蟬花預防治療阿爾茲海默病的網絡藥理學分析

摘 要：

為探究蟬花預防治療阿爾茲海默病的作用機制，通過搜索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）、Symmap、Swiss Target Prediction、GeneCards、PubChem等數據庫，使用Cytoscape3.7.2、AutoDock、Pymol等軟件開展網絡藥理學和分子對接分析。結果表明：篩選到4個重要成分和289個潛在靶點?；蚪M百科全書（KEGG）富集靶點數較高的信號通路包括癌癥、神經活性配體-受體相互作用、化學致癌-受體活化、人巨細胞病毒感染、阿爾茨海默病這5條通路。分子對接驗證了4個重要成分和4個關鍵靶點可自發結合，表明蟬花作用于機體后通過MAPK3、MAPK1、HSP90AA1和EGFR等關鍵靶點對阿爾茲海默病進行預防和治療。

關鍵詞：

蟬花；阿爾茲海默病；網絡藥理學；潛在靶點；分子對接

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2024）04－0011－07

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2024.04.002

阿爾茲海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經退行性疾病，嚴重降低患者的生活質量，同時也給其家庭和社會造成沉重的負擔［1］。據AD國際組織預計，到2030年，AD的全球疾病成本將達2萬億美元［2］。雖然β-淀粉樣蛋白級聯假說是目前公認的AD發病機制，但是微管結合蛋白（tau）過度磷酸化、中樞膽堿能的損害、興奮性氨基酸毒性作用、炎癥反應和氧化應激等也會對AD造成影響［3］。AD的發病機制不明確，導致目前臨床上沒有特別有效的治療方法，主要是使用乙酰膽堿酯酶抑制劑和非競爭性 N-甲基-D-天冬氨受體（NMDA） 拮抗劑為主的藥物治療［4］，一定程度上能改善AD的癥狀，但不能延緩或終止疾病進展。最新的中草藥對AD的Meta分析［5］中證實，與常規藥物相比，中草藥治療對于改善AD患者的認知功能和日常生活活動具有良好的潛力。

蟬花（Cordyceps cicadae）是我國傳統蟲生中藥材之一，首載于南北朝時《雷公炮炙論》［6-7］，其味甘寒，入肝、心經，具有疏散風熱、透疹、熄風止痙、明目退翳之功效，主治外感風熱、發熱、頭昏、咽痛、小兒驚風、夜啼、目赤腫痛、翳膜遮睛等［8］?；瘜W研究表明，蟬花中含有多糖、蟲草酸、氨基酸、生物堿、麥角甾醇等。研究表明蟬花具有抗炎［9］、抗腫瘤［10］、改善腎功能［11］、免疫調節［12］、抗氧化［13］等作用，而且蟬花中的腺苷在治療和預防神經退行性疾病方面具有潛在作用［14］。目前蟬花的藥理研究主要集中在抗腫瘤、治療腎臟疾病、免疫調節、抗氧化等方面，對于蟬花在治療AD方面的研究鮮有報道。

網絡藥理學通過研究藥物、疾病、靶點和途徑之間復雜多樣的關系，為藥物發現提供了一種新方法［15］。因此，本文利用網絡藥理學及分子對接技術分析蟬花預防治療AD的作用機制，以期為AD的預防及治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 化學成分收集與靶標預測

使用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP：https：//test.tcmsp-e.com/）［16］和Symmap（http：//shrm.org/）數據庫檢索蟬花的化學成分，篩選出口服生物利用度（OB）≥30%的化合物，去除重復項目。對于用“蟬花”關鍵詞未檢索到的已知成分，考慮到蟬花與冬蟲夏草化學成分的一致性［17-18］，因此使用“冬蟲夏草”作為關鍵詞進行檢索。將檢索到的化學成分二級結構下載，并導入Swiss Target Predictio（http：//swisstargetp-rediction.ch/）［19］設置屬性為“homo sapiens”，將靶點概率值大于0的分子作為蟬花成分的有效靶點。

1.2 成分靶標網絡圖構建

將有靶點的18個成分導入 Cytoscape 3.7.2軟件，用degree值≥3的靶點數據構建成分靶點作用網絡，分析候選化合物與靶點之間的關聯程度［20］。

1.3 疾病相關靶點的篩選

利用GeneCards數據庫（https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/）［21］對人類基因組的注釋數據，以“Alzheimer’s disease”作為關鍵詞檢索疾病相關靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質互作網絡構建

利用Venny 2.1.0網站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/）獲得候選化合物與阿爾茲海默病交叉靶點。將候選化合物與AD的交叉靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/）［22］，獲取蛋白質相互作用信息。這種情況僅限于“智人”。具有相關度的置信度得分設置為≥0.700。將蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，使用degree值≥6的數據構建AD與化學成分相互作用的網絡圖。

1.5 靶標的基因本體（GO）和 基因組百科全書（KEGG）富集分析方法

為了進一步分析所選靶點的功能及其在信號通路中的作用，將活性成分與AD的交叉靶點上傳到Metascape數據庫（http：//metascape.org/）［23］進行生物過程富集分析和通路富集分析。

1.6 分子對接分析

將PPI前4位的靶蛋白分別與蟬花4個重要成分進行分子對接驗證，從 PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化合物的3D 結構，經Open Babel軟件轉換；在RCSB PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載大分子蛋白的3D結構，利用Pymol軟件對大分子蛋白進行處理，去除水分子和其它配體。將關鍵靶點蛋白結構（degree值gt;40）和關鍵活性成分結構（degree值gt;100）進行分子對接，其Affinity （kcal/mol）值即代表兩者結合的結合能，結合能越低，配體與受體結合越穩定。最后，使用Pymol軟件分析和觀察對接結果。

2 結果與分析

2.1 蟬花化學成分收集

通過TCMSP數據庫以及Symmap數據庫收集到61個化學成分，篩選得到OB≥30%的化合物34個，其中有18個化合物找到靶點。將靶點概率值大于0的分子作為蟬花有效靶點，去除重復項后共得到344個靶點（表1）。

2.2 成分靶標網絡圖

Cytoscape 3.7.2軟件構建的成分靶標網絡如圖1所示，一共有149個節點組成，degree值大于100的化合物為有4個，分別是C16（Deoxyandrographolide）、C12（Linoleic）、C3（Arachidonic acid）和C2（EIC），推測這4個化合物為蟬花發揮療效的核心成分。

2.3 疾病靶點篩選及PPI網絡圖

通過GeneCards數據庫檢索去除重復項后得到12 828個靶點。利用Venny 2.1.0分析得到289個共同靶點（圖2），其中Cs代表蟬花，AD代表阿爾茲海默病。STRING 數據庫共做了289個節點分析，有1211條連線，平均節點度值為8.38。Cytoscape 分析顯示MAPK3、MAPK1、HSP90AA1和EGFR是degree值較高（gt;40）的靶標（圖3），推測蟬花主要通過作用于這4個靶點發揮預防和治療阿爾茲海默病的作用。

2.4 靶標的GO和KEGG富集分析

對289個預測靶點進行GO功能富集分析，共篩選到涉及分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process）和細胞組成（Cellular Component）的條目分別有1114個、6021個和542個。分子功能涉及核受體活性、氧化還原酶活性、水解酶活性、類固醇結合功能等；生物過程主要包括分泌調節、防御反應調節、激素水平調節、對氮化合物的反應等；細胞成分主要包括突觸膜、溶酶體內腔、膜質蛋白復合物等（圖4）。

對289個預測靶點的KEGG富集分析結果顯示，289個靶點顯著富集在癌癥、神經活性配體-受體相互作用、化學致癌-受體活化、人巨細胞病毒感染、阿爾茨海默病這5條通路上（圖5），理論上驗證了蟬花作用于機體后對于AD能產生干預作用。

2.5 分子對接

分子對接結果顯示4個重要成分與4個重要靶蛋白的結合能均小于0 kcal/mol（表2），說明配體和受體可自發結合，其中結合能越低說明結合的效果越好［24］。選擇結合能最好的前4組C16-MAPK1（圖6-a）、C3-HSP90AA1（圖6-b）、C16-HSP90AA1（圖6-c）、C2-MAPK1（圖6-d）進行可視化作圖。可視化結果顯示C16與MAPK1之間通過6條氫鍵進行連接；C16與HSP90AA1之間通過4條氫鍵進行連接；C2與MAPK1之間通過6條氫鍵進行連接；C3與HSP90AA1之間通過4條氫鍵進行連接，各成分可與靶點蛋白周圍氨基酸殘基通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩定的構象。

3 討論與結論

本研究運用網絡藥理學和分子對接的方法，借助大量數據庫和分析工具對蟬花預防和治療AD的作用機制進行預測和探究。TCMSP數據庫Symmap數據庫收集到61個化學成分、利用Swiss Target Prediction進行靶點預測后導入Cytoscape3.7.2構建成分靶標網絡，得到4個核心成分，分別是Deoxyandrographolide、EIC、Linoleic和Arachidonic acid，其中Deoxyandrographolide通過調節體內炎癥反應因子減輕炎癥反應改善AD患者認知功能和日常生活能力［25］；Arachidonic acid在與AD發病機制相關的幾種代謝過程中起關鍵作用［26］；Linoleic和EIC通過改變線粒體周圍能量干預AD［27］。對成分靶點以及阿爾茲海默病靶點作交集后得到4個核心靶點，分別是MAPK3、MAPK1、HSP90AA1和EGFR，說明蟬花可能主要通過影響這些關鍵靶點來發揮作用，其中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）具有調節細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等多種重要的生理/病理效應，大量研究證明MAPK信號通路中的三條重要通路均在AD造成的神經細胞損傷機制中發揮著重要作用［28］。HSP90AA1可間接阻滯NF-κB信號通路激活，減少炎性細胞因子產生［29］。通過KEGG信號通路富集分析發現的靶點主要富集在癌癥、神經活性配體-受體相互作用、化學致癌-受體活化、人巨細胞病毒感染、阿爾茨海默病這5條通路上，可見蟬花與阿爾茲海默病相關，后將4個核心靶點以及4個核心成分進行分子對接驗證了核心成分與核心靶點之間可自發結合，氫鍵構象穩定，其結合能均小于0 kcal/mol。理論上確定了蟬花預防治療AD的主要成分及關鍵靶點、通路。

但是網絡藥理學對成分和靶點之間關系的分析仍然處于生物信息分析層面，各個數據庫的篩選機制、算法和數據容量等存在差異，如Swiss Target Prediction數據庫基于與已知化合物的二維和三維結構相似性，反向篩選預測小分子的蛋白質靶標，比較毒物基因組學數據庫（CTD）廣泛用于預測化學-基因/蛋白質相互作用、化學-疾病和基因-疾病的關系。因此，每個數據庫篩選的靶點會有差異。

目前關于網絡藥理學所需的基礎數據還有待進一步系統、全面地整合，預測的結果仍需要基礎研究和臨床試驗進一步驗證?，F有不同數據庫的大部分數據來源于不同實驗，在計算兩個相似或相同的疾病時，重合性往往較低，部分數據庫的數據內容還不完善，僅對部分小分子化合物在少數靶點蛋白上進行了篩選評價，本身也存在著一定的局限性，再者對于口服生物利用度低的成分在篩選的過程中會被主動摒棄掉，也相應的摒棄掉一些潛在的靶點。

蟬花是我國傳統名貴中藥，含有豐富的核苷、固醇、環肽、多糖、蟲草酸（D-甘露醇）、生物堿、脂肪酸、麥角甾醇等多種活性物質，這些活性成分對糖尿病、腎病、動脈粥樣硬化、神經退行等性疾病都有很好的療效。對于蟬花預防和治療阿爾茲海默癥等神經退行性疾病雖有報道，但是對于其具體的作用機制仍不清楚［30-31］。本文利用網絡藥理學與分子對接，分析了蟬花致病靶標和信號通路在分子層面上的相互作用網絡，初步獲得蟬花預防及治療阿爾茲海默病的分子作用途徑，將為進一步的實驗研究和臨床驗證提供理論依據。

（責任編輯：段麗麗）

參 考 文 獻：

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Network Pharmacology Analysis of Cordyceps cicadae in the Prevention and Treatment of Alzheimer’s

Chen Liping， Zhao Jiehong， Wang Jiao， Bai Shilong， Han Jie*

（College of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：

In order to explore the mechanism of Cordyceps cicadae in the prevention and treatment of Alzheimer’s disease，the network pharmacology and molecular docking analysis were carried out by searching Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform （TCMSP）， Symmap， Swiss Target Prediction， GeneCards， PubChem and other databases， using Cytasape 3.7.2， AutoDock， pymol and other software. A total of 4 important components and 289 potential targets were screened.The five pathways with more targets enriched by genome Encyclopedia （KEGG） were Cancer， Neuroactive ligand-receptor interaction， Chemical carcinogenic-receptor activation， Human cytomegalovirus infection and Alzheimer’s disease. Molecular docking results verify that the 4 important components and 4 key targets can spontaneously combine， revealing C.cicadae could be uesd to prevent and treat Alzheimer’s disease， through the key target such as MAPK3，MAPK1，HSP90AA1 and EGFR.

Keywords：

Cordyceps cicadae; Alzheimer’s disease; network pharmacology;potential target; molecular docking