滿天星莖腐病中一種新病原菌的分離與鑒定

關鍵詞：滿天星；莖基腐；南方鐮孢菌

中圖分類號：S436.8 文獻標志碼：A

滿天星（Gypsophila paniculata L.），原名為重瓣絲石竹，別名霞草、白孔雀草、絲石竹等，原產地中海沿岸，在我國原產于新疆北部及西部，生于海拔1000～1500 m 地區。系石竹科絲竹屬的一年生草本花卉，是當今世界最流行的鮮切花配花之一[1-3]。重瓣滿天星花不育，生產上采用扦插種植，但該方法繁殖系數低，無法滿足市場需求，組培快繁是生產優質種苗的主要途徑[3-4]。滿天星的用途廣泛，根、莖可供藥用，集觀賞、藥用于一體[5]。云南省昆明地區的滿天星種植始于20 世紀90 年代初，經過20 多年的發展已成為云南省主栽鮮切花之一，云南昆明是全國種植面積最大的地區之一，產品銷往全國各地，部分遠銷我國臺灣、香港，以及新加坡、馬來西亞、菲律賓等地[6-7]。

鐮刀菌屬（Fusarium spp.）是世界性的重要病原真菌之一，寄主植物達100 余種，侵染包括糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物等，主要為害植物的根、莖、花等部位，引起植物的根腐、莖腐、穗腐等多種病害，在世界范圍內造成許多毀滅性的植物病害，如黃色鐮刀菌（F.culmorum）造成的甘蔗頂腐病，串珠鐮刀菌（F.moniliforme）造成的巴拿馬香蕉萎蔫病，以及茄病鐮刀菌（F. solani）導致世界范圍的根腐病等[8]。鐮刀菌侵染寄主植物維管束系統，產生毒素為害作物，導致作物枯萎死亡，降低作物的產量和品質，造成巨大的經濟損失。據統計，全世界每年因鐮刀菌引起的農產品損失高達數百億美元[9-11]。

禾谷鐮刀菌是一個復合種Fusarium graminearumspecies complex（FGSC），從O’DONNELL等[12]采用宗系譜法（GCPSR）劃分種至今，已經至少確認由16 個種構成，包括亞洲鐮孢菌（F.austroamericanum）、南方鐮孢菌（F. meridionale）、布氏鐮孢菌（F. boothii）、禾谷鐮孢菌（F. graminearumsensu stricto）、蒲葦鐮孢菌（F. cortaderiae）等。禾谷鐮孢復合種（FGSC）是禾谷作物的重要病原菌，如小麥赤霉病（FHB）主要由禾谷鐮孢復合種（FGSC）引起，是小麥的一種重大的真菌流行病害，造成小麥嚴重減產[13-14]。其中禾谷鐮孢菌是世界范圍內小麥赤霉病最常見的致病菌，但據張昊[15]報道南方鐮孢菌也能引起我國小麥赤霉病，另外ZHOU 等[16]報道南方鐮孢菌是引起玉米穗腐病的主要致病菌之一，周潔等[17]報道南方鐮孢菌還能引起魔芋干腐病。

滿天星病害種類較多，常見病害有真菌性病害，包括由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病，由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病，由Erysiphe buhrii 引起的白粉病，由疫霉屬（Phytophthora spp.）、腐霉屬（Pythiumspp.）、絲核菌屬（Rhizoctonia spp.）以及鐮刀菌屬引起的莖腐病、根腐病等腐爛病。除真菌性病害外，還有由細菌引起的冠癭病等，以及由支原體、病毒和線蟲引起的病害。由鐮刀菌屬引起的滿天星莖腐病，早期癥狀出現莖基部周圍變色，上部葉片輕微萎蔫，晚期癥狀出現冠腐、根腐，嚴重萎蔫，最終導致植株死亡，造成經濟損失[18]。在國外關于該病的報道較多，國內鮮有報道，目前已報道的滿天星莖腐病主要由尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[19]、黃色鐮刀菌[20]、茄病鐮刀菌[21]、禾谷鐮孢菌[21]引起，但未見南方鐮孢菌引起滿天星莖腐病的相關報道，這是我國首次報道由南方鐮孢菌引起滿天星莖腐病。因此，本文從滿天星莖腐病的發病癥狀、病原物的分離與鑒定等方面對滿天星莖腐病進行研究，為今后花卉生產的病害預防與控制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣采集 2021 年3 月在云南省昆明市西山區海口鎮（24.80°N， 102.60°E）采集滿天星（云星4 號）莖腐病樣品，分裝到自封袋后帶回實驗室，備用。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

康乃馨葉片培養基（CLA）：康乃馨葉片剪成3～5 mm 小段，濕熱滅菌，將滅菌的康乃馨葉片在無菌操作臺中放入水瓊脂固體培養基中，每皿5～6 片。

綠豆液體培養基：稱取綠豆30 g，綠豆洗凈后放入沸水中煮至開花，用紗布過濾，自然pH，將濾液用蒸餾水定容至1000 mL后分裝到100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用稍作改良的常規組織分離法[22]，從滿天星莖部切下約10 mm×3 mm 的病害組織，清水洗凈表面雜質，用70%酒精浸泡30 s，再用0.5%次氯酸鈉漂洗2 min，最后用滅菌水漂洗3 次，濾紙片吸干，將病組織接入PDA 培養基，置于25 ℃下恒溫培養3～5 d。待菌落長出后，挑取菌落至新的PDA 培養基上培養，純化后菌種置于?80 ℃保存，備用，將該菌株命名為KMHK4-2。

1.2.2 病原菌的致病性檢測 根據柯赫氏法則，分別用滿天星組培苗和盆栽苗進行致病性試驗。

（1）滿天星組培苗致病性試驗。對10 株滿天星組培苗進行分離物的致病性試驗。參照方中達[22]的接種方法，對滿天星的莖部進行接種，用無菌注射器將濃度為1×105 個/mL 的孢子懸浮液緩慢注入莖部。將10 μL 孢子懸浮液或無菌水對照的接種量施加到莖部。植物在組織培養室中以12 h 的暗光循環在（24±2）℃下培養7 d 后，觀察并記錄發病情況。

（2）滿天星盆栽苗致病性試驗。對10 株滿天星盆栽苗進行分離物的致病性試驗。參照LEE等[23]的滿天星病原菌接種方法，將健康滿天星植株的根和莖基部浸入濃度為1×105 個/mL 的孢子懸浮液，15 min 后將其轉移至無菌土壤中，在潮濕的室內保持72 h，然后移至溫室。用滅菌水處理的植株作為對照。接種7 d 后，觀察并記錄發病情況。致病性測定重復3 次。

1.2.3 病原菌的鑒定 （1）形態學鑒定。主要依據LESLIE 等[24]的形態學分類鑒定方法，將分離物接種到PDA 培養基上，置于25 ℃培養箱恒溫培養，培養5 d 后觀察記錄菌落形態特征；使用CLA 培養基和綠豆液體培養基誘導產孢，待產孢后，利用顯微鏡觀察并測量孢子大小。

（2）分子生物學鑒定。以形態學鑒定結果為基礎，選取分離到的菌株接種到PDA 培養基上，28 ℃恒溫培養5 d，取0.1 g 菌絲，采用CTAB 法[25]提取病原菌基因組的DNA。采用rDNA-ITS 擴增進行病原菌屬水平的鑒定，采用翻譯延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α， TEF-1α）擴增進行病原菌種的鑒定。rDNA-ITS 基因擴增采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[26]；TEF-1α 基因擴增采用引物EF1T（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′）和EF2T（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）[27]（由北京擎科生物有限公司合成）進行PCR 擴增后，委托北京擎科生物科技股份有限公司進行純化和測序。將測序所得的DNA 序列與NCBIGenBank 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和Fusarium-ID 鐮刀菌數據庫（https：//www.fusarium.org）中進行同源性比對，同時將DNA序列上傳到NCBI 數據庫獲得序列登錄號。利用Mega 7.0 軟件構建系統發育樹， 采用鄰接法（neighbour-joining， NJ），bootstrap value 設置為1000，確定該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 滿天星莖腐病的發病癥狀

滿天星莖腐病發生在幼苗期間，在所調查的滿天星大棚基地內，該病害發病率約為10%。受感染的植株中，典型的癥狀是萎蔫和莖腐爛，在早期發病癥狀的植株中發現其根部尚未見壞死（圖1）。

2.2 滿天星致病性測定

如圖2和圖3 所示，通過滿天星組培苗和盆栽苗接種分離物7d后，觀察到植株莖部腐爛和萎蔫癥狀，而在CK 植株上未觀察到發病癥狀。柯赫氏法則證明該真菌分離物可造成滿天星組培苗、盆栽苗表現出與田間病株相似的癥狀，并分離獲得與滿天星病株初分離物菌落形態相同的真菌菌株。

2.3 滿天星莖腐病標樣中致病菌的分離鑒定

2.3.1 病原菌形態特征 將在滿天星莖基部分離到的病原菌（KMHK4-2）接入PDA 培養基，置于25 ℃恒溫箱中培養，菌絲生長迅速并產生大量的致密氣生菌絲，在PDA 培養基上菌絲顏色從白色到淡橙色、黃色不等，PDA 培養基背面有暗紅色色素沉積，培養5 d 后，菌落可長滿直徑為9 cm的培養基（圖4A，圖4B）。

挑取菌落至CLA 培養基中誘導其產孢，于25 ℃恒溫培養15 d，在顯微鏡下可見少量大型分生孢子，大型分生孢子相對細長，呈鐮刀形，腹面較平直，背側呈拱形，3～6 個隔膜，未見小型分生孢子。從PDA 培養基中打下菌餅，置于綠豆液體培養基中，于25 ℃搖床培養5～7 d 產生大量分生孢子，分生孢子形態與CLA 培養基中基本一致，具有3～6 個隔膜，未見小型分生孢子，分生孢子大小為（21.1～57.9）μm×（2.7～5.1）μm（n=100）（圖4C）。根據病原菌的形態特征，參考LESLIE等[24]的形態學分類鑒定方法，將滿天星莖腐病的病原初步鑒定為廣義上的禾谷鐮刀菌，即禾谷鐮孢復合種（ F. graminearum species complex，FGSC）。

2.3.2 分子生物學鑒定 選取ITS 和TEF-1α 基因序列對菌株KMHK4-2 的基因組DNA進行PCR擴增，分別獲得大小為519、650 bp 的片段。將分離物ITS 和TEF 的序列提交至GenBank，獲得登錄號ITS（Accession No. OP257274）、TEF（AccessionNo. OP302808），在GenBank 數據庫和Fusarium-ID數據庫中進行同源性檢索。菌株KMHK4-2 的ITS序列在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，結合形態學觀察和構建系統進化樹（圖5），該菌株初步鑒定為禾谷鐮孢復合種。為進一步明確該菌株的具體種類，擴增TEF-1α 基因片段，將測序結果與NCBI的Gen Bank 數據庫和Fusarium-ID 數據庫進行同源性比對，結果顯示菌株KMHK4-2 的序列與南方鐮孢菌（F. meridionale）DS27（MN629330.1）、CBS110247（AF212435.1）等菌株的相似度達100%。從GenBank 數據庫中下載禾谷鐮孢復合種的模式菌株序列，采用Mega 7.0 軟件中的neighbourjoining法構建系統進化樹（圖6）。從進化樹可以看出，菌株KMHK4-2 的TEF-1α 序列與南方鐮孢菌的不同菌株聚在同一分支。綜上所述，結合形態學鑒定和分子生物學鑒定，將KMHK4-2 確定為南方鐮孢菌（F. meridionale）。

3 討論

ITS 序列因其間隔序列較短，利于PCR 的擴增，被廣泛應用于真菌分類的標記序列，但ITS作為rDNA 中的中度保守區，對部分間隔區差異性較小的真菌（如鐮刀菌屬），只適合屬水平上的鑒定，對屬內種的鑒定并不適合[28]。本研究在NCBI 數據庫進行BLAST 比對過程中也發現，只能將病原菌鑒定到鐮刀菌屬，無法將其準確鑒定到具體種。TEF-1α 序列是編碼蛋白翻譯裝置的主要部分，在鐮刀菌種水平上含有豐富的信息量，分辨率高，與ITS 序列相比種間差異更大，且具有穩定性和多樣性，目前在鐮刀菌種類鑒定上應用廣泛，可作為對鐮刀菌種類劃分的一個重要補充[29-31]。DONG 等[32]通過形態學和TEF-1α 序列鑒定并首次報道了水稻上的一種赤霉病菌為南方鐮孢菌。因此，為進一步準確鑒定到具體的種，在ITS 序列的基礎上結合TEF-1α 序列分析，將鐮刀菌鑒定到具體的種。

通過DNA 標記進行真菌鑒定最廣泛使用的算法是基于序列比對的搜索工具（BLAST），可以在NCBI 的GenBank 網站上獲得，這是一種快速而有效的方法，該數據庫可以提供大量信息，但存在大量鑒定錯誤的菌株和必須過濾掉的低質量序列，必須仔細分析其結果[33-34]。O’DONNELL等[35]和GEISER 等[36]在系統發育分析中發現，使用的一些序列似乎與錯誤的鐮刀菌名稱有關，可能是由于使用了所用數據庫中的錯誤序列。Fusarium-ID 數據庫是一個用于鑒定鐮刀菌種、屬的專用數據庫，可進行常規分離菌株的序列相似性分析[37]。因此，本研究為了更準確地鑒定，在NCBI基礎上結合Fusarium-ID 數據庫進行序列檢索。

滿天星是一種主要作為填充切花的世界性作物，由土壤傳播病原體引起的真菌病害中，疫霉病和立枯病是世界上最具毀滅性的滿天星病害。在栽培過程中，腐霉屬和立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）尤其具有危害性。在成熟植株中，鐮刀菌屬會造成基部組織腐爛，導致植株死亡[18]。由鐮刀菌屬侵染造成的滿天星腐爛，在阿根廷、以色列、韓國、波蘭均有相關報道[18]，這些鐮刀菌屬病原菌包括擬輪枝鐮孢菌（F. verticillioides）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）、串珠鐮刀菌、黃色鐮刀菌、茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌。其中，20世紀90年代在阿根廷，禾谷鐮刀菌被WOLCAN 等[21]首次確定為滿天星莖腐病的病原菌，但僅鑒定為禾谷鐮孢復合種，未確定具體的亞種。該研究還強調禾谷鐮刀菌很少感染滿天星的根部，在受感染的情況下，莖基部組織出現壞死，顏色呈黑褐色并開始擴散，枯萎的葉片仍然長在莖上。側芽數量減少，作物的生命周期縮短，造成一定的經濟損失。滿天星莖腐病在中國鮮有報道，據查詢文獻，這是我國首次報道由南方鐮孢菌引起的滿天星莖腐病，本研究為滿天星的病害監測和綜合治理提供了理論基礎。

鐮刀菌屬除了能引起世界性病害，在農業生產上造成嚴重的經濟損失，還能產生多種毒枝菌素的次級代謝物污染農產品，嚴重威脅人類及動物健康。因此，測定南方鐮孢菌產生的毒素類型是下一步的研究方向，植物病原菌毒素的研究將為新型殺菌劑的開發提供理論依據。