異硫氰酸芐酯對熒光假單胞菌的抑菌活性及在牛肉保鮮中的應用

摘 要：熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）廣泛存在于牛肉、魚類、家禽和乳制品等生鮮產品中，成為引發食源性疾病的重要原因。以熒光假單胞菌ATCC 13525作為供試菌株，研究異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BITC）對菌株的抑制作用及其應用于牛肉的保鮮效果。結果表明：通過牛津杯實驗法，得到BITC對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為0.25 mmol/L；表型實驗表明BITC能夠破壞細菌細胞膜的通透性并降低代謝活力；此外，相比于對照組，MIC處理組牛肉貯藏7 d內菌落總數、色差值、pH值、總揮發性鹽基氮含量及氮氧化合物含量分別降低35.73%、21.52%、4.53%、54.39%和4.78%，而感官評分提高10.45%，說明BITC可以顯著抑制熒光假單胞菌的生長，改善牛肉的感官品質及理化指標。因此，BITC在冷鮮牛肉貯藏保鮮方面具有較好的應用前景。

關鍵詞：熒光假單胞菌；異硫氰酸芐酯；牛肉；抑菌作用；保鮮效果

Inhibitory Activity of Benzyl Isothiocyanate against Pseudomonas fluorescens and Its Application in Beef Preservation

GE Zitong， LIU Jianan， ZHANG Shuqi， BI Jingran， HOU Hongman， ZHANG Gongliang*

（1. Liaoning Key Laboratory for Aquatic Processing Quality and Safety， School of Food Science and Technology，

Dalian Polytechnic University， Dalian 116000， China）

Abstract： Pseudomonas fluorescens is widely found in raw animal products such as beef， fish， poultry and dairy products， and has become an important cause of foodborne diseases. The aim of this paper was to investigate the inhibitory effect of benzyl isothiocyanate （BITC） on P. fluorescens ATCC 13525 as a test strain and its application in beef for freshness preservation. The minimum inhibitory concentration （MIC） of BITC on P. fluorescens was observed to be 0.25 mmol/L by the Oxford cup method. Phenotyping experiments demonstrated that BITC was able to disrupt the permeability of bacterial cell membranes and reduce metabolic activity. In addition， compared with the control group， the total viable count， color difference， pH， total volatile basic nitrogen （TVB-N） content and nitrogen oxides content in the MIC-treated group were reduced by 35.73%， 21.52%， 4.53%， 54.39%， and 4.78%， respectively， after 7 days of storage， and the sensory score increased by 10.45%， indicating that BITC could significantly inhibit the growth of P. fluorescens and improve the sensory quality and physicochemical indexes of beef. Therefore， BITC has a good application prospect in the preservation of chilled beef.

Keywords： Pseudomonas fluorescens; benzyl isothiocyanate; beef; antibacterial effect; preservation effect

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077

中圖分類號：TS251.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）05-0027-09

引文格式：

葛子同， 劉佳楠， 張淑琪， 等. 異硫氰酸芐酯對熒光假單胞菌的抑菌活性及在牛肉保鮮的應用[J]. 肉類研究， 2024， 38（5）： 27-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077." " http：//www.rlyj.net.cn

GE Zitong， LIU Jianan， ZHANG Shuqi， et al. Inhibitory activity of benzyl isothiocyanate against Pseudomonas fluorescens and its application in beef preservation[J]. Meat Research， 2024， 38（5）： 27-35. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240415-077." " http：//www.rlyj.net.cn

牛肉味道鮮美、營養豐富，含有較高含量的維生素、肌氨酸、鐵及較低含量的脂肪和膽固醇，是人們生活中補充蛋白質的重要來源[1-2]。牛肉在貯藏與運輸過程中極易受到微生物的污染[3-4]，如假單胞菌[5]、腸桿菌[6]、乳酸桿菌[7]及熱鏈球菌等[8]。這些菌株通過加速蛋白質和脂肪的降解，使牛肉產生黏液、異味及質構特性變化，并且菌株會釋放有害毒素，引發心臟、肺部、神經系統或胃腸道炎癥[9-10]。因此，抑制牛肉在運輸或加工過程中的腐敗已成為研究人員日益關注的重點[11]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種常見的革蘭氏陰性細菌，屬于假單胞菌屬[12]。它具有強大的氧化能力，能夠在低溫下利用多種有機化合物和無機物進行代謝，被公認為食品基質微生物區系中最主要的腐敗細菌之一[13]。此外，熒光假單胞菌能夠產生多種酶類，包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，以利用周圍環境中的營養物質[14]。假單胞菌屬已被證明是造成生鮮肉類變質的主要菌種[15-17]，具有較強的蛋白和脂質水解能力，容易導致肉類食品產生黏液并散發難聞氣味，從而降低肉品質量、造成資源浪費和經濟損失[18]。因此，熒光假單胞菌對食品的污染以及對食品加工環境的危害需要進一步的研究和控制。

隨著抗生素濫用導致的耐藥性問題日益嚴重，人們對天然提取物作為抗菌劑的研究日益深入。天然提取物是從植物、微生物、海洋生物等自然來源提取具有生物活性的化合物，具有廣泛的生物活性和較低的毒副作用。在抑菌領域，天然提取物展現出顯著潛力，為抗菌新藥的發展提供了新思路[19-21]。這些化合物具有不同的生物活性，能夠干擾細菌的代謝、膜結構和DNA復制，從而達到抑菌效果[22]。王雅瑩[23]研究發現，香芹酚對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為1.6 mmol/L，可以顯著抑制熒光假單胞菌的生物被膜生成、多糖產生、黏附性及運動性。Lan Weiqing等[24]研究顯示，殼聚糖-咖啡酸接枝共聚物以1.25 mg/mL（MIC）抑制了熒光假單胞菌的生長，通過破壞菌體細胞、細胞膜、抑制菌體運動并破壞細菌DNA，從而阻礙熒光假單胞菌正常生長繁殖。然而，這些天然抑制劑都需要較大的抑制濃度才能達到對熒光假單胞菌較好的抑菌效果。因此，研究能夠提高抑菌效率的天然抑菌劑，可以提高其在食品工業中的潛在應用。

異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BITC）是由芥子酶介導的硫代葡萄糖苷的主要次級代謝物，通過啟動硫代葡萄糖苷水解酶作為抵抗病原體的防御系統，以硫代葡萄糖苷的形式廣泛存在于豆瓣菜、卷心菜、花椰菜、甘藍和西蘭花等十字花科植物中[25-26]。其分子結構中含有異硫氰基和芐酯基，這2 種基團賦予BITC抗菌特性[27]。BITC對單核細胞增生李斯特氏菌[28]、金黃色葡萄球菌[29]、大腸桿菌[30]和副溶血性弧菌[31]具有良好的抑菌效果。此外，Wu Hongyan等[32]研究發現，含有BITC的復合膜對牛肉具有良好的保護效果；Huang Yue等[33]研究證明，添加BITC的天然復合膜包裹處理后，對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌在雞肉表面的增殖具有持續抑制作用；Li Zhaolun等[34]研究結果同樣證明BITC減緩了雞肉中微生物的生長，對雞肉中的細菌具有較好的抑制作用。BITC作為可使用的食品添加劑（GB 2769—2014

《食品添加劑使用標準》），對大多數致病菌具有抑制作用，但鮮有其對熒光假單胞菌抑制效果以及直接對冷鮮牛肉抑菌保鮮的相關研究與報道，因而BITC作為一種具有多種生物活性的天然化合物，在食品工業中具有廣泛的應用前景。

本研究以不同濃度的BITC作為保鮮抑制劑，通過牛津杯實驗探究BITC對熒光假單胞菌的MIC。通過細胞形態和代謝活力探明不同濃度BITC對熒光假單胞菌活性的影響。此外，將BITC應用于牛肉中，通過菌落總數、色差、pH值、總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、電子鼻測定及感官評定，研究BITC對被熒光假單胞菌侵染的牛肉品質特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛上腦 大連市華潤萬家超市；熒光假單胞菌ATCC 13525 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

BITC（分析純，純度98%） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，分析純）天津大茂化學試劑廠；氯化鈉 北京寶希迪科技有限公司；LB肉湯、瓊脂粉、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）、甲醛、無菌采樣袋 山東海博生物公司；磷鎢酸負染色液（2%，pH 7.0） 北京雷根生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GN1324型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；DGG-9140A型高壓滅菌鍋 上海森信實驗儀器有限公司；ZHWY-100B型恒溫培養振蕩器、

ZHJH-C1112C型超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；DDS-11A型電熱恒溫鼓風干燥箱 海爾集團股份有限公司；SpectraMax M2型全波長酶標儀 美國MD儀器公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 日本東京電子公司；

T50型勻漿機 德國IKA公司；HZP-L502型pH計 華志（福建）電子科技限公司；K9840型自動凱氏定氮儀海能未來技術集團股份有限公司；DS-700D型分光測色儀"深圳市金準儀器設備有限公司；PEN3型電子鼻 埃爾森斯（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

BITC儲備液制備：吸取適量BITC原液，用適量的DMSO溶解至1 mol/L。

無菌生理鹽水制備：稱取0.85 g氯化鈉于100 mL去離子水中，121 ℃高壓蒸汽滅菌處理后，置于4 ℃保存備用。

無菌牛肉制備：將超市采購的現殺牛肉在超凈工作臺中使用無菌水清洗表面，紫外照射1 h。隨后，使用滅菌處理的剪刀將鮮牛肉剪切成3 g的方形肉塊，并裝進帶壓條的無菌采樣袋（12 cm×18 cm）中密封備用。熒光假單胞菌培養至穩定期，使用無菌生理鹽水將菌液稀釋至104 CFU/mL，與BITC儲備液（終濃度為1/2 MIC和MIC）混合，對照組加入生理鹽水，吸取1 mL混合液加入無菌采樣袋中的牛肉上，通過勻漿機（3 000 r/min、3 min）使混合液與牛肉充分接觸。對照組、MIC處理組和1/2 MIC處理組均制備3 份樣品，每份為7 d所需的樣品量（21 塊牛肉）。一份肉塊與無菌生理鹽水1∶9（V/V）稀釋后均質，吸取上清液涂板用于測定菌落總數；一份用于色差、電子鼻及pH值測定；一份用于TVB-N含量測定。每一樣品設置3 個平行。將制備好的樣品置于4 ℃培養7 d，每隔1 d進行菌落總數、pH值、色差、TVB-N含量、電子鼻測定和感官評價，結合各項檢測指標以評價冷藏期間牛肉的新鮮度變化。

1.3.2 菌種活化及培養

1.3.2.1 菌種活化

使用接種環蘸取－80 ℃保存的熒光假單胞菌于LB瓊脂平板上劃線，30 ℃培養24 h。挑取熒光假單胞菌單菌落加入100 mL LB液體培養基中，30 ℃、150 r/min搖床培養24 h。重復上述活化步驟2 次，將培養好的單菌落平板于4 ℃保存備用。

1.3.2.2 菌種培養

無菌環境中，使用接種環挑取熒光假單胞菌單菌落加入100 mL LB液體培養基中培養，30 ℃、150 r/min搖床培養24 h。

1.3.3 BITC對熒光假單胞菌抑制效果研究

1.3.3.1 牛津杯實驗

參照趙玉明等[35]牛津杯實驗法測定BITC對熒光假單胞菌的MIC。菌株在30 ℃過夜培養，用無菌生理鹽水稀釋至104 CFU/mL用于檢測。無菌LB固體培養基倒入已滅菌的玻璃皿中，牛津杯打孔，凝固后將配制好的菌懸液涂布，在孔中加入70 μL稀釋至不同終濃度的BITC（0、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50 mmol/L），30 ℃培養24 h后觀察熒光假單胞菌生長情況，以無菌落生長的BITC濃度作為MIC。

1.3.3.2 菌體形態觀察

根據Shu Huizhen等[36]的研究稍加改動。熒光假單胞菌在LB培養基中生長至對數期，通過0、1/2 MIC和MIC的BITC處理，并在30 ℃培養12 h。取一滴細菌懸浮液漂浮在銅網格上5 min，使用磷鎢酸染色法進行染色。在TEM上采集圖像，觀察細菌形態。

1.3.3.3 代謝活力測定

熒光假單胞菌培養至穩定期，使用PBS清洗菌體。處理過的菌懸液與BITC（0、1/2 MIC和MIC）于30 ℃培養3、12 h。培養結束后，12 000×g離心2 min，無菌PBS清洗菌體。使用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）配制0.01 mol/L碘硝基氯化四氮唑藍（iodonitrotetrazolium chloride，INT）溶液，INT溶液與菌懸液1∶9（V/V）混合，30 ℃條件下培養30 min，測定630 nm波長處的光密度（optical density，OD）[37]。

1.3.4 BITC對牛肉的保鮮效果研究

1.3.4.1 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2022《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》，處理后的菌液涂布在LB固體培養基上進行菌落總數測定。

1.3.4.2 色差測定

將樣品用濾紙吸干多余液體，使用分光測色儀測定牛肉的色澤，測量前儀器用黑色和白色標準板校準，每個牛肉樣品至少測定3 個不同的區域。色差值（ΔE）按下式計算[38]：

式中：ΔL*表示所測亮度值（L*）與初始L*之差；Δa*表示所測紅度值（a*）與初始a*之差；Δb*表示所測黃度值（b*）與初始b*之差。

1.3.4.3 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。

1.3.4.4 TVB-N含量測定

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》。

1.3.4.5 電子鼻測定

電子鼻是可以檢測復雜氣味的電化學傳感器系統，包含10 種傳感器，不同傳感器對不同類型氣味具有不同的敏感程度，具體描述見表1[39]。將樣品絞碎，靜置30 min后進行電子鼻檢測。

1.3.4.6 感官評價

參照GB 2707—2016《鮮（凍）畜、禽產品》對牛肉的感官品質進行評價。由15 名專業人員組成感官評定小組，根據視覺、嗅覺、觸覺判斷牛肉色澤、氣味、形態及質地狀態。同一樣品、同一項目評分取平均值，同一天的總評分為各個評價項目分數平均值的總和。評價標準如表2所示。

1.4 數據處理與統計分析

所有實驗均設置3 組平行，數據以平均值±標準差表示。采用OriginPro 2019b軟件（美國Origin Lab公司）進行繪圖，SPSS Statistic 27軟件（美國SPSS公司）進行方差分析，使用單因素方差分析和Tukey檢驗校正法檢驗數據間的差異是否顯著，P＜0.05表明有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 BITC對熒光假單胞菌生長情況的影響

如表3所示，牛津杯實驗顯示，當BITC濃度超過0.06 mmol/L時，BITC對熒光假單胞菌的生長出現抑制作用。當BITC濃度達到0.25 mmol/L，熒光假單胞菌的生長完全受到抑制，說明BITC對熒光假單胞菌的MIC為0.25 mmol/L。

微生物的微觀結構，包括細胞壁、細胞膜、細胞內容物（蛋白質和核酸）、生理活動所需能量及相關酶類對微生物的生長繁殖十分必要[40]。而抑菌劑可以通過影響這些微觀結構達到抑制微生物的作用[41]。因此，BITC可能通過影響一種或多種微觀結構，從而具有較好的抑菌性能。

2.2 BITC對熒光假單胞菌細胞形態和代謝活力的影響

如圖1A所示，對照組的熒光假單胞菌細胞形態完整，呈橢圓桿狀，菌體數量較多且無透光部位出現。MIC處理后，細胞邊緣出現腫脹現象，導致細胞內蛋白質和核酸等內容物泄露，這可能是細菌細胞膜和細胞壁受到破壞所引起的[42]，說明BITC會導致熒光假單胞菌細胞膜的損傷，并且高濃度處理組損傷程度更嚴重。Shu Huizhen等[36]研究表明，3-蒈烯處理后，熒光假單胞菌細胞損傷及細胞壁分離。Yao Xiaolin等[43]的研究顯示，熒光假單胞菌經聚甲氧基黃酮處理后細胞形態受損，膜被破壞。

小寫字母不同表示同一時間組間差異顯著（P＜0.05）。圖2、6B同。

代謝能力是多數微生物產生能量的主要途徑，可以影響細胞ATP的生成，呼吸系統也被認為是抗菌作物的主要靶點之一[44]。呼吸鏈中脫氫酶介導INT發生還原反應并生成紫紅色甲瓚沉淀，影響OD630 nm。因此，OD630 nm越大，說明甲瓚生成速率越快，細胞代謝活力越強[45]。如圖1B所示，培養3 h后，對照組的OD630 nm為0.60，BITC（1/2 MIC和MIC）處理后，OD630 nm分別降低至0.45和0.41。培養12 h后，對照組的OD630 nm為0.47，BITC（1/2 MIC和MIC）處理后，OD630 nm分別降低至0.33和0.29。經BITC處理12 h后，MIC處理組與對照組的OD630 nm間均存在顯著差異（P＜0.05），熒光假單胞菌的代謝活力降低38.30%。說明隨著時間的延長，BITC對熒光假單胞菌代謝活力的影響越明顯，這可能歸因于BITC的加入干擾了呼吸鏈脫氫酶氧化還原反應的發生，影響甲瓚的生成，從而導致OD630 nm下降[46]。這些結果說明，BITC可以通過調節熒光假單胞菌呼吸代謝能力影響菌體生理活動所需能量，造成呼吸代謝紊亂。

細菌細胞膜提供的滲透壓屏障是菌體正常運轉的重要因素，包括能量轉換、代謝調控及信息傳遞等[47]。BITC的疏水性使其進入細菌細胞膜，引起膜內外滲透壓增加，破壞膜完整性，使細胞內容物如蛋白質、核酸、ATP等泄露，菌體形態發生腫脹或皺縮，從而抑制細菌的增殖[48]。

2.3 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉品質的影響

2.3.1 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉菌落總數的影響

菌落總數可以直接反映牛肉被微生物侵染的程度，是評判牛肉新鮮度的重要指標。當牛肉微生物菌落總數大于6（lg（CFU/mL））時，就可以被認定為變質牛肉[49]。如圖2所示，各組的菌落總數隨貯藏時間的延長而增加。這可能由于牛肉中游離氨基酸和水溶性蛋白質等較為豐富的營養物質引起微生物的富集生長[50]。對照、1/2 MIC和MIC組的初始菌落總數約為3.8（lg（CFU/mL））。對照組貯藏第5天的菌落總數明顯上升，在第6天超過

6（lg（CFU/mL）），已經達到腐敗標準。1/2 MIC處理組在第0～4天內生長緩慢，可能由于BITC短暫影響熒光假單胞菌的生長繁殖。第5天后，熒光假單胞菌趨于正常生長，這歸因于低濃度BITC難以維持長期、有效的抑制效果，但牛肉仍屬于新鮮肉標準。MIC處理組在第3天的熒光假單胞菌菌落總數為3.69（lg（CFU/mL）），明顯低于對照組，這種現象可能與BITC和冷藏溫度共同作用相關。隨著貯藏時間的延長，菌落總數緩慢上升，而1/2 MIC和MIC處理組在1 周之內仍符合新鮮牛肉的標準，與對照組相比，1 周內1/2 MIC和MIC處理組的菌落總數抑制率分別為26.32%和35.73%，說明BITC可以通過抑制牛肉中熒光假單胞菌的生長延長牛肉保持新鮮度的時間。此外，1/2 MIC和MIC處理組在第2天開始出現菌落總數的顯著性差異（P＜0.05），雖然在第7天時1/2 MIC處理組的菌落總數仍然保持在安全范圍內，但仍有較為明顯的增長。而MIC處理組的菌落總數基本不變。

微生物是導致低溫貯藏肉類及水產品腐敗的關鍵因素，假單胞菌是其中的優勢腐敗菌[51]。潘瑩等[52]研究顯示，荷葉提取物及曲酸單獨或聯合作用于牛肉中，均可有效抑制假單胞菌等微生物的生長繁殖；楊勝平等[53]研究發現，牛至精油對三文魚中的熒光假單胞菌具有較好的抑制能力，貯藏12 d后，牛至精油處理組較對照組菌落總數減少1.34（lg（CFU/mL））；Li Zhaolun等[34]研究表明，BITC可有效抑制雞肉中的微生物生長，降低生鮮雞肉中單核細胞增生李斯特氏菌的含量。綜上所述，已有研究均與本研究有類似結果，BITC可有效抑制腐敗菌的生長繁殖，延長肉制品貨架期。

2.3.2 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉色差的影響

微生物如細菌、霉菌等在肉類表面或內部生長，其代謝活動會產生酸性物質、酶和其他化合物，這些物質可能會與肉類中的色素相互作用，導致色素的分解或變化，從而影響肉類的顏色[54]。如圖3所示，對照組的ΔE在貯藏過程中不斷升高，并在第4天出現明顯的上升趨勢，這是由于牛肉在貯藏過程中與空氣接觸，熒光假單胞菌可以較好地生長。牛肉中的肌紅蛋白逐步被氧化成高鐵肌紅蛋白，失去鮮紅的色澤，并伴隨脂質氧化，導致L*、a*和b*呈現上升趨勢，進而促進ΔE的增加[55-56]。在1/2 MIC處理組中，前3 d的ΔE趨于穩定，在第4天有較為明顯的上升。MIC處理組可以將新鮮牛肉的顏色保持4 d，在第5天時出現明顯的變化。此外，MIC處理組貯藏第7天ΔE的變化遠低于對照組牛肉，與對照組相比，1 周內MIC處理組的牛肉ΔE降低21.52%，原因可能是MIC通過抑制熒光假單胞菌的生長降低牛肉TVB-N含量，阻斷其氧化反應的發生，減緩牛肉的顏色變化。

2.3.3 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉pH值的影響

微生物在生長過程中會分解肉類中的蛋白質、碳水化合物等，釋放出氨、胺等堿性產物，這些堿性產物可能會提高肉類的pH值[57]。如圖4所示，牛肉貯藏7 d時1/2 MIC和MIC處理組的pH值明顯低于對照組。與對照組相比，1/2 MIC和MIC處理組可以延緩1.53%和4.53%的牛肉pH值上升。此外，MIC處理組的pH值極為穩定，說明BITC可以通過抑制熒光假單胞菌減少牛肉中蛋白質和碳水化合物等營養物質的分解，穩定牛肉pH值。

pH值是評價肉類品質的重要指標，冷鮮肉中pH值的變化程度與肌肉蛋白特性有關，進而影響肉類品質[58]。在本研究中，pH值處于上升的趨勢，這可能是由于牛肉中糖原含量下降導致糖酵解速率減緩，以及牛肉中增殖的熒光假單胞菌等微生物和內源性蛋白酶降解蛋白質產生堿性氨基酸所致[59]。BITC的加入有效緩解pH值的上升，可能是由于其對熒光假單胞菌的有效抑制減少了堿性物質的產生，保持牛肉品質。

2.3.4 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉TVB-N含量的影響

肉類中的TVB-N主要包括揮發性堿和氨等。微生物可能對肉類TVB-N含量產生影響，其影響主要來自微生物的代謝活動和腐敗過程[60]。如圖5所示，各組牛肉的TVB-N含量隨著貯藏時間的延長而增加，尤其是對照組與1/2 MIC處理組牛肉，這可能由于上述2 組牛肉適合熒光假單胞菌生長繁殖，產生的代謝產物和酶類物質增多，加速了牛肉中氮氧化合物降解，從而使TVB-N含量上升[52]。各處理組初始TVB-N含量約為10 mg/100 g，BITC處理組的TVB-N含量始終低于對照組，MIC處理組貯藏7 d時的TVB-N含量相比于對照組降低54.39%。目前的衛生標準規定牛肉中TVB-N含量的變質閾值為0.2 mg/g[61]，

對照組第7天的TVB-N含量已經接近該閾值，而BITC處理組仍處于鮮肉標準，說明BITC處理可有效緩解TVB-N的生成。

2.3.5 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉電子鼻測定結果的影響

如圖6A所示，電子鼻W5S傳感器對牛肉樣品的響應值較其他傳感器更強。隨著時間的延長，W5S傳感器信號強度持續增加，說明在貯藏過程中產生了氮氧化合物。氮氧化合物主要來源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應，其香氣閾值較低，是肉制品中重要的呈味物質，并與熒光假單胞菌生長有一定關系[62]。如圖6B所示，與貯藏第1天相比，貯藏第7天對照組W5S傳感器響應值上升141.89%，說明熒光假單胞菌使牛肉逐漸變質，產生大量氮氧化合物。貯藏第7天時，1/2 MIC和MIC處理組的信號強度相比于對照組分別降低1.51%和4.78%，說明BITC處理具有延緩牛肉腐敗的作用，降低牛肉中氮氧化物的產生，以達到保鮮作用。

在肉類風味和品質評定方面，電子鼻技術常用于對不同肉類揮發性氣味的檢測，其主要通過風味識別、肉質評估、新鮮度識別和風味調控等方面對肉類品質進行調控[63]。侯寶睿等[64]研究發現，使用防腐劑包裝的醬牛肉在18 d之內依舊可以達到保鮮的效果。沈秋霞等[39]通過電子鼻技術快速判斷不同冷藏時間三文魚片揮發性物質，并發現氮氧化合物可導致真空包裝三文魚片發生腐敗變質現象。這些研究均與本研究結果一致，說明BITC可有效改善牛肉風味，延緩牛肉腐敗變質。

2.3.6 BITC對侵染熒光假單胞菌牛肉感官評分的影響

如圖7所示，隨著貯藏時間延長，各組別的感官評分均下降，由于熒光假單胞菌代謝過程中利用氨基酸，釋放氨氣等刺激性氣體，進而導致牛肉感官品質發生劣變[65]。BITC處理組評分始終高于對照組，且1 周內感官評分較對照組相比提高10.45%，可能是因為BITC抑制熒光假單胞菌的增殖，降低蛋白質分解速率并減弱氨氧化合物的生成[66]。貯藏第4天各處理組牛肉感官評分下降趨勢顯著，說明牛肉的感官品質已經發生改變，BITC處理保證了牛肉的品質，達到延長牛肉貨架期的作用。

3 結 論

本研究以BITC為抑制劑，研究其對熒光假單胞菌的抑菌活性及應用于牛肉中的保鮮效果。結果表明：BITC對熒光假單胞菌的MIC為0.25 mmol/L，能夠破壞熒光假單胞菌細胞膜的通透性及代謝活性；此外，在貯藏第7天時，與對照組相比，MIC處理組牛肉中的熒光假單胞菌數量、ΔE、pH值、TVB-N含量、氮氧化合物含量及感官評分均明顯改善。綜上所述，BITC作為天然抑制劑及可使用的食品添加劑，能夠有效抑制熒光假單胞菌的生長并延長冷鮮牛肉貨架期，在肉類的冷藏保鮮中具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] 汪海棠， 王守偉， 李家鵬， 等. 荷斯坦去勢公牛肉質與加工特性分析與挖掘[J]. 肉類研究， 2024， 38（1）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20231229-119.

[2] 劉提廣， 張慶偉， 許寶琛， 等. 不同真空低溫煮制時間和溫度組合對牛半膜肌食用品質的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（1）： 44-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240119-021.

[3] 張宜新， 劉通， 張峰. 冷鏈儲運中生鮮食品劣變的快檢技術研究進展[J/OL]. 食品科學， 2024： 1-18. [2024-05-09]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20240416.1348.005.html.

[4] 張順君， 王東亮， 陳宏柱， 等. 超高壓殺菌對醬鹵肉制品貯藏期品質的影響[J]. 肉類研究， 2023， 37（12）： 54-60. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240111-014.

[5] GE Y Y， ZHU J L， YE X F， et al. Spoilage potential characterization of Shewanella and Pseudomonas isolated from spoiled large yellow croaker （Pseudosciaena crocea）[J]. Letters in Applied Microbiology， 2017， 64（1）： 86-93. DOI：10.1111/lam.12687.

[6] YU H H， CHIN Y W， PAIK H D. Application of natural preservatives for meat and meat products against food-borne pathogens and spoilage bacteria： a review[J]. Foods， 2021， 10（10）： 2418. DOI：10.3390/foods10102418.

[7] TENDERIS B， KILI? B， YAL?IN H， et al. Controlling growth of Listeria monocytogenes and Pseudomonas fluorescens in thermally processed ground beef by sodium lactate， encapsulated or unencapsulated polyphosphates incorporation[J]. LWT-Food Science and Technology， 2021， 144： 111169. DOI：10.1016/j.lwt.2021.111169.

[8] 王麗， 林穎， 譚旭， 等. 冷鮮肉主要致腐微生物及構建微生物預測模型研究進展[J]. 肉類研究， 2023， 37（10）： 42-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230817-077.

[9] WANG Z L， WANG Z X， JI L L， et al. A review： microbial diversity and function of fermented meat products in China[J]. Frontiers in Microbiology， 2021， 1212： 645435. DOI：10.3389/fmicb.2021.645435.

[10] 張琪， 龐立冬， 蘇群超， 等. CRISPR/Cas-等溫擴增技術在食源性病原菌檢測中的研究進展[J]. 食品科學， 2024， 45（7）： 310-321. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230804-033.

[11] 劉雨辰， 曲夢銳， 曹愷洋， 等. 殼聚糖-留蘭香精油復合膜對醬豬肉保鮮效果的影響[J]. 肉類研究， 2023， 37（10）： 37-41. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230830-080.

[12] XU Y， ZHANG T， CHE J R， et al. Evaluation of the antimicrobial mechanism of biogenic selenium nanoparticles against Pseudomonas fluorescens[J]. Biofouling， 2023， 39（2）： 157-170. DOI：10.1080/08927014.2023.2199932.

[13] WANG Y Y， FENG L F， LU H X， et al. Transcriptomic analysis of the food spoilers Pseudomonas fluorescens reveals the antibiofilm of carvacrol by interference with intracellular signaling processes[J]. Food Control， 2021， 127： 108115. DOI：10.1016/j.foodcont.2021.108115.

[14] WANG Y B， WANG Y Z， CHEN J， et al. Screening and preservation application of quorum sensing inhibitors of Pseudomonas fluorescens and Shewanella baltica in seafood products[J]. LWT-Food Science and Technology， 2021， 149： 111749. DOI：10.1016/j.lwt.2021.111749.

[15] SUN Y M， OCKERMAN H W. Growth of Pseudomonas fluorescens and Escherichia coil in aseptically-prepared fresh ground beef[J]. Journal of Muscle Foods， 2004， 15（3）： 155-171. DOI：10.1111/j.1745-4573.2004.tb00681.x.

[16] SHAW B G， LATTY J B. A numerical taxonomic study of Pseudomonas strains from spoiled meat[J]. Journal of Applied Bacteriology， 1982， 52（2）： 219-228. DOI：10.1111/j.1365-2672.1982.tb04843.x.

[17] CROWLEY K M， PRENDERGAST D M， SHERIDAN J J， et al. Survival of Pseudomonas fluorescens on beef carcass surfaces in a commercial abattoir[J]. Meat Science， 2010， 85（3）： 550-554. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.03.004.

[18] 袁旖旎， 周廣暉， 董鵬程， 等. 假單胞菌生物被膜形成機制及控制：基于群體感應與第二信使關系[J/OL]. 食品科學， 2024： 1-13. [2024-05-09].

http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20240329.1143.002.html.

[19] XU Y S， JIANG X Q， GE L H， et al. Inhibitory effect of edible additives on collagenase activity and softening of chilled grass carp fillets[J]. Journal of Food Processing and Preservation， 2017， 41（2）： e12836. DOI：10.1111/jfpp.12836.

[20] KONG B H， GUO Y Y， XIA X F， et al. Cryoprotectants reduce protein oxidation and structure deterioration induced by freeze-thaw cycles in common carp （Cyprinus carpio） surimi[J]. Food Biophysics， 2013， 8（2）： 104-111. DOI：10.1007/s11483-012-9281-0.

[21] KANATT S R， CHANDER R， SHARMA A. Chitosan and mint mixture： a new preservative for meat and meat products[J]. Food Chemistry， 2008， 107（2）： 845-852. DOI：10.1016/j.foodchem.2007.08.088.

[22] TAN L， HOW C， FOO J B， et al. Resveratrol as a potential broad-spectrum compound for cancer treatment[J]. Progress in Microbes and Molecular Biology， 2020， 3： a0000098. DOI：10.36877/pmmb.a0000098.

[23] 王雅瑩. 基于群體感應研究香芹酚對魚源熒光假單胞菌單/混生物被膜的抑制作用[D]. 杭州： 浙江工商大學， 2020： 24-54.

[24] LAN W Q， DU J T， SUN Y Q， et al. Insight into the antibacterial activity and mechanism of chitosan caffeic acid graft against Pseudomonas fluorescens[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2023， 58（3）： 1317-1325. DOI：10.1111/ijfs.16290.

[25] DINH T N， PARAT M O， ONG Y S， et al. Anticancer activities of dietary benzyl isothiocyanate： a comprehensive review[J]. Pharmacological Research， 2021， 169： 105666. DOI：10.1016/j.phrs.2021.105666.

[26] DUFOUR V， ALAZZAM B， THEPAUT M， et al. Antimicrobial activities of isothiocyanates against Campylobacter jejuni isolates[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology， 2012， 2： 53. DOI：10.3389/fcimb.2012.00053.

[27] JANG M， HONG E， KIM G H. Evaluation of antibacterial activity of 3-butenyl， 4-pentenyl， 2-phenylethyl， and benzyl isothiocyanate in brassica vegetables[J]. Journal of Food Science， 2010， 75（7）： M412-M416. DOI：10.1111/j.1750-3841.2010.01725.x.

[28] WU H Y， XU Y H， WEI L N， et al. Inhibitory effects of 3-（methylthio） propyl isothiocyanate in comparison with benzyl isothiocyanate on Listeria monocytogenes[J]. Journal of Food Measurement and Characterization， 2022， 16（2）： 1768-1775. DOI：10.1007/s11694-022-01290-9.

[29] LIU J N， WU H Y， AO X Y， et al. Characterization of the inclusion complexes of isothiocyanates with γ-cyclodextrin for improvement of antibacterial activities against Staphylococcus aureus[J]. Foods， 2021， 11（1）： 60. DOI：10.3390/foods11010060.

[30] YANG C X， WU H T， LI X X， et al. Comparison of the inhibitory potential of benzyl isothiocyanate and phenethyl isothiocyanate on Shiga toxin-producing and enterotoxigenic Escherichia coli[J]. LWT-Food Science and Technology， 2020， 118： 108806. DOI：10.1016/j.lwt.2019.108806.

[31] LIU J N， ZHANG K， SONG J， et al. Bacteriostatic effects of benzyl isothiocyanate on Vibrio parahaemolyticus： transcriptomic analysis and morphological verification[J]. BMC Biotechnology， 2021， 21： 56. DOI：10.1186/s12896-021-00716-4.

[32] WU H Y， AO X Y， LIU J N， et al. A bioactive chitosan-based film enriched with benzyl isothiocyanate/α-cyclodextrin inclusion complex and its application for beef preservation[J]. Foods， 2022， 11（17）： 2687. DOI：10.3390/foods11172687.

[33] HUANG Y， LIU J N， LI Z L， et al. Antibacterial film based on κ-carrageenan with benzyl isothiocyanate-β-cyclodextrin inclusion complex： characterization and application in chicken preservation[J]. Food Hydrocolloids， 2023， 145： 109063. DOI：10.1016/j.foodhyd.2023.109063.

[34] LI Z L， WU H Y， LIU J N， et al. Synergistic effects of benzyl isothiocyanate and resveratrol against Listeria monocytogenes and their application in chicken meat preservation[J]. Food Chemistry， 2023， 419： 135984. DOI：10.1016/j.foodchem.2023.135984.

[35] 趙玉明， 田晉梅， 彭曉光. 復合香辛料精油配方優化及對冰溫貯藏牛肉保鮮效果研究[J]. 食品研究與開發， 2017， 38（12）： 182-187. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.040.

[36] SHU H Z， ZHANG W M， YUN Y H， et al. Metabolomics study on revealing the inhibition and metabolic dysregulation in Pseudomonas fluorescens induced by 3-carene[J]. Food Chemistry， 2020， 329： 127220. DOI：10.1016/j.foodchem.2020.127220.

[37] 舒慧珍. 3-蒈烯對熒光假單胞菌的抑菌機理研究[D]. 海口： 海南大學， 2020： 25-35.

[38] 李佳林， 梁超， 黃青. 均勻交變磁場對鯽魚肉冷凍保鮮效果的影響[J].

安徽大學學報（自然科學版）， 2023， 47（6）： 37-41. DOI：10.3969/j.issn.1000-2162.2023.06.006.

[39] 沈秋霞， 王曉君， 盧朝婷， 等. 基于電子鼻技術對真空包裝三文魚片的新鮮度評價[J]. 食品與發酵工業， 2018， 44（10）： 241-247. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.01530.

[40] ZONG R， RUAN H N， LIU C M， et al. Bacteria and bacterial components as natural bio-nanocarriers for drug and gene delivery systems in cancer therapy[J]. Pharmaceutics， 2023， 15（10）： 2490. DOI：10.3390/pharmaceutics15102490.

[41] 劉曉宇. 番木瓜籽提取物異硫氰酸芐酯抑菌及應用研究[D]. 天津： 天津科技大學， 2016： 19-23.

[42] 倪榮， 郭雪松， 韓艷霞， 等. 殼聚糖復合保鮮劑對熒光假單胞菌的抑菌活性[J]. 現代食品科技， 2023， 39（12）： 178-183. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.12.1172.

[43] YAO X L， ZHU X R， PAN S Y， et al. Antimicrobial activity of nobiletin and tangeretin against Pseudomonas[J]. Food Chemistry， 2012， 132（4）： 1883-1890. DOI：10.1016/j.foodchem.2011.12.021.

[44] YANG S Z， LIU L M， LI D M， et al. Use of active extracts of poplar buds against Penicillium italicum and possible modes of action[J]. Food Chemistry， 2016， 196： 610-618. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.09.101.

[45] MALDONADO F， PACKARD T T， GóMEZ M. Understanding tetrazolium reduction and the importance of substrates in measuring respiratory electron transport activity[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology， 2012， 434/435： 110-118. DOI：10.1016/j.jembe.2012.08.010.

[46] 李遠頌， 何榮榮， 蔡佳欣， 等. 芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌活性及機制[J]. 食品科學技術學報， 2022， 40（4）： 55-63. DOI：10.12301/spxb202100543.

[47] 閆世雄， 郝亭亭， 張芯燕， 等. 香芹酚和百里香酚對畜禽腸道健康的調控[J]. 飼料研究， 2022， 45（3）： 129-133. DOI：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.026.

[48] 薩仁高娃， 胡文忠， 馮可， 等. 植物精油及其成分對病原微生物抗菌機理的研究進展[J]. 食品科學， 2020， 41（11）： 285-294. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20190603-018.

[49] 孟慶， 孫亞楠. 生姜提取物/蝦青素復配液對冷鮮牛肉保鮮效果的影響[J]. 中國食品添加劑， 2022， 33（6）： 115-121. DOI：10.19804/j.issn1006-2513.2022.06.016.

[50] JIA S L， LIU Y M， ZHUANG S， et al. Effect of ε-polylysine and ice storage on microbiota composition and quality of pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei） stored at 0 ℃[J]. Food Microbiology， 2019， 83： 27-35. DOI：10.1016/j.fm.2019.04.007.

[51] 王琳， 李宇軒， 范維， 等. 金銀花提取物對冷卻肉中假單胞菌黏附性的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（2）： 20-26. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190709-159.

[52] 潘瑩， 張曉明， 喬宏宇. 荷葉提取物與曲酸的抑菌作用及其對牛肉保鮮效果的研究[J]. 食品科技， 2023， 48（7）： 99-106. DOI：10.13684/j.cnki.spkj.2023.07.026.

[53] 楊勝平， 章縝， 程穎， 等. 牛至精油對熒光假單胞菌的抑制作用及其對冷藏三文魚品質的影響[J]. 食品科學， 2020， 41（1）： 215-222. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20190530-380.

[54] EL-DIN AHMED BEKHIT A， MORTON J D， BHAT Z F， et al. Encyclopedia of food chemistry： Volume 2[M]. Amsterdam： Elsevier， 2019： 202-210. DOI：10.1016/B978-0-08-100596-5.21665-X.

[55] 黃文權， 闞啟鑫， 劉果， 等. 冷凍及凍藏過程中雞肉的食用品質及化學質量屬性變化研究進展[J]. 食品科學， 2024， 45（6）： 326-336. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20230404-039.

[56] 呂錦濤， 舒一梅， 全威， 等. 牛肉宰后冷卻貯藏期肉色穩定性的變化及其機制[J/OL]. 食品科學， 2024： 1-14. [2024-05-09]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20240329.1707.051.html.

[57] 滿濤， 熊曉輝， 王亞楠， 等. 玉米蛋白美拉德反應產物膜對冷鮮牛肉的保鮮效果[J]. 現代食品科技， 2023， 39（4）： 154-162. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.4.0649.

[58] 王艷梅， 張校銣， 鞠貴春， 等. 肉牛宰前體表溫度和牛肉pH值間關系的研究[J]. 經濟動物學報， 2014， 18（4）： 221-227. DOI：10.13326/j.jea.2014.1054.

[59] 楊致昊， 劉暢， 竇露， 等. 蘇尼特羊宰后成熟過程中單磷酸腺苷活化蛋白激酶活性、糖酵解與肉品質指標的變化分析[J]. 食品科學， 2022， 43（11）： 156-162. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20210426-377.

[60] 黃明明， 喬維維， 章建浩， 等. 低溫等離子體冷殺菌對生鮮牛肉主要腐敗菌及生物胺抑制效應研究[J]. 食品科學技術學報， 2018， 36（4）： 17-23. DOI：10.3969/j.issn.2095-6002.2018.04.003.

[61] MI H B， QIAN C L， ZHAO Y Y， et al. Comparison of superchilling and freezing on the microstructure， muscle quality and protein denaturation of grass carp （Ctenopharyngodon idellus）[J]. Journal of Food Processing and Preservation， 2013， 37（5）： 546-554. DOI：10.1111/j.1745-4549.2012.00678.x.

[62] 李彥， 符慧靖， 秦建鵬， 等. 天然復合添加劑對鹵牛肉貯藏品質及風味的影響[J]. 中國食品學報， 2023， 23（11）： 231-245. DOI：10.16429/j.1009-7848.2023.11.023.

[63] 杜春林， 趙春萍， 譚婭. 肉類風味物質檢測技術研究進展[J]. 肉類研究， 2023， 37（8）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230517-047.

[64] 侯寶睿， 孟靜南， 顧勝， 等. 復配防腐劑對氣調包裝醬牛肉保鮮效果研究[J]. 肉類工業， 2017（4）： 28-34. DOI：10.3969/j.issn.1008-5467.2017.04.008.

[65] 顧春濤， 畢偉偉， 朱軍莉. 冷鮮牛肉貯藏中菌群結構及優勢菌致腐性的分析[J]. 食品科學， 2019， 40（18）： 76-82. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20180925-263.

[66] 黃明明， 喬維維， 章建浩， 等.低溫等離子體冷殺菌對生鮮牛肉主要腐敗菌及生物胺抑制效應研究[J]. 食品科學技術學報， 2018， 36（4）： 17-23. DOI：10.3969/j.issn.2095-6002.2018.04.003.