優勢菌掛膜法處理切削液廢液的研究

摘 要：利用優勢除油菌，通過掛膜的方式吸附在聚氨酯海綿填料中，直接處理切削液廢液。通過水質檢測儀、金相光學顯微、宏基因分析等手段，研究微生物掛膜過程、含油廢水降解情況，并分析了掛膜完成后好氧反應器中微生物物種分布特征。結果表明，在19 d優勢菌可掛膜成功，掛膜完成后COD、NH3-N、TP降解率均可達60%左右；好氧反應設備中優勢物種為固氮螺菌屬、動膠菌屬等。微生物群落與環境存在復雜的交互關系，主要包括代謝物交換、代謝物產生、信號傳導等。

關鍵詞：微生物掛膜；好氧處理；切削液廢水；群落結構

中圖分類號：X703 文獻標志碼：A 文章編號：1673-9655（2024）04-00-07

0 引言

在整個21世紀，切削加工是機械制造業的主導加工方法，約占整個機械加工工作量的90％以上。機械加工過程中，切削液的引入能有效降低加工區域的摩擦熱以及變形熱，延長了刀具壽命并保證了工件的表面質量[1]。切削加工中產生大量的切削液廢液對環境和人體所產生的危害已成為我國發展高端制造和跨入制造強國的瓶頸問題[2]。

目前切削液廢液的現場處理方法有：物理法[3， 4]、化學法[5]、生物法[2， 6]等。物理法處理切削液廢水效果不佳，而化學法處理成本較高，微生物處理技術因其無二次污染而成為研究熱點，目前，生物處理技術已被證明在工業廢水處理中發揮著重要作用[7， 8]。廢切削液經生物處理常用的方法為好氧生物處理法，一般經過好氧生物處理后水質較好，出水水質較為穩定[9]，好氧生物處理是通過好氧微生物的代謝來降解污染物。利用好氧微生物的新陳代謝等作用對污染物進行降解，根據微生物生長的載體不同，可分為活性污泥法和生物膜法[10， 11]。活性污泥法出水水質好，且運行費用低，在運行管理上比較靈活、好操控；但是也存在很多問題，相較于生物膜法，活性污泥法動力消耗和占地面積大，剩余污泥多。生物膜法則更耐沖擊，設備的占地面積小，世代周期長的微生物也可以生存。對于好氧懸浮填料生物膜工藝通常采用自然掛膜法[12]、活性污泥掛膜法、加入優勢菌掛膜[13]。目前，已有文獻資料主要集中在活性污泥掛膜法及其改進，對優勢菌掛膜過程的報道較少。另外，目前除油菌的使用主要集中在餐飲廢水[14]、采油廢水[15]、海洋油污染廢水[16]等的處理，未有利用活化的除油菌菌劑作為菌液種子進行聚氨酯海綿填料掛膜，處理切削液廢液的說明。

本文利用優勢除油菌，通過優勢菌掛膜的方式吸附在聚氨酯海綿填料中直接處理切削液廢液。文中詳細地介紹了掛膜過程中的實驗參數和實驗條件，并利用水質檢測儀、金相光學顯微、宏基因分析等手段，研究了微生物優勢菌掛膜過程、含油廢水的降解情況，最后通過宏基因技術分析了掛膜完成后好氧反應器中微生物物種分布特征。

1 實驗材料與設備

1.1 實驗材料

1.1.1 菌液種子

菌液種子按照活化劑：菌粉：水=1：10：100比例配制。菌粉為BioPower系列微生物菌劑，活化劑為BioNutrition 菌種活化劑。BioPower系列微生物菌劑均由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室開發，主要成分為芽孢桿菌、假單胞菌及其營養劑等，有效活菌數≥50億/g；產品性狀：褐色固體粉末；適用范圍：適用于各類含油廢水，如采油廢水、石化廢水、食堂廢水以及油脂類食品加工廢水等；產品功能：針對性分解油脂類、脂肪烴、芳香烴，能快速消除水體表面的油脂，解除油污對污水活性的抑制，快速降低出水含油量，提高污水整體系統COD的去除率。

1.1.2 處理液

好氧反應器進液為切削液廢液稀釋水。切削液廢液取自東莞某機械加工廠，切削液COD濃度在12萬～15萬mg/L左右。進液初始稀釋比設置1：100。

1.1.3 改性的聚氨酯海綿材料

聚氨酯海綿材料經改性后，除物理吸附外，載體表面還帶有一定的陽離子活性基團及羥基等親水性基團，可以將微生物等固定在載體上，不易在剪切力作用下流失[7]。聚氨酯海綿填料，呈多孔網狀結構，各氣孔均勻貫通，孔隙率達97%以上，比表面積大，可作多方位培菌載體，不易堵塞[18， 19]。好氧池填料體積投加率按總體積50%計算，單個海綿填料體積為2×2×2 cm3。

1.2 實驗設備

實驗室自主設計的好氧反應設備見圖1。設備上端為曝氣泵及氣體流量計，設備底部放置曝氣盤。好氧反應器中加入50%聚酯海綿填料后，加入清水加入容積1%的菌液種子悶3 d后，進模擬廢液。設備運行參數設置為：①設計初始進水水力停留時間16 h；②溶解氧（DO）質量濃度控制在1.5～4 mg/L [20]；③溫度：最適28～35℃；④pH：7～8，好氧池最適pH應為7～8[21]；⑤鹽度：≤30000 mg/L。

2 分析方法

2.1 生物膜量測定方法

①取出2～3個海綿填料，浸泡在超純水中，洗去可逆附著成分（非生物膜部分）；②在103～105℃條件下烘干4 h至質量恒定，稱得質量m1；③將填料置于0.1 mol/L NaOH堿液中超聲30 min，機械剝離處理，用超純水洗凈；④再次烘干4 h，稱得質量m2。m2與m1之差除以填料單位數即為單個填料上的生物膜量。

2.2 掛膜情況測定

在好氧池啟動的5 d，12 d，19 d分別檢測掛膜情況：將填料在103～105℃條件下烘干4 h后，采用金相光學顯微鏡WYJ-55XA顯微鏡（放大100倍）觀察掛膜情況。

2.3 生物膜絮體鏡檢

在好氧池啟動的5 d、12 d、19 d分別取海綿填料絮體，采用金相光學顯微鏡WYJ-55XA顯微鏡（放大100倍）觀察填料內絮體生長狀況。

2.4 水質分析

DO采用DO便攜式分析儀分析；細菌數數目利用紫外可見分光光度計（UV-Visible Spectrophotometer）檢測OD600；表面/界面張力儀DCAT 25測定廢油液的表面張力及密度；水質含油量采用SH-21A系列紅外測油儀進行檢測[22， 23]。

COD采用重鉻酸鉀氧化法（GB 11914—89）[24]，氨氮分析采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009），硝酸鹽氮分析采用紫外可見分光光度法（HJ/T 346—2007），TP采用過硫酸鉀消解鉬酸銨分光光度法（GB 11893—89）進行檢測。水質檢測前需進行離心過濾預處理，以便去除檢測液中的懸浮物和菌體[25]。

2.5 宏基因檢測

取好氧反應器中海綿填料擠壓得到含菌液，含菌液經高速離心富集后取下層沉淀送北京諾禾致源科技股份有限公司進行宏基因檢測。宏基因檢測的步驟主要包括樣品DNA提取—瓊脂糖凝膠電泳（AGE）分析DNA的純度和完整性—Qubit對DNA濃度進行精確定量—文庫構建—Agilent2100對文庫的insert size進行檢測—上機進行Illumina PE150測序—下機質控—從gene catalogue出發，和MicroNR庫進行比對，獲得每個基因（Unigene）的物種注釋信息，并結合基因豐度表，獲得不同分類層級的物種豐度表，分析優勢菌掛膜成功后，好氧反應器內微生物菌落在不同層級的物種分布特征。

3 實驗結果

3.1 切削液廢液性質

取切削液廢液檢測其中主要污染物濃度，每組實驗平行檢測3次，增加實驗準確性，檢測結果見表1。切削液廢液COD平均濃度為124160 mg/L，NH3-N平均濃度為4261 mg/L，TP平均濃度為175 mg/L。廢液密度為7.1233 g/m3，pH堿性，油水混合體系為O/W體系。使用表面/界面張力儀DCAT 25測定廢油液的表面張力及密度，得到在T=25.3°C，體系表面張力SFT=30.98±0.028 mN/m。

切削液廢液密度為7.1233 g/m3。水質含油量采用SH-21A系列紅外測油儀進行檢測，得到切削液廢油液的含油量為5360 mg/L。

3.2 除油優勢菌掛膜過程表征

3.2.1 表觀形貌變化

觀察啟動過程中海綿填料表觀形貌變化見圖2。圖中可見好氧反應器啟動5 d，海綿填料內部形成透明淡黃色生物膜；好氧反應器啟動12 d，海綿填料內部仍透明，但黃色加深；好氧反應器啟動15 d，海綿填料內部形成黃褐色不透明生物膜；好氧反應器啟動19 d，海綿填料內部形成黑色生物膜。掛膜完成后，測定水中OD600的值在0.727～1.106，細菌數可達109 cfu/mL。馬睿莉等[17]使用聚氨酯海綿填料進行優勢菌掛膜，可在21 d內完成掛膜。掛膜完成后聚氨酯海綿填料內部可形成小型厭氧區域，好氧池內同時進行好氧、厭氧反應。

3.2.2 生物量測定結果

取出2個海綿填料，浸泡在超純水中，洗去可逆附著成分后，在103～105℃條件下烘干4 h至質量恒定。將填料置于0.1 mol/L NaOH堿液中超聲30 min，機械剝離處理，用超純水洗凈再次烘干4 h至質量恒定。通過2次質量差除以填料單位數即為單個填料上的生物膜量。生物量測定結果見表1。

好氧反應器啟動5 d后，實際單個海綿填料生物量為0.08±0.001 g；好氧反應器啟動12 d后，實際單個海綿填料生物量為0.11±0.005 g；好氧反應器啟動19 d后，實際單個海綿填料生物量為0.125±0.005 g。

3.2.3 絮體金相顯微鏡鏡檢結果

好氧反應器啟動5 d、12 d、19 d分別取海綿填料絮體，采用金相光學顯微鏡WYJ-55XA顯微鏡（放大100倍）觀察填料內絮體生長狀況，檢測結果見圖3海綿填料絮體鏡檢圖。從圖中可以看出原海綿填料呈多孔網狀結構，各氣孔均勻貫通，比表面積大，可多方位負載微生物。好氧反應器啟動5 d時，填料內絮體較少，僅在部分網狀結構表面負載生物膜。好氧反應器啟動12 d時，填料內絮體增多，絮體體積可占孔體積30%～50%。好氧啟動19 d時，填料內生物膜厚度增加，可填滿海綿孔隙，顏色呈中間不透明，邊緣透明狀。取出海綿填料中絮體進行鏡檢（圖4）可以觀察到生物膜絮體緊實，不易松散；絮體可聚集油滴，增大油滴粒徑。

3.3 運行參數優化

生化系統掛膜初期，進液稀釋比設置為1：100。系統穩定運行后，逐步提高進液中切削液廢液進液濃度。實驗中采用3個不同梯度設置稀釋比，依次按不同稀釋比進液，運行穩定后檢測出水污染物濃度。在不同進液梯度下分析生化系統對COD、NH3-N、TP的降解效果見表2。切削液廢液：稀釋水比值為1：100時，檢測到出水COD濃度大于進水COD濃度，可能是由于切削液廢液稀釋比高，不可生化降解的物質積累導致。如前期研究得到硼酸及三乙醇胺硼酸鹽均為生化處理難降解產物，可在好氧系統中富集。當稀釋比1：30時，出水中COD降解率為52.69%、NH3-N降解率為31.45%、TP降解率為35.1%；當稀釋比1：10時，出水中主要污染物COD、NH3-N、TP降解率最高可達到70%。根據前期大量預實驗經驗，僅好氧生化處理切削液廢液的最大處理效率為40%～70%，因此后續實驗中將稀釋比確定為1：10連續進液反應。

3.4 連續運行處理效果分析

按稀釋比1：10連續進液，在開始進液后2 h、4h、8 h、24h、48h取樣，分別檢測出水主要污染物濃度變化。好氧反應進水切削液廢液的各項指標為COD 12416 mg/L，NH3-N 426.1 mg/L，TP 17.5 mg/L。出水中主要污染物濃度的變化及去除率見圖5。從圖5中可以看出好氧反應設備連續運行時，出水COD降解率在64%～69%內波動，NH3-N降解率在63%～70%內波動，TP降解率在56%～68%內波動。

3.5 微生物群落分析

好氧反應設備穩定運行后檢測其中微生物群落在門、屬、種層級上的優勢群落組成，為后續針對切削液廢液篩菌提供理論依據，微生物群落分析結果如下。

3.5.1 門水平的優勢菌群分布特征

門水平上好氧反應器內微生物物種分布如圖6所示。門水平占優勢的菌群變形菌門（Pseudomonadota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、彎曲桿菌門（Campylobacterota）、厚壁菌門（Bacillota）、熱脫硫桿菌門（Thermodesulfobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）等。其中變形菌門（Pseudomonadota）占總群落數的61%，在細菌群落中占比64%。擬桿菌門（Bacteroidetes）占總群落數的9%，在細菌群落中占比9%。彎曲桿菌門（Campylobacterota）占總群落數的6%，在細菌群落中占比7%；厚壁菌門（Bacillota）占總群落數的5%，在細菌群落中占比5%。此外，熱脫硫桿菌門（Thermodesulfobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）均分別占總群落數的4%，占細菌群落的4%。

3.5.2 屬水平的優勢菌群分布特征

圖7為好氧生化系統優勢屬分析。從圖中可知，占比前三的優勢屬分別為固氮螺菌屬（Azospirillum）占總群落數的8%、動膠菌屬（Zoogloea）占總群落數的7%、食酸菌屬（Acidovorax）占總群落數的7%。分析各屬進化關系得：固氮螺菌屬（Azospirillum）屬于變形菌門（Pseudomonadota）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、紅螺菌科（Rhodospirillaceae）。動膠菌屬（Zoogloea）屬于變形菌門（Pseudomonadota）、β—變形菌綱（Betaproteobacteria）、紅環菌目（Rhodocyclales）、紅環菌科（Rhodocyclaceae）。食酸菌屬（Acidovorax）屬于變形菌門（Pseudomonadota）、β—變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）。綜合上述分析得，切削液廢水生物處理過程中發揮作用的主要細菌種類均屬于變形菌門。

3.5.3 TOP10群落種分布特征

種水平上好氧反應器內微生物物種分布如圖8所示，從圖中可以得到好氧反應設備中參與降解切削液廢液的微生物優勢物種為Sphingomonadales bacterium、Acinetobacter rudis、Seleniivibrio woodruffii、Acidovorax caeni、Aliarcobacter butzleri、Zoogloea ramigera、Bacteroidia bacterium 43-41、Azospira inquinata、Azospirillum fermentarium、Extensimonas perlucida。其中占比最大的為Azospirillum_fermentarium占總群落數的7%，該菌屬于變形菌門（Pseudomonadota）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、固氮螺菌屬（Azospirillum）。Zoogloea_ramigera占總群落數的5%，該菌屬于變形菌門（Pseudomonadota）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、紅環菌目（Rhodocyclales）、紅環菌科（Rhodocyclaceae）、動膠菌屬（Zoogloea）。

3.6 群落基因功能分析

利用KEGG數據庫分析微生物群落的生物代謝通路見圖9a；樣品在eggNOG數據庫中level1層級上的TOP10基因相對功能豐度統計圖見9b。從圖中分析得，好氧反應器除油優勢菌掛膜成功后，設備內微生物菌落基因的主要功能包括：翻譯、核糖體結構和生物發生；碳水化合物運輸和代謝；無機離子運輸和代謝；轉錄；信號傳導機制；細胞壁/膜/包膜生物發生；能源生產和轉換、復制、重組和修復；氨基酸運輸和代謝。微生物群落的生物代謝通路結果顯示群落基因5.1%與細胞過程相關、6.8%與環境信息處理相關、4.7%與遺傳信息處理相關、2.2%與人類疾病相關、1.8%與新陳代謝相關、1.3%與生物體系統相關。綜合分析得，掛膜成功后的微生物群落與環境存在復雜的交互關系，主要包括代謝物交換、代謝物產生、信號傳導等。

4 結論

（1）進水所用的切削液廢液COD含量高，削液廢液中出現得可檢測得化合物種類共52種，主要物質包括醇類、胺類、醚類、酸酯、羧酸、硼酸、醋酸、烴類等。

（2）除油優勢菌掛膜完成后好氧反應器內形成黑色生物膜，OD600的值在0.727～1.106，COD、NH3-N、TP降解率可達到60%以上。對微生物絮體進行鏡檢可以觀察到生物膜絮體緊實，不易松散。絮體具有聚集油滴，增大油滴粒徑的作用。

（3）切削液廢水生物處理過程中發揮作用的主要細菌種類均屬于變形菌門；好氧反應設備中微生物優勢菌屬TOP3分別為固氮螺菌屬、動膠菌屬、食酸菌屬；優勢種為Azospirillum_fermentarium和Zoogloea_ramigera。微生物群落與環境存在復雜的交互關系，主要包括代謝物交換、代謝物產生、信號傳導等。

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