Foc4 中基因編輯的可行性，為香蕉枯萎菌的分子生物學研究提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、載體、香蕉品種和引物 香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp.cubense race 4， Foc4），由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所熱帶果樹病害研究組鑒定保存；回補載體pYF11由南京農業大學張海峰教授課題組惠贈，載體pKOV21 由華中農業大學植物科學技術學院陳小林教授課題組惠贈；試驗接種的香蕉品種為巴西蕉（Musa AAA Cavendish cv.Brazil），購自中國熱帶農業科學院種苗組培中心；PCR 引物由北京六合華大基因科技有限公司合成（PAGE 純化，表1）。

1.1.2 主要試劑 DNA 普通聚合酶（ 2×TaqMaster Mix Dye Plus， P112-1）、DNA 高保真聚合酶（Phata Max Super-fidelity DNA Polymerase，P505-d2）、DNase I（EN401）、反轉錄酶試劑盒（ HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，R111-02）、qRT-PCR 試劑盒（ChamQ SYBR qPCRMaster Mix， Q311-03）、DNA 重組克隆試劑盒（ClonExpress? II One Step Cloning Kit， C112-02）等購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技股份有限公司；質粒小量提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I，D6943-02）和膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，D2500-02）購自Omega Bio-Tek 公司；溶壁酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum，L1412）和崩潰酶（DriselaseTM from Basidiomycetessp.， D9515-25G）購自Sigma 公司；酵母轉化試劑盒（ Alkali-CationTM Yeast Transformation Kit，#112200200）、總RNA 提取試劑盒（Trizol Reagent，B610409-0100）等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養基和緩沖液 PDA培養基：馬鈴薯去皮200 g，切成土豆片后，加入蒸餾水煮25～30 min后，用3 層紗布過濾，加入20.0 g 葡萄糖，15.0 g瓊脂粉至濾液中，定容至1 L；LB 培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，ddH2O 定容至1 L，調節pH 至7.0（固體LB 培養基加入15.0 g 瓊脂粉）；YEPD培養基：蛋白胨10g，酵母提取物3 g，葡萄糖20 g，ddH2O 定容至1 L（固體YEPD 培養基加入15.0 g 瓊脂粉）；RM 再生培養基：蔗糖205.5 g，酵母提取物3.0 g，葡萄糖20.0 g，ddH2O 定容至1 L（固體RM 培養基加入15.0 g 瓊脂粉）。

0.7 mol/L NaCl 緩沖液：40.908 g NaCl，ddH2O定容至1 L；1 mol/L Tris（pH 7.5）緩沖液：Tris Base121.14 g，HCl 調節pH 至7.5，ddH2O 定容至1 L；STC 緩沖液：1.2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl2，ddH2O 定容至1 L；PTC 緩沖液：40% PEG 3350，10 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl2，ddH2O 定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 Foc4carS 在基因組的位置排列以及蛋白結構域分析 從NCBI 數據庫下載香蕉枯萎菌Foc4carS 基因（FOIG_05085）序列，利用在線軟件SMART（http：//smart.embl.de）分析Foc4carS蛋白的保守功能域。通過Blastx 進行同源比對，獲得Foc4carS 親緣關系相近的蛋白序列，利用MEGA-X 軟件構建系統進化樹（統計方法選用Neighbor-Joining，選用Bootstrap method 進行系統發育檢驗，No. of Bootstrap Replications 為1000次；替代模型選用Jones-Taylor-Thornton （JTT）model）。

參考已發布的Foc4 野生株基因組序列（JH658279.1）分析carS 基因在Foc4 基因組上與調控基因之間的相對位置。首先，分析Foc4carS上游是否存在負調控lncRNA carP ， 以及與Foc4carS 基因在基因組上的相對排列位置[11]；其次，分析Foc4carS 下游結構基因carRA、carB、carT、carD 以及carX 在基因組上的排列位置以及是否呈基因簇排列[7]。

1.2.2 Foc4carS 基因敲除片段的構建 以香蕉枯萎菌Foc4 的基因組DNA 為模板，分別用引物carS-U-F/carS-NEO-U-R 和carS-NEO-D-F/carS-DR擴增出Foc4carS 的上、下游片段，利用Splitmarker重組方法[17]，用引物carS-N-F/NEO-R1 和NEO-F1/carS-N-R 構建與新霉素的融合片段，并用于后續的Foc4carS 基因敲除。

1.2.3 PEG 介導的原生質體轉化以及ΔFoc4carS敲除突變體的驗證 香蕉枯萎菌Foc4 原生質體轉化及敲除突變體的驗證參照文獻[16， 18-19]。將含有部分新霉素抗性基因NEO 序列的上、下游敲除片段（3～5 μg）加入到含有200 μL Foc4 原生質體的2.0 mL 離心管中，輕柔混勻后，冰上放置30 min。向混合液中逐滴加入200 μL PTC，輕柔混勻，冰上放置7 min；再次逐滴加入200 μL PTC，輕柔混勻，冰上放置7 min；將約700～800 μL 原生質體混合液轉移至50 mL 圓底離心管中，逐滴加入800 μL PTC，輕柔混勻，室溫放置10 min。將預冷的STC 溶液加入到混合液至25 mL，輕柔混勻后，4 ℃，5000 r/min 離心10 min，小心去除上清液；加入RM 液體培養基5 mL，充分混勻，轉至28 ℃，100 r/min 搖培12～16 h。加入30 mL含有200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素的RM固體培養基，輕柔混勻后倒入5 個培養皿，室溫靜置10 min，向5 個平板內再分別倒入15 mL RM固體培養基（200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素），室溫靜置30 min，隨后轉入28 ℃培養箱中，倒置培養3～7 d，長出轉化子后，將轉化子轉接于PDA 培養基（200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素）繼續進行抗性篩選，28 ℃培養3～5 d，長出菌落后收集菌絲，提取轉化子基因組DNA，用carS-outside-1F/carS-outside-2609R 、carS-Inside-1F/carS-inside-785R、NEO-F/NEO-R 等3 對引物對轉化子進行PCR 驗證。

1.2.4 Foc4carS 基因回補載體的構建以及回補轉化子的獲得 以pKOV21 質粒DNA 為模板，使用引物HYG-pYF11-PgpdA-F/HYG-pYF11-PgpdAR擴增Hph 抗性基因片段，以pYF11 為骨架，用Pst Ⅰ單切線性化，將Hph 抗性基因片段連入pYF11，獲得載體pYF11-Hph。以Foc4 基因組DNA 為模板， 引物carS-Com-native-1F/carSCom-3414R 進行PCR 擴增，擴增片段Foc4carSCom長度為3414 bp，含有Foc4carS 基因原始啟動子序列（1380 nt）和ORF 序列（1973 nt，去除終止密碼子）。

將載體pYF11-Hph 用Xho Ⅰ單切線性化，將3.4 kb 的擴增片段Foc4carS-Com 和pYF11-Hph按照9∶1 比例共轉化酵母感受態，在酵母SD-Trp培養基長出單菌落后，利用pYF11 骨架上的通用引物M13F（-47）與Foc4carS 基因特異反向引物carS-inside-785R 組合，進行菌落PCR 驗證，將陽性單克隆提取酵母質粒DNA，轉化大腸桿菌DH5α，進行菌落PCR 后獲得回補載體pYF11-Hph-Foc4carS。

ΔFoc4carS 的基因回補過程的原生質體制備和PEG 介導轉化參照方法1.2.3，將15～20 μg 的回補載體pYF11-Hph-Foc4carS 與200 μL ΔFoc4carS基因敲除突變體原生質體混合，在含有100 μg/mL潮霉素的RM 再生培養基進行抗性篩選，轉化子用carS-inside-1F/carS-Inside-785R、HYG-probe-1F/HYG-probe-598R 、pCT74-sGFP-123F/pCT74-sGFP-468R 等3 對引物進行PCR 驗證。

1.2.5 ΔFoc4carS 突變體生長特性分析 參照王艷瑋等[16]的方法對ΔFoc4carS突變體進行菌落形態觀察、菌落直徑的測定、分生孢子形態顯微觀察和分生孢子產量測定等，試驗重復3 次。

1.2.6 Foc4carS 基因以及類胡蘿卜素合成途徑carRA 和carB 的定量表達分析 收集Foc4 和ΔFoc4carS 分別接種于PDA 培養基上培養5 d 的菌絲，液氮處理10 min 后于–80 ℃冰箱保存備用。使用Trizol 法提取樣品的總RNA，按照HiScript?Ⅲ Reverse Transcriptase操作說明書進行cDNA合成，參考ChamQ SYBR qPCR Master Mix 產品說明書，采用20 μL 體系，分別使用carS-qPCR-F/carS-qPCR-R 、carRA-qPCR-F/carRA-qPCR-R 、carB-qPCR-F/carB-qPCR-R 等3 對引物進行qRT-PCR，以Foc4 的Actin 為內參基因，采用2-ΔΔCT值比較分析car 基因在Foc4 和ΔFoc4carS 不同光/暗處理下的表達量。

1.2.7 ΔFoc4carS 突變體致病力分析 ΔFoc4carS突變體致病力測定參照王艷瑋等[16]的方法，接種30～40 d 后，參考MOHAMED 等[20]的病情調查分級標準，統計發病情況并拍照。

1.2.8 Foc4carS 為靶標基因的CRISPR/Cas9 基因編輯載體設計及構建 參照SHI 等[14]和王艷瑋等[16]的方法，以水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）的基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph（Addgene No.121092），設計并構建以Foc4carS 為靶標基因的CRISPR/Cas9 基因編輯載體。

首先通過在線gRNA 序列設計網站（http：//grna.ctegd.uga.edu/和http：//crispor.tefor.net/），確定gRNA 的序列（Foc4carS-gRNA591：TATCGCCACTTATCGCCTGGCGG）。構建5SrRNA-Foc4carSsgRNA591序列：首先人工合成263 nt 的Ff5SrRNAfcc1-sgRNA 基因序列[14]，以此為DNA 模板進行2 輪PCR 構建5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591。第一輪PCR 分別用引物5SrRNA-U-F-EcoRI/carSsgRNA591-R 、carS-sgRNA591-F/5SrRNA-U-REcoRI擴增5SrRNA-Foc4CarS-sgRNA591 的上、下兩端序列；第二輪PCR 用引物5SrRNA-U-FEcoRI/5SrRNA-U-R-EcoRI 進行融合PCR 擴增，得到5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591 序列。

其次，將5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591 同源重組導入編輯載體。pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph 載體質粒DNA 用EcoR I 酶切后，按照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit 說明書，將5SrRNAFoc4carS-sgRNA591 序列導入載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph，獲得靶向Foc4carS 的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 基因編輯載體，該載體采用體內表達的Cas9 和sgRNA 質粒進行基因編輯。

最后，利用pYF11 載體構建同源重組修復（homology directed repair， HDR）的HDR 供體質粒pYF11-Foc4carS-HDR。第一步，采用2 輪PCR方法融合擴增Foc4carS-HDR 序列。第一輪PCR分別采用引物pYF11-carS-HDR-F1/carS-LB-R1、carS-RB-F2/pYF11-carS-HDR-R2 擴增Foc4carS基因的上游1302 bp、下游1220 bp 同源序列；第二輪PCR 采用引物pYF11-carS-HDR-F1/pYF11-carS-HDR-R2 進行overlap PCR 擴增上、下兩段序列成為Foc4carS-HDR 序列。第二步，Foc4carSHDR序列導入pYF11 構建成pYF11-Foc4carSHDR載體作為基因編輯的HDR 模板。將pYF11載體DNA 經Xho Ⅰ線性化，Foc4carS-HDR 序列和pYF11-XhoⅠ線性DNA 混合共轉化XK1-25 酵母細胞，參照酵母轉化試劑盒（Alkali-CationTMYeast Transformation Ki， t#112200200）說明書進行轉化，以構建重組供體質粒pYF11-Foc4carSHDR，從陽性酵母XK1-25 轉化子中提取質粒，并將其轉移到大腸桿菌DH5α 菌株中擴繁，PCR檢測大腸桿菌DH5α 中的重組質粒后測序再次驗證，然后提取pYF11-Foc4carS-HDR 質粒備用。

1.2.9 香蕉枯萎菌Foc4 的CRISPR/Cas9 基因編輯分別取5 μg pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4CarS、供體質粒pYF11-Foc4carS-HDR 混入200 μL1×107 個/mL 的Foc4 原生質體，輕輕混勻后冰浴30 min，采用含有100 μg/mL 潮霉素HYG 抗性的RM 再生培養基進行抗性篩選，其他步驟與1.2.3的原生質體轉化方法一致。利用carS-outside-1F/carS-outside-2609R 、carS-inside-1F/carS-inside-785R、PgpdA-2648F/Cas9-424R、pRS-marker/gRNAR等4 對引物對編輯轉化子進行PCR 驗證，基因編輯后的陽性轉化子篩選方法與基因敲除陽性轉化子篩選方法一致，差別在于基因敲除突變體carS 基因位點被抗性基因HYG 取代，而基因編輯后的突變體中carS 基因沒有被抗性基因取代位點，而是被重組刪除。

1.3 數據處理采用WPS Office 和SPSS 22.0 軟件對試驗數據進行統計分析并作圖，采用單因素方差分析中的Duncan’s 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 Foc4carS 的基因組特性以及進化分析

在Foc4 基因組中通過同源比對發現，Foc4carS基因（FOIG_05085）的CDS 全長為1776 nt，包含2 個內含子，編碼592 個氨基酸。在Foc4carS 基因上游1295 nt 處存在長度為1296 nt 的lncRNAFoc4carP，其基因組排列與水稻惡苗病菌（F.fujikuroi）中的一致，說明在Foc4 中，Foc4carS也可能受到上游Foc4carP 的負調控（圖1A）。Foc4中car 基因的排列與前期尖孢鐮刀菌番茄轉化型（Fol）和尖孢鐮刀菌棉花專化型（Fov）上的報道一致，Foc4carX/Foc4carRA/Foc4carB/Foc4carO一起排列在Foc4 的基因組上（圖1A）。香蕉枯萎菌Foc4carS 與水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）等含有相同的蛋白功能域，除了含有典型的RING-finger 蛋白結構域外，還含有N 端依賴ATP 的LON 蛋白酶結構域[ATP-dependent protease Lon （La） protease]（圖1B）。系統發育進化樹結果顯示：香蕉枯萎菌Foc4carS 蛋白與尖孢鐮刀菌不同專化型的同源性最高，聚為一簇，而與大麗輪枝孢（Verticilliumdahliae）、希金斯刺盤孢（Colletotrichum higginsianum）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）等病原真菌的carS 蛋白親緣關系較遠，說明香蕉枯萎菌的Foc4carS 蛋白與其他尖孢鐮刀菌專化型的carS蛋白具有相近的親緣關系（圖1C）。

2.2 Foc4carS 基因敲除和回補突變體的驗證

以Foc4 基因組DNA 為模板，分別用引物carS-U-F/carS-NEO-U-R 和carS-NEO-D-F/carS-DR擴增出上游、下游片段，獲得上游片段1595 bp，下游片段1582 bp。利用融合PCR 構建出敲除片段，以上游片段和新霉素全長基因為模板，用引物carS-N-F/NEO-R1 擴增出上游與新霉素融合片段，大小為2010 bp；以下游片段和新霉素全長基因為模板，用引物NEO-F1/carS-N-R 擴增出下游與新霉素融合片段，大小為2196 bp。

通過PEG 介導的原生質體轉化Foc4 并獲得具有新霉素NEO 抗性的ΔFoc4carS 候選轉化子，利用carS-outside-1F/carS-outside-2609R、carS-inside-1F/carS-inside-785R、NEO-F/NEO-R 等3 對引物對轉化子進行PCR 驗證，得到6 個陽性突變體。其中Outside 引物（carS-outside-1F/carS-outside-2609R）從ΔFoc4carS 敲除突變體中擴增出1915 bp，而野生型Foc4 擴增片段大小為2609 bp；Inside引物（carS-inside-1F/carS-inside-785R）從Foc4 中擴增出785 bp 特異條帶，而ΔFoc4carS 敲除體未能擴增出特異條帶；抗性基因新霉素NEO 的PCR擴增結果顯示，野生株Foc4 中未能擴增出1370 bp條帶，而在ΔFoc4carS 敲除突變體中均能擴增到1370 bp 條帶，此PCR 檢測結果表明Foc4carS 基因成功被新霉素基因替換（圖2A）。

構建的回補載體pYF11-Hph-Foc4carS 通過PEG 介導轉化敲除突變體（ΔFoc4carS-8）原生質體， 經基因內部特異引物carS-inside-1F/carSinside-785R、pYF11-Hph 骨架上的抗性基因潮霉素Hph 引物HYG-probe-1F/HYG-probe-598R、綠色熒光蛋白GFP 基因引物pCT74-sGFP-123F/pCT74-sGFP-468R 等3 對引物驗證，得到回補突變體ΔFoc4carS-Com（圖2B）。

2.3 ΔFoc4carS 突變體的生物學表型分析

在PDA 培養基上培養5 d 后，ΔFoc4carS 敲除突變體出現橙色菌落，野生型Foc4 和回補突變體ΔFoc4carS-Com 均為白色菌落，菌落顏色差異明顯。PDB 液體搖培7 d 后，ΔFoc4carS 敲除突變體中也出現深橙色搖培菌液，而Foc4 和回補突變體ΔFoc4carS-Com 則為白色菌液（圖3A）；對敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carSCom和野生型Foc4 菌株的菌絲頂端形態以及分生孢子形態進行顯微觀察，發現Foc4carS 基因缺失對香蕉枯萎病菌的菌絲頂端形態（圖3B）和分生孢子形態（圖3C）均無明顯影響；同時，敲除突變體ΔFoc4carS 的菌落直徑和產孢量與野生菌株Foc4 相比均無顯著差異（圖3D，圖3E）。ΔFoc4carS 中類胡蘿卜素過量表達出現深橙色表型，說明carS 基因有作為香蕉枯萎菌內源報告的特征和潛力。

2.4 香蕉枯萎菌Foc4中car基因在不同光照處理下的表達分析

為了揭示Foc4 中類胡蘿卜素的合成分別受到光誘導的正調控和carS 的負調控機制，本研究對Foc4 和ΔFoc4carS 的表型與主要car 基因（carRA 和carB）的mRNA 表達進行了qRT-PCR關聯分析。Foc4 和ΔFoc4carS 突變體分別接種于PDA 培養基上，在光照、黑暗以及光暗交替培養3 種條件下，培養5 d 后觀察平板菌落表型，同時對carS、carRA 和carB 基因的表達情況進行評估（圖4）。結果顯示，野生型Foc4 在光照條件下出現淡橙色，而暗培養和光暗交替培養的平板顏色差異不大；ΔFoc4carS 突變體在光照條件下出現深橙色菌落顏色，光暗交替條件下為橙色，而暗培養條件下的菌落顏色為淡粉色，顏色依次變淡（圖4A）；而Foc4 中的carS 基因光照后誘導上調表達（圖4B）。與此對應的是Foc4carRA、Foc4carB 基因表達量也是依照光、光暗、暗培養順序依次下調表達（圖4C），說明菌落顏色深淺與car 基因的表達水平一致。因此，Foc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到雙重調控，光照正調控表達和carS 的負調控表達。

2.5 ΔFoc4carS 致病力測定

為明確Foc4carS基因對香蕉枯萎病菌致病力的影響， 采用盆栽傷根灌淋法對敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 和野生菌株Foc4 進行了活體致病力測定。結果顯示，空白對照清水組的巴西蕉苗生長旺盛，株高顯著高于Foc4、敲除突變體ΔFoc4carS 以及回補突變體ΔFoc4carS-Com。而敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 處理的巴西蕉苗發病情況與野生菌株Foc4 處理的巴西蕉類似，植株下層葉陸續出現黃葉，植株矮化，嚴重發病植株出現死株，切開球莖觀察，球莖出現典型的壞死斑，球莖褐化明顯（圖5A）。統計其發病病級，結果顯示敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 與野生株Foc4 的病情指數無顯著差異（圖5B）。結果表明，Foc4carS 基因的缺失對Foc4 的致病力并無影響，Foc4CarS 基因僅參與次生代謝產物類胡蘿卜素的生物合成，并不參與調控病原菌的致病力。

2.6 Foc4carS 為靶標評估CRISPR/Cas9 基因編輯的可行性

構建靶向Foc4carS 的CRISPR/Cas9 基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS （ 圖6A），采用同源重組修復（HDR）的方式進行后續的基因敲除。將編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 質粒與pYF11-Foc4carS-HDR 供體質粒混合后共轉化香蕉枯萎病菌Foc4 的原生質體（圖6B），經過潮霉素抗性篩選和再生培養獲得ΔFoc4carS （HDR）基因編輯轉化子，在PDA 平板上出現典型的深橙色菌落表型，與野生型Foc4的白色菌落對比明顯，肉眼可辨別（圖6C）。通過4 對引物對基因編輯敲除轉化子進行PCR 檢測，結果顯示：Outside 引物可以從野生菌株Foc4中擴增到2609 bp 條帶，而ΔFoc4carS （HDR）中擴增得到545 bp；Inside 引物只能從Foc4 中擴增到785 bp，而ΔFoc4carS （HDR）無擴增條帶。此外，Cas9 基因和sgRNA 只能分別從ΔFoc4carS （HDR）中擴增獲得1310 bp 和506 bp（圖6D）。結果表明，ΔFoc4carS （HDR）基因編輯轉化子中的pUCfFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 基因編輯載體成功插入基因組中，通過基因編輯方法成功將靶標基因Foc4carS敲除。

3 討論

香蕉枯萎病菌Foc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到光和Foc4carS 的共同調控。Foc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到Foc4carS 的負調控表達。野生型Foc4 菌落顏色是白色，而ΔFoc4carS 突變體出現了橙色菌落，2 個主要的car 結構基因Foc4carRA 和Foc4carB 無論是何種培養條件下，在Foc4carS 突變體中的表達水平均高于野生型Foc4，因此，Foc4carS 突變體是類胡蘿卜素過表達突變體，與前期的鐮刀菌屬Fusarium 的研究[5， 9]結果一致，說明Foc4carS 負調控car 結構基因參與Foc4 類胡蘿卜素的生物合成。

Foc4carS 以及car 結構基因均受到光誘導上調表達。本研究中發現，基因Foc4carS 以及Foc4carS 負調控的car 結構基因Foc4carRA 和Foc4carB 均受到光照誘導上調表達，且野生型Foc4 中Foc4carRA 和Foc4carB 的表達量明顯小于ΔFoc4carS 突變體，推測可能是野生型Foc4 含有的Foc4carS 基因受光照誘導上調表達后抑制調控的car 結構基因的表達，這說明了野生型Foc4中car 結構基因表達量為什么低于ΔFoc4carS 突變體， 也部分解釋了野生型Foc4 光照條件下Foc4carS 上調表達而菌落依然可以過量表達類胡蘿卜素而出現淡粉色的問題。前期研究表明，ΔcarS 突變體是不依賴光誘導形成類胡蘿卜素，表型深橙色色素，積累大量的鏈孢霉黃素NX 和類胡蘿卜素前體物質[6-7]。本研究中的ΔFoc4carS突變體光照培養后， 比暗培養和光/暗培養的ΔFoc4carS 突變體的菌落顏色更濃且呈深橙色，而結構基因carRA、carB 的上調表達幅度也比暗培養和光/暗交替培養的更大，說明ΔFoc4carS 突變體光照后car 基因上調表達，積累更多的鏈孢霉黃素從而使菌落顏色更深。因此，ΔFoc4carS突變體的類胡蘿卜素生物合成也受到光誘導表達調控。

在水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）的研究表明carS 作為胡蘿卜素生物形成的負調控因子，其調控作用本身也受到野生型菌株自身的調控，保證適當量的鏈孢霉黃素NX 產生并受到光誘導調控[21]。本研究中，無論什么培養條件下，Foc4中均保持一定基礎水平的類胡蘿卜素含量，即使野生型Foc4 在暗培養條件下，Foc4carRA 和Foc4carB結構基因仍然能夠保持一定的表達量，使得Foc4維持一定水平的類胡蘿卜素含量，保證一定的鏈孢霉黃素NX 和類胡蘿卜素前體物質，與前期的研究結果一致。

本研究鑒定的Foc4carS 基因符合作為香蕉枯萎菌的內源報告基因：（1）Foc4carS 基因為單一拷貝基因；（2）突變體表型容易分辨，ΔFoc4carS突變株菌落顏色呈深橙色，與野生株的白色菌落差異明顯；（3）Foc4carS 參與調控的表達產物能夠定量測定，Foc4carS 參與類胡蘿卜素的生物合成，含量可以量化測定；（4）Foc4carS 僅影響Foc4的次生代謝產物，對其致病力、菌落形態、分生孢子形態及產量等表型無影響。CRISPR/Cas9 基因編輯可以對基因組不同功能基因定向編輯，通過剪除DNA 片段來敲除某基因的功能，或通過向基因組中插入新的片段引入新的功能，是研究基因功能的重要技術手段之一[22]。Foc4 構建的質粒型基因編輯方法實用性高、成本低、操作更加方便。前期報道稻瘟菌中穩定表達攜帶Cas9 的質粒會嚴重影響稻瘟菌的轉化效率，可能Cas9 蛋白對稻瘟菌有毒性作用[23]。Foc4 的試驗結果與稻瘟菌的結果不一致，Cas9 單獨轉化攜帶Cas9 的空載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph 到Foc4 后并不影響其致病力。前期曲霉（Aspergillus oryzae）中的研究表明，供體質粒（donor plasmid）環狀質粒HDR 模板介導的重組效率高于線性DNA 片段[24]。

本研究在構建基因編輯的carS-HDR 模板時，將Foc4carS 基因上、下游大約1.2 kb 的同源臂DNA片段進行融合PCR，導入pUC19 載體后，多次試驗仍然無法獲取轉化子，因此，將該融合片段導入pYF11 酵母載體，獲得pYF11-Foc4carS- HDR質粒作為供體質粒用于CRISPR/Cas9 基因編輯。綜上，Foc4carS 基因在次生代謝產物類胡蘿卜素的生物合成中發揮重要作用，可作為香蕉枯萎菌的內源報告基因。以Foc4carS 為靶標基因建立香蕉枯萎菌Foc4 的質粒型CRISPR/Cas9 基因編輯技術，為病原菌的功能基因組學提供有力的技術支撐。