一株自生固氮菌的分離鑒定及其對不同品種香蕉的促生特性

關鍵詞：Klebsiella variicola；胞外氨態氮；香蕉；促生長作用

中圖分類號：S668.1; S154.3 文獻標志碼：A

截至2022年，中國已成為世界第二大香蕉生產國，香蕉（Musa nana Lour.）種植周期短、產量高、見效快、效益好，是我國熱帶、亞熱帶地區農業的支柱性產業，但當前由于環境變化以及香蕉枯萎病等問題，對香蕉產業的發展造成了持續的影響，如何促進香蕉產業綠色、安全和可持續發展已成為大家關注的熱點問題[1]。香蕉是對營養素需求最高的水果品種之一[2]，在其所需的養分中，氮元素占據著重要地位，氮能有效地影響植物光合作用過程以及光合同化物在植物各器官中的分布，影響干物質的積累、植物和果實的發育等[3]，香蕉種植者常施用氮肥以最大限度地提高生產力， 如在苗期會施入大量氮肥，但是過量使用氮肥不僅會使土壤酸化、鹽堿化加劇[4]， 而且可能使植株更容易受到病原菌的侵害并且增加植株感病的嚴重程度，如香蕉枯萎病[5]。氮肥的主要形式是銨、尿素和硝酸鹽， 研究結果表明， 硝酸鹽肥料降低了鐮刀菌枯萎病的嚴重程度，而銨增加了其嚴重程度[6]，種種情況表明完全依賴化學氮肥終究不是長久之計。

固氮菌可提高土壤肥力，以分子態氮為氮素營養，將其還原為NH3，再合成氨基酸、蛋白質，其包括自生固氮菌、共生固氮菌和聯合固氮菌3種[7]。其中共生固氮菌與相應植物形成的固氮共生體系，被認為是自然界中固氮效率最高的自然固氮系統，但是只有與植物互利共生時，才能固定空氣中的分子態氮，存在一定的限制性；聯合固氮菌是必須生活在植物根際、葉面或動物腸道等處才能進行固氮作用；自生固氮菌廣泛存在于自然界的土壤和水中，包括多種生理類型的種類，如光能自養、好氧性的念珠藍細菌屬（Nostoc），光能自養、專性厭氧的著色菌屬（Chromatium），光能異養、兼性厭氧的紅螺菌屬（Rhodospirillum），化能異養、好氧性的固氮菌屬（Azotobacter），化能異養、專性厭氧的巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）和化能異養、兼性厭氧的克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等。相比于其他類型的固氮菌，自生固氮菌雖然固氮效率較低，但其對環境適應能力強，不依附于植物而生存，自身能從空氣中吸收氮氣，繁殖后代，并且死亡后，細胞蛋白質在土壤中礦化，仍然有助于植物的氮素利用，自生固氮菌作為植物促生菌（PGPR）[8]，不僅可以通過固氮作用提高氮的利用率促進植物生長[9]，還能提高對磷素的利用率[10]，更有研究表明，固氮菌的存在能影響土壤中碳元素和硫元素的含量比重，加速土壤中殘留有機物的礦化，從而減少植物根系對土壤中重金屬離子的吸收[11]，此外，固氮菌還可以通過合成植物相關生長激素直接影響植物生長， 這些激素不僅可以促進植物生長和養分吸收， 還可以間接保護宿主植物免受植物病原菌的影響， 并刺激其他有益的根際微生物[12-13]，對于改良土壤有機氮含量，增加農作物產量有著不可忽視的作用。

本研究從海南省霸王嶺野生香蕉（Musa nanaLour. sp）根際土壤中分離出一株自生固氮菌BWLY3X-6（本實驗室自主命名），通過對其分離純化、固氮酶基因nifH 的檢測、16S rRNA 序列及gyrB 序列鑒定，明確其種屬關系；通過靛酚藍-分光光度法和微生物固氮酶試劑盒分別測定其固氮能力和酶活，并以不同香蕉品種作為試驗對象，研究其在一定濃度范圍內對香蕉生長的促生影響，以期為該菌株的田間應用提供理論依據和科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 自生固氮菌BWLY3X-6 分離自以“Z”字型取樣法挖取的海南省霸王嶺的野生香蕉（Musa nana Lour. sp）根際土壤[14]。

1.1.2 供試香蕉品種 供試香蕉品種為五葉一心的巴西蕉（Musa acuminata AAA Cavendish cv.Baxi）與南天黃（M. acuminata AAA Cavendish cv.Nantianhuang）杯苗，均由中國熱帶農業科學院種苗組培中心提供。

1.1.3 培養基LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉15 g、ddH₂O 定容至1000 mL，調節pH 至7.0～7.2。

Ashby 無氮培養基：甘露醇10 g、KH₂PO₄ 0.2 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO₄·₂H₂O 0.1 g、CaCO₃ 5 g、瓊脂粉15～20 g、ddH₂O定容至1000 mL，調節pH 至7.2～7.4。

生理生化鑒定所用培養基配制參照《微生物學實驗》[15]中的方法。

1.1.4 主要試劑 2×Taq PCR Mix 購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA maker 購自天根生化科技（北京）有限公司；Goldview 核酸染料、5×TBE 溶液，均購自biosharp 生物科技有限公司；微生物固氮酶（nitrogenase）ELISA 試劑盒購自煉石商城；其余所用試劑均為分析純。

1.1.5 主要儀器 梅特勒- 托利多電子天平PL303-IC，單人單面超凈工作臺SW-CJ-1FD，智能生物顯微鏡NI/E，透射電子顯微鏡HT7700，臺式冷凍離心機Eppendorf 5810R，紫外分光光度計UV2600，微量紫外分光光度計ND2000C，梯度PCR 儀Arktik96，凝膠成像系統Fire Read，電泳儀電源DYY-6C。

1.2 方法

1.2.1 自生固氮菌的分離與鑒定 （1）自生固氮菌的初篩與純化。提前準備好裝有90 mL 滅菌水的三角瓶若干，精確稱取10 g 挖取的土壤[16]，分別置于三角瓶中，于室溫下、180 r/min 震蕩20～30 min，震蕩完畢后取出，將其中的懸濁液稀釋為10^–1、10^–2、10^–3 三個數量級，吸取不同稀釋倍數的懸濁液各100 μL，滴加于Ashby 無氮固體培養基中，涂棒涂抹均勻，每個稀釋倍數重復3 次，置于28 ℃培養箱中培養2～3 d，觀察。挑取長勢優的單菌落在LB 固體培養基上對其進行純化，采用平板劃線法進行反復劃線，培養、觀察其單菌落形態，得到純菌落后甘油保存，便于后續試驗。

（2）自生固氮菌的鑒定。形態學觀察：將篩選的單菌落接種于液體LB 培養基中，37 ℃、180 r/min搖床培養10 h，取5 μL 菌液吸附于銅片[17]制片，在透射電子顯微鏡下觀察自生固氮菌形態。

生理生化鑒定：對分離菌株進行葡萄糖氧化發酵試驗、檸檬酸鹽試驗、甲基紅（M.R.）試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗，具體方法參照《微生物學實驗》[15]。

固氮酶基因nifH、16S rRNA 序列與gyrB 序列鑒定：參考堿裂解法[18]提取固氮菌菌株DNA。固氮酶基因nifH 擴增引物為nifH P1（5?-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3?）和nifHP2（5?-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3?）。16S rRNA 序列PCR 擴增引物為27F（ 5?-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3? ） 1492R（5?-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3?）；gyrB基因序列擴增引物為UP-1 （ 5?-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3?）和UP-2r（5?-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3?）。反應體系為：模板1 μL，10 mmol/L 引物各1 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，用ddH₂O 補至25 μL。16S rRNA序列PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃再延伸10 min。gyrB 序列PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃再延伸10 min。反應結束后對產物分別進行回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，使用NCBI 進行序列比對，同時通過MEGA7.0.26 軟件對菌株構建系統發育樹，結合形態學觀察結果與生理生化鑒定的結果確定菌株種屬。

1.2.2 菌株固氮能力測定 采用靛酚藍-分光光度法測定自生固氮菌的固氮能力，參考梁劍光等[19]優化后的方法進行測定。

（1）檢測試劑的配制。所用試劑包括氨態氮標準液、1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液、溶液A、溶液B。氨態氮標準液：精確稱取0.2358 g （NH₄）₂SO₄溶于100 mL 水中，得到氨態氮含量為500 μg/mL的氨態氮原液，再將其稀釋10倍，得含量為50 μg/mL 的氨態氮標準液。

1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液：精確稱取0.3622 gNa₂Fe（CN）₅NO·2H₂O，加水定容到25 mL，于4 ℃存放，所用試劑為國產分析純。

溶液A：精確稱取5.00g 苯酚，量取2 mL1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液，混合溶于500 mL 水中，遮光4 ℃保存（暴露光照中呈現紅棕色）。

溶液B：精確稱取2 g C₆H₅Na₃O₇、2.50 gNaOH，量取3.5 mL NaClO，混合溶于500 mL 水中，遮光4 ℃存放。

（2）氨態氮標準曲線的制定。取11 支試管，依次編號，按表1 中加入相應的各種試劑，渦旋混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中，顯色反應20 min，取出冷卻至室溫，于637nm 波長下測定其OD值，觀測記錄數據，繪制氨態氮標準曲線（圖1），對應方程為y=0.0633x+0.0649（R²=0.9973）。

（3）樣品的制備。將固氮菌菌體按照1%的接種量接種于Ashby 液體培養基中，在無氮環境下，固氮菌會利用空氣中的氮氣進行固氮作用，將大氣中的氮還原成氨，氨極易溶于水，菌體在28 ℃、180 r/min 搖床中培養約20 h 后，將其取出，吸取部分液體于8000r/min 下離心10 min，取100μL上清液，收集至無菌EP 管中即為待測樣品，重復3 次[20]。

按1.2.2-（2）中所述，取待測樣品，加入相應試劑，顯色測定其OD₆₃₇ 值。

1.2.3 固氮酶活性的測定 采用微生物固氮酶（nitrogenase）ELISA 試劑盒（酶標生物）測定菌株固氮酶活性，按試劑盒說明書進行測定。

1.2.4 自生固氮菌對香蕉的促生作用 （1）自生固氮菌BWLY3X-6 的培養。處理方法參考程杰杰等[21]的方法，略有改動，將供試菌株接種于滅菌液體LB 培養基中，接種量為1%，置于37 ℃、180 r/min 搖床中搖培約10 h（涂布LB 平板計算其濃度約為3.73×10⁸ CFU/mL），然后在冷凍離心機中以4000 r/min 離心10 min，棄上清液，以無菌水重懸菌體沉淀，重復2 次，最后將重懸的菌液稀釋為10⁴、10⁶、10⁸ CFU/mL 三個不同濃度梯度，備用。

（2）不同香蕉品種的接種處理。不同香蕉品種之間分別設置5 個處理：空白對照、0.5%尿素、固氮菌菌液3 個濃度梯度（10⁴、10⁶、10⁸ CFU/mL），每個處理5 株苗，重復3 次。處理期間每天按時向杯苗中補充適量水分，保證其土壤的濕潤環境，每隔3 d 對試驗香蕉的莖基部施加1 次固氮菌菌液，每次每株為1 mL，空白對照施加等量無菌水，尿素處理施加等量0.5%尿素，共計接種14 次。香蕉盆栽杯苗經處理60 d 后，測定每株香蕉的株高、莖高、莖圍、根長、地上部鮮重與地下部鮮重[22]。

1.3 數據處理

利用Excel、SPSS 26 軟件進行試驗數據統計與差異顯著性分析，利用MEGA 7 軟件構建系統發育樹，利用GraphPad Prism 8 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 固氮菌的分離與鑒定

2.1.1 固氮菌分離、形態觀察及生理生化特征在野生香蕉根際土壤中經Ashby 無氮固體培養基多次篩選后得到菌株BWLY3X-6。菌落在LB 平板上呈淡黃色不透明狀，外表圓形且濕潤，邊緣清晰，易挑起（圖2）。透射電鏡下觀察到菌體為桿狀，有莢膜，無鞭毛，菌體大小約為2.78 μm×1.14 μm（圖3）。葡萄糖氧化發酵試驗陽性，檸檬酸鹽試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，產吲哚試驗陽性，接觸酶試驗陽性，明膠液化試驗陽性，甲基紅（M.R）試驗陰性。

2.1.2 固氮酶基因nifH 的檢測及基于16S rRNA與gyrB 序列的系統發育分析 利用固氮酶基因nifH 引物從BWLY3X-6 菌株基因組序列中擴增獲得307 bp 的片段（圖4）。BWLY3X-6 菌株的16SrRNA 與gyrB 序列長度分別為1445、1187 bp。采用鄰位法構建生物系統發育樹，基于16S rRNA序列構建的系統發育樹中，與菌株同源性最高的是Klebsiella variicola strain 03-311-0071，相似度達99.65%（圖5）；基于gyrB 序列構建的系統發育樹中，與菌株同源性最高的是K. variicola strainLMG 23571，其相似度達99.83%（圖6）。

綜合形態特征、生理生化特征、nifH 基因檢測及16S rRNA、gyrB 序列的分析結果， 將BWLY3X-6 菌株鑒定為Klebsiella variicola。

2.2 菌株固氮能力

2.2.1 菌株分泌氨態氮含量 通過測得吸光度，代入標準曲線得到氨態氮含量，經計算，菌株分泌的氨態氮含量為（17.98±1.88）μg/mL。

2.2.2 菌株固氮酶活性 經固氮酶活性測定，菌株BWLY3X-6 的固氮酶活性為（220.51±8.21）ng/L，表明該菌株有較強的自生固氮能力。

2.3 菌株BWLY3X-6 對不同香蕉品種的促生作用

如表2 所示，施用菌液濃度為106 CFU/mL 時對南天黃香蕉的促生作用最明顯，與CK 相比，除莖高與地下部鮮重外，其余生物量指標間均呈顯著差異，其中株高增加25.9%，莖圍增加18.2%，根長增加43.5%，地上部鮮重增加46.3%；與尿素處理相比，呈顯著差異的生物量指標中，施用菌液濃度為106 CFU/mL 的株高增加25.5%，莖圍增加19.0%，根長增加53.8%，地上部鮮重增加54.7%，地下部鮮重增加37.7%，高濃度時促生效果反而有所下降。

而對于巴西蕉而言，如表3 所示，菌液低濃度時促生效果不明顯，甚至與CK 相比在一定程度上有所抑制，而施用菌液濃度在106、108 CFU/mL時均有明顯促生作用，與CK 相比，各項生物量指標均呈顯著差異，其中108 CFU/mL 處理的株高增加37.8%，莖高增加26.3%，莖圍增加28.5%，根長增加54.6%，地上部鮮重增加68.6%，地下部鮮重增加84.3%；與尿素處理相比，呈顯著差異的生物量指標中，108 CFU/mL 處理的莖圍增加11.7%，根長增加69.6%，地上部鮮重增加29.6%，地下部鮮重增加49.7%。表明菌株BWLY3X-6 對南天黃和巴西蕉均具有顯著促生長作用，且對巴西蕉的促生作用較南天黃更有優勢，而各項生物量變化中，根長變化量最明顯，菌株BWLY3X-6對植株根部的作用效果顯著。

3 討論

生物固氮過程通過高度敏感的細菌酶將大氣中的氮氣轉化為氨，從而提供生態上可接受的礦質氮肥的補充或替代品，本研究通過靛酚藍-分光光度法對菌株的固氮能力進行測定，與曹晶晶[23]所篩菌株的分泌氨態氮含量（9.8 μg/mL）和李瓊潔等[24]所篩菌株的分泌氨態氮含量（2.51 μg/mL）相比，證明本研究所篩菌株具有更強的固氮能力，在無氮環境下也能通過自身固氮作用維持自身生長，豐富了高效固氮微生物接種劑菌種資源庫。

隨著對固氮菌研究的深入，人們發現通過接種固氮菌， 作物產量得到了顯著提高[25]。據BHATTACHARJEE 等[26]報道，在田間條件下，使用固氮菌作為生物肥料可以提高各種作物的生長和產量，與傳統肥料相比，花椰菜和玉米的增幅分別高達40%和15%～20%。而魏春燕等[27]、尹坤等[28]的研究分別證明了變棲克雷伯氏菌對甘蔗、水稻具有明顯的促生效應。目前，國內外關于固氮菌對香蕉品種促生長作用的報道較少，本研究從野生香蕉根際土壤中分離的自生固氮菌Klebsiella variicola 分別接種于南天黃和巴西蕉盆栽苗后，多項生物量指標呈顯著性差異，這與LIN等[29]的研究結果相似，證明菌株BWLY3X-6 對南天黃和巴西蕉生長具有顯著的促生長作用，其中又以根長變化最為顯著， 分別增加43.5% 和54.6%。香蕉根部在植株發育過程中發揮著重要作用，不僅可以吸收營養物質還能起到固定植株的作用，推測分離菌株主要通過影響香蕉根部來實現對香蕉的促生作用。

4 結論

本研究從分離的自生固氮菌Klebsiellavariicola 成功克隆到固氮酶基因nifH，從分子水平上證明了分離菌株具有固氮的遺傳基礎，固氮促生試驗證明了該菌株對不同香蕉品種均具有顯著的促生效果，在一定程度上為固氮菌在香蕉種植管理上的應用提供參考，但由于本研究所用材料為盆栽杯苗，所以存在一定的局限性，其在大田中的應用效果還有待于進一步的驗證。