離子交換樹脂分離純化天然橡膠乳清中麥角硫因

關鍵詞：天然橡膠乳清；麥角硫因；離子交換樹脂

中圖分類號：TQ332 文獻標志碼：A

麥角硫因（L-ergothioneine，EGT）是一種天然氨基酸類強抗氧化劑，化學式為C₉H₁₅N₃O₂S，具有抗氧化、維持DNA 的生物合成、細胞的正常生長和細胞免疫等多種生物活性[1]，也因其具有抗輻射、美白和抗衰老等功效而應用于高端化妝品中[2]。自2005 年發現EGT 轉運蛋白（ETT/OCTN1）以后，EGT 逐漸成為研究的熱點，與之相應的針對該化合物的報道也呈指數級增長[3]。自然界中，EGT 主要由微生物合成，植物和動物自身不能合成，只能從外部攝取[4-5]。EGT 的制備方法有天然生物提取法、化學合成法和生物合成法。天然生物提取法所用原料主要是蘑菇類真菌，但因其含量低，原料成本高，不具備工業化提取價值?；瘜W合成法有溶劑殘留和合成成本高的問題，采用此方法的生產廠家較少。目前工業化生產EGT 主要采用生物合成法，隨著生物合成學的快速發展，大大加快了微生物發酵生產EGT 的研究[6]。目前公開報道制備EGT 的最高水平為發酵220 h產量達到（1.63±0.04）g/L[7]，但受發酵設備及發酵周期的制約，擴大生產規模的成本較高，至今EGT價格依然高達20 萬元/kg，生物合成法還有待更進一步的技術突破。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）是熱帶地區一種重要的經濟林木，所產天然膠乳是一種乳狀水分散體，由約35%的橡膠烴粒子和65%的乳清組成。1968 年TAN 等[8]首次在天然膠乳中發現有EGT，因其是由土壤中的微生物合成[9]，所以受季節、植膠環境的影響較大。筆者對多個樣品檢測發現，EGT 在西雙版納地區所取天然橡膠乳清（NRS）中的含量通常在10～15 mg/L，最高為113 mg/L，最低為2.7 mg/L?？赡芤驗镹RS 中EGT 含量過低，至今未見工業化提取的報道，但相較于生物合成法，NRS 有著一項無可比擬的優勢，我國天然橡膠種植面積為113.33 余萬hm²，干膠產量約為80 萬t[10]，由此產生巨量的NRS，且屬于零成本甚至負成本的EGT 提取原料，因為在制膠廠，NRS 作為高濃有機廢水的處理成本高昂。

本研究通過對比9 種離子交換樹脂對EGT 的吸附-解吸效果，篩選出了效果較好的樹脂型號，并研究了該樹脂的最佳吸附和洗脫條件，經試驗驗證，該樹脂能很好地對NRS 中的EGT 進行分離純化，為從NRS 中工業化提取EGT 提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為：乳清（天然膠乳加酸凝固后擠壓獲得）；麥角硫因（上海麥角硫因生物科技集團有限公司）；0017、S1100 離子交換樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）；SA-2 離子交換樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；D001、D61、D72、D81、JK008、001×10 離子交換樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司）；超濾膜、納濾膜（SUEZ 環境集團）。

儀器設備：4040 型、2540 型膜分離設備（杭州道納膜科技有限公司）；UV-2700 型紫外分光光度計（日本島津制作所）；CHA-SAS 制冷氣浴恒溫振蕩器（常州市金壇區指前鎮旭日實驗儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 上樣液制備 NRS 過2500 Da 超濾膜，濾過液過納濾膜，收集截留液繼續減壓蒸餾至原NRS 體積的1%～2%，濃縮液用1%活性炭70～80 ℃脫色30 min，得到無色乳清處理液，加入5倍體積的去離子水，并用EGT 純品調至所需濃度，備用。

1.2.2 離子交換樹脂預處理 新購樹脂置于燒杯中，用飽和食鹽水浸泡樹脂24 h，然后用去離子水洗滌至上清液無色無異味。用4 倍樹脂體積的1 mol/L 的HCl 溶液浸泡4 h，去離子水洗滌至pH為5 左右，再用4 倍樹脂體積的1 mol/L 的NaOH溶液浸泡4 h，去離子水洗滌至中性，最后用4倍樹脂體積的1 mol/L HCl 溶液浸泡6 h，將樹脂轉換為H 型，用去離子水洗滌至pH 5～6 后備用。

1.2.3 裝柱 取預處理過的樹脂緩慢轉移至層析柱內，柱床體積為50 mL，柱規格為200 mm25 mm，柱內預先加入高度為4 cm 的去離子水，液面上升至距管口2 cm 處結束，待樹脂完全沉下后用去離子水以2 BV/h 速度平衡樹脂柱，去離子水用量為2～3 BV。

1.2.4 EGT 標準曲線建立 精密稱取EGT 純品10 mg，于100 mL 容量瓶中加純水配制成濃度為100 mg/L 的標準品貯備液。分別吸取0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 mL 標準品溶液定容于10 mL容量瓶中，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得一系列濃度梯度的標準品溶液。在波長258 nm 條件下用紫外分光光度計測出標準溶液的吸光度，繪制標準曲線。

1.2.5 離子交換樹脂篩選 稱取2 g 經預處理的濕樹脂，置于150 mL 具塞三角瓶中，加入EGT濃度為1.5 mg/mL，pH 為4.0 的上樣液40 mL，在25 ℃，轉速100 r/min 的搖床中振蕩24 h，使樹脂吸附飽和，取上清液測定溶液中EGT 的濃度，并按公式計算各樹脂對EGT 的靜態吸附容量（Q）和吸附率（X）。

將吸附飽和的樹脂濾去殘液，用去離子水洗滌2 次，加入質量濃度0.5%的氨水40 mL，在25 ℃，轉速100 r/min 的搖床中振蕩解吸12 h，取上清液測定EGT 含量，并計算解吸率（B）。

式中，Q 為樹脂對EGT 的靜態吸附容量，mg/g；X 為樹脂對EGT 的吸附率，%；B 為洗脫液對EGT的解吸率，%；C₀ 為EGT 的初始濃度，mg/mL；C₁ 為吸附結束后溶液中EGT 濃度，mg/mL；V₁為所加入的上樣液體積，mL；m 為樹脂的質量，g；C₂ 為解吸液中EGT 濃度，mg/mL；V₂ 為所加入的解吸液體積，mL。

1.2.6 無機鹽濃度對樹脂吸附的影響 稱取2.00 g 預處理好的SA-2、D61 樹脂各4 份，依次加入50 mL、pH 4.0 濃度為2.5 mg/mL 的EGT 標準品配制液，其中NaCl 濃度分別為0、0.1、0.5、1 mol/L，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min持續振蕩6 h，測定上清液中的EGT 含量，通過靜態吸附容量考察無機鹽對吸附的影響。

1.2.7 SA-2 陽離子交換樹脂靜態吸附動力學曲線 稱取4 g 經預處理的濕樹脂，置于250 mL 具塞三角瓶中，加入EGT 濃度為2.5 mg/mL，pH 4.0的上樣液100 mL，分別于吸附0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h 時取0.5 mL 上清液，測定吸光值，依據標準曲線計算上清液的EGT 含量和吸附量，繪制SA-2 樹脂靜態吸附曲線。

1.2.8 pH 對樹脂吸附的影響 稱取2.00 g 預處理好的SA-2 樹脂6 份，依次加入40 mL pH 分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，濃度為1.5 mg/mL的上樣液，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min持續振蕩24 h，測定上清液中的EGT 含量，通過靜態吸附容量確定最佳pH。

1.2.9 氨水濃度對解吸率的影響 稱取2.00 g 預處理好的SA-2 樹脂6 份，依次加入50 mL pH 4.0濃度為2.5 mg/mL 的上樣液，密封置于25 ℃水浴搖床上，100 r/min 持續振蕩24 h，抽濾洗滌樹脂，分別加入濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%和5%的氨水溶液50 mL 解吸12 h，測定上清液中的EGT 含量，通過解吸率確定最佳氨水濃度。

1.2.10 上樣液濃度對樹脂吸附的影響 配制pH為4.0，EGT 濃度分別為2.5、5.0 和10 mg/mL 的上樣液，以2 BV/h 的流速進行上樣吸附，當流出液中EGT 濃度達到上樣液濃度的10%時為EGT的穿透點，停止上樣。用2 BV 去離子水洗滌樹脂，收集流出液和洗滌液，測量其體積和EGT 濃度，計算樹脂的吸附量，考察不同上樣液濃度下樹脂對EGT 的吸附效果。

1.2.11 上樣液流速對樹脂吸附的影響 取3 份處理好的SA-2 樹脂各50 mL 裝柱，將EGT 濃度為5 mg/mL、pH 4.0 的上樣液上柱，分別控制上樣液以1、2、3 BV/h 的流速通過層析柱進行動態吸附，當流出液中EGT 濃度達到上樣液濃度的10%時，停止上樣，測定流出液中EGT 含量，通過吸附量確定最佳上樣液流速。

1.2.12 洗脫流速對洗脫效果的影響 SA-2 樹脂吸附完成后，用2 BV 的去離子水洗柱，用濃度0.5%的氨水溶液分別以1、2、3 BV/h 的流速對樹脂柱進行洗脫，0.5 BV 每管收集洗脫液，測定EGT濃度，繪制洗脫曲線，確定最佳洗脫流速。

2 結果與分析

2.1 靜態吸附試驗

2.1.1 離子交換樹脂的篩選 試驗選用了9 個型號的離子交換樹脂，不同離子交換樹脂對EGT 的吸附量、吸附率和解吸率如表1 所示，SA-2 陽離子交換樹脂對EGT 具有最高的吸附率，D001 和D61 樹脂吸附率相當，但D61 比D001 有著更高的解吸率，綜合考慮，初步選定凝膠型的SA-2和大孔型的D61 兩種樹脂作為后續試驗用樹脂。

2.1.2 無機鹽濃度對樹脂吸附效果的影響 NRS中含有各種無機鹽，能夠被陽離子交換樹脂吸附，對樹脂吸附EGT 具有較大影響。在EGT 純品配制的上樣液中添加不同比例的NaCl，考察無機鹽濃度對樹脂吸附效果的影響，結果如圖1 所示。從圖1 可以看出，0.5 mol/L 及以下的NaCl 濃度對SA-2 樹脂吸附EGT幾乎無影響，甚至0.1 mol/L的低濃度NaCl 會提升SA-2 樹脂對EGT 的吸附。當NaCl 濃度繼續增大時，樹脂對EGT 的吸附量呈下降趨勢，NaCl 濃度達到1 mol/L 時，樹脂對EGT 的吸附量降至39.48 mg/g。而D61 樹脂則受NaCl 的影響較大，當NaCl 濃度由0 增加至0.1 mol/L 時，其對EGT 的吸附量由28.70 mg/g陡降至16.13 mg/g，并隨著NaCl 濃度升高而逐步降低。試驗最終確定SA-2 陽離子交換樹脂作為后續試驗用樹脂。

2.1.3 SA-2 陽離子交換樹脂的靜態吸附動力學曲線 SA-2 陽離子交換樹脂的靜態吸附過程如圖2 所示，在吸附開始的0.5 h 內EGT 快速吸附至SA-2 樹脂內部，吸附量達到31.63 mg/g，吸附率為56.39%，隨后吸附速度明顯降低。這是因為一方面隨著吸附的進行，溶液中EGT 濃度逐漸降低，其與樹脂上的H+交換效率逐漸降低，吸附速度隨之下降；而另一方面，在吸附初期，吸附過程處于液膜擴散階段，溶液中的EGT 被快速吸附至樹脂表面，隨著吸附時間的延長，吸附進入膜擴散和粒內擴散階段，溶液中的EGT 受到樹脂表面以及樹脂孔隙產生的阻力增加，擴散速度逐漸降低[11]，24 h 后吸附量最終達到54.88 mg/g，吸附率達到97.96%。

2.1.4 pH 對吸附效果的影響 pH 對離子交換平衡有著重要影響，其通過影響溶液中物質的帶電性從而影響離子交換樹脂的交換容量[12]。工廠內天然膠乳加酸凝固后獲得的乳清pH 一般在4～5之間，試驗選定pH 測試范圍為2.5～5.0。如圖3所示，SA-2 樹脂對EGT 的吸附隨pH 的升高呈現先升高后降低的趨勢，當pH 在3.0～4.0 之間時，SA-2 樹脂對EGT 的吸附量較大，吸附量范圍為19.77～20.00 mg/g，pH 2.5 或4.8 時吸附量相當，分別為18.60 mg/g 和18.64 mg/g，整體而言，在試驗范圍內，pH 對吸附效果有一定影響，但影響較小。

2.1.5 洗脫液濃度對解吸率的影響 試驗采用易于蒸餾去除的氨水作為洗脫劑，氨水濃度對解吸率的影響如圖4 所示。由圖4 可知，0.1%質量濃度的氨水溶液對EGT 的解吸率較低， 只有35.52%，當氨水質量濃度達到0.5%時，解吸率達到最高72.92%，隨著氨水濃度的繼續升高，解吸率呈逐漸下降趨勢，這是因為洗脫液中的NH4+對離子交換樹脂表面的雙電層不僅有交換作用，還有壓縮作用，隨著洗脫液濃度的增大，樹脂反離子的擴散層被壓縮，擴散層中部分反離子變成固定層中的反離子，擴散層的活動范圍變小，從而影響了洗脫效果。當氨水質量濃度達到5%時，解吸率降至63.27%，試驗最終確定最佳洗脫液的氨水質量濃度為0.5%。

2.2 動態吸附試驗

2.2.1 上樣液濃度對樹脂動態吸附效果的影響NRS 中的EGT 非由橡膠樹合成，不同季節、不同植膠環境都有可能導致EGT 含量的差別，這也導致制備的乳清處理液中EGT 的濃度會有較大差異。試驗初期，實驗室內制備的乳清處理液中EGT濃度僅為1.5 mg/mL 左右，后提高到2.5 mg/mL，目前可以達到5 mg/mL，隨著技術成熟，會進一步提高乳清處理液中的EGT 濃度，所以，本試驗配制的上樣液最高濃度到10 mg/mL，考察EGT濃度對吸附效果的影響。

以流出液中EGT質量濃度達到上樣液質量濃度的10%時，為停止上樣點[13-14]。EGT 濃度分別為2.5、5.0、10 mg/mL 的上樣液的上樣體積分別為32.5、20.5、19.5 BV。濃度為10 mg/mL 的上樣液上樣體積大大低于濃度為2.5 mg/mL 的上樣液，可大幅縮減上樣時間。由圖5 可知，上樣液濃度為10 mg/mL 時，SA-2 樹脂對EGT 的吸附量高達214.51 mg/g，遠大于上樣液濃度為2.5 mg/mL 的68.49 mg/g 和濃度為5.0 mg/mL 的83.84 mg/g 的吸附量，這可能是因為較高濃度的上樣液變相降低了溶液中無機鹽、氨基酸類物質的相對濃度，高濃度上樣液10%停止上樣點的濃度較高也是一個重要原因。綜上可知，在制備乳清上樣液時，應盡量提高EGT 濃度。

2.2.2 上樣液流速對樹脂動態吸附效果的影響上樣液流速對樹脂動態吸附的影響如圖6 所示，從圖6 可以看出，上樣流速越快，流出液濃度上升越快，越早達到上樣液濃度的10%，即停止上樣點，這就意味著樹脂對EGT 的吸附量也越少，上樣液流速為1、2、3 BV/h 對應的上樣體積分別為10、9.5、8.5 BV，對應的上樣時間分別為10、4.75、2.83 h，兼顧吸附量和生產效率，確定2 BV/h為最佳上樣流速。

2.2.3 洗脫流速對樹脂洗脫性能的影響 不同洗脫流速下的洗脫曲線如圖7 所示，從圖7 可以看出，洗脫流速越低，峰型越集中，峰寬也更窄，當洗脫流出液中EGT 濃度降至5 mg/L 左右時，1、2、3 BV/h 的洗脫流速分別需要6、9.5、16 BV 的洗脫液，對應的洗脫時間分別為6、4.75、5.3 h。3 個流速下所需洗脫時間差別不大但洗脫液用量差異較大，這是因為洗脫流速越快，洗脫液在樹脂內的停留時間越短，洗脫液還未充分交換樹脂吸附的EGT 就已經穿透流出，洗脫流速越快所需洗脫液的量也就越大。綜合考慮洗脫時間以及洗脫液用量，確定最佳洗脫流速為1 BV/h。

2.3 驗證試驗

驗證試驗不僅是對篩選出的SA-2 樹脂進行驗證，其目的也包括利用所選樹脂對乳清處理方法進行調整、優化。前4 次驗證試驗中，采用完全由NRS 制備的上樣液，上樣體積在1 BV 時流出液中EGT 濃度即超過了上樣液濃度的10%，甚至達到30%的濃度，樹脂對EGT 的吸附量最低僅為4 mg/g，經過不斷調整乳清處理方法，最終得到吸附洗脫效果都較好的乳清處理液。

采用完全由NRS 制備的上樣液，充分去除無機鹽等雜質，測得上樣液中EGT 濃度為2780.12 mg/L，pH 為2.5，考慮到無機鹽比pH 對SA-2 樹脂吸附EGT 的影響更大，驗證試驗未調節上樣液pH，以免引入更多的無機鹽。由圖8 可以看出，當上樣體積達到14.5 BV 時，流出液的EGT 濃度達到280.01 mg/L，達到上樣液濃度的10%，用2 BV的去離子水洗滌樹脂，計算得到樹脂對EGT 的吸附量為40.18 mg/g，吸附情況良好。

用0.5%質量濃度的氨水溶液以1 BV/h 流速對樹脂柱進行洗脫，由圖9 可以看出，當洗脫體積達到5.5 BV 時，EGT 濃度達到最高，為16.93 mg/mL，洗脫至流出液中EGT 含量約5 mg/L時需要10 BV 的洗脫液，計算得到EGT 洗脫率為95.83%，洗脫情況良好，洗脫液經減壓蒸餾除氨后能順利結晶，經高效液相色譜檢測，結晶樣品純度達到99.98%。驗證試驗表明，SA-2 陽離子交換樹脂對NRS 中EGT 分離純化性能較好。

3 討論

NRS 中含有各種無機鹽、氨基酸等成分[15]，這些離子成分能夠被陽離子交換樹脂交換吸附，對樹脂吸附目標產物EGT 具有較大影響。試驗中，采用完全由NRS 制備的上樣液，9 種離子交換樹脂吸附效果都極差，無法區分出優劣，所以，本實驗將NRS 處理液用5 倍去離子水進行稀釋，降低各種干擾成分的濃度，再添加EGT 純品配制所需濃度，在此條件下篩選出吸附效果較好的樹脂，最后用完全由NRS 制備的上樣液進行驗證試驗，驗證試驗結果表明該方法合理、可行，篩選出的樹脂可以用于NRS 中EGT 的分離純化。

自天然橡膠產業形成以來，國內外學者對NRS 開展了多種用途的利用研究，但結果都停留于實驗室階段，目前沒有一個產業真正建立起來，NRS 在制膠廠依然是高濃有機廢水的角色，在實現NRS 的產業化應用之前還需更廣泛深入的研究并建立應用示范[16]，本研究的目的即為NRS的資源化、高值化利用開發一條可行的技術途徑。