二甲雙胍通過TGF-β1/Smads通路抑制肝癌細胞的增殖和遷移

摘 要：為探究二甲雙胍對人肝癌細胞的增殖、遷移及TGF-β1/Smads信號通路的調控作用，體外培養人肝癌MHCC97H細胞，分為對照組（不做干預）、1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組和抑制劑組（5.00 mmol/L二甲雙胍+10 μmol/L LY2109761）。本研究中5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞活力接近50%，故選其為最佳濃度。用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）、Transwell小室、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）及蛋白免疫印跡法對人肝癌MHCC97H細胞的增殖活力、增殖率、遷移能力及相關因子的表達水平進行分析。與對照組相比，2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組和抑制劑組細胞的增殖活力、增殖率減少（Plt;0.05）。1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組和抑制劑組細胞的遷移數、TGF-β1和p-Smad3蛋白的表達水平、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）及纖維黏連蛋白（FN）的mRNA與蛋白質的表達水平較對照組減少，而p-Smad7蛋白的表達水平、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的mRNA與蛋白質的表達水平顯著增加，且濃度越高變化越顯著（Plt;0.05）；與5.00 mmol/L二甲雙胍組相比，抑制劑組抑制劑的加入使各指標變化更顯著（Plt;0.05）。二甲雙胍可抑制人肝癌MHCC97H細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化（EMT）依賴于對TGF-β1/Smads通路的抑制作用，這為肝癌的研究提供了參考依據。

關鍵詞：肝癌；二甲雙胍；轉化生長因子-β1/Smads信號通路；細胞增殖；細胞遷移

中圖分類號：R735.7 " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.04.008

Metformin Inhibits Proliferation and Migration of Liver Cancer Cells Through TGF-β1/Smads Pathway

CHEN Shengsong1*， LI Huanhuan1， WU Huirong2

（1. Department of Oncology， Chengdu BOE Hospital， Chengdu 610200， China; 2. Department of Oncology， Wuhou District Third People’s Hospital， Chengdu 610200， China）

Abstract： In order to explore the regulatory effects of metformin on the proliferation， migration and TGF-β1/Smads signaling pathway of human liver cancer cells， human liver cancer MHCC97H cells were cultured in vitro. They were divided into control group （no intervention）， 1.25， 2.50， 5.00 mmol/L metformin group and inhibitor group （5.00 mmol/L metformin +10 μmol/L LY2109761）. In this study， the cell viability of 5.00 mmol/L metformin group was close to 50%， hence 5.00 mmol/L metformin was selected as the optimal concentration. Cell counting kit-8 （CCK-8） ， 5-acetylidene-2' deoxyuracil riboside （EdU）， Transwell chamber， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot were used to analyze the proliferation activity， proliferation rate， migration ability and expression levels of related factors of human hepatocellular carcinoma MHCC97H cells. Compared with the control group， the proliferation activity and proliferation rate of 2.50 and 5.00 mmol/L metformin groups and inhibitor groups decreased （Plt;0.05）. The cell migration number， TGF-β1 and p-Smad3 protein expression levels， N-cadherin， vimentin and fibronectin （FN） mRNA and protein expression levels of 1.25， 2.50 and 5.00 mmol/L metformin groups and inhibitor group decreased compared with the control group. The expression level of p-Smad7 protein， E-cadherin mRNA and protein significantly increased， and the changes were more significant with the increase of concentration （Plt;0.05）. Compared with 5.00 mmol/L metformin group， the addition of inhibitors in the inhibitor group made the changes of all indexes more significant （Plt;0.05）. The inhibition of metformin on the proliferation， migration and epithelial-mesenchymal transformation （EMT） of MHCC97H cells of human liver cancer depends on the inhibition of TGF-β1/Smads pathway， which provides a reference for the study of liver cancer.

Key words： liver cancer; metformin; TGF-β1/Smads signaling pathway; cell proliferation; cell migration

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（4）： 357-364）

肝癌（liver cancer）屬于臨床常見危害性較大的惡性腫瘤之一，在全球范圍內的癌癥中死亡率和復發率位居前列。根據全球癌癥統計數據顯示，每年大約有750 000人死于肝癌，且該病具有發展速度快、惡性程度高的特點［1］。臨床上通常采用手術切除治療肝癌，輔助以放化療，但由于肝癌病發具有隱匿性，通常發現時就已為中晚期，大多數患者失去了最佳的手術治療的機會，且由于進行放化療對患者的機體具有相對較大的毒副作用，因此，找尋更具療效且相對安全的藥物對于臨床肝癌的治療意義重大。臨床治療2型糖尿病時，二甲雙胍（metformin）是較常用的一類藥物。近年來的研究顯示，二甲雙胍對乳腺癌、肝癌等腫瘤的生長和轉移具有一定的抑制作用［2-3］，但二甲雙胍與肝癌之間的作用需要探索。TGF-β1/Smads是一種重要的胞內通路，可以參與調控多種細胞的生長、凋亡、侵襲等過程，有研究顯示，TGF-β1對腫瘤細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有一定的誘導作用，TGF-β1在肝癌組織中高表達，可被用于判斷肝癌的惡性程度及預后［4-5］。但目前二甲雙胍與TGF-β1/Smads信號通路的關系在肝癌中尚不明確，因此，本試驗基于此方向進行研究，旨在為肝癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人肝癌MHCC97H細胞購自上海中科院細胞庫。二甲雙胍（純度≥98%）、TGF-β1/Smads通路抑制劑LY2109761（純度≥99%）購自源葉/上海；蛋白裂解液、細胞計數試劑盒-8（Cell count kit -8，CCK-8）購自南京諾唯贊公司；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-acetylidene-2' deoxyuracil nucleoside，EdU）試劑盒購自上海Beyotime公司；一抗包括TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad7、纖維黏連蛋白（fibronectin，FN）、波形蛋白（vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）及β-actin，均購自英國Abcam公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記的二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。完全培養基為10%胎牛血清+改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）。儀器包括BB150型二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）、DM2000光學顯微鏡（德國徠卡公司）、DM IL LED熒光顯微鏡（德國徠卡公司）、GelDoc2000型凝膠成像系統（美國Backman公司）、SpectraMax Mini多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

在培養基（含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM完全培養基）中接種MHCC97H細胞，條件設置為37℃、5% CO2，傳代（密度達到80%）后用于試驗研究。

1.2.2 分組及給藥

將MHCC97H細胞分為5組：對照組、1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組、抑制劑組。對照組細胞不作干預，1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組分別加入1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍進行處理。根據細胞活力試驗得到5.00 mmol/L二甲雙胍為最佳濃度，故抑制劑組細胞加入5.00 mmol/L二甲雙胍和10 μmol/L LY2109761進行處理，各組（重復3次）分別干預24 h。

1.2.3 細胞的增殖活力的測定

將細胞于96孔板上進行接種（細胞密度為1×104個/孔）后，加藥進行培養（24 h），再加入CCK-8溶液（10 μL）反應完成（2 h）后，測各孔在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值并進行計算。細胞活力為OD對照組/1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組/抑制劑組與OD對照組的百分比。

1.2.4 細胞的增殖率的測定

各組在處理24 h后，利用EdU對細胞孵育2 h，依次進行如下步驟：固定30 min（4%多聚甲醛），透化10 min（0.3% TritonX-100），避光孵育30 min（100 μL Click反應液）；再利用Hoechst對細胞進行復染，裝片后，進行圖片的采集，利用Image J軟件對細胞數進行分析。紅色占藍色細胞數的百分比為細胞增殖率。

1.2.5 細胞的遷移能力的測定

各組藥物干預后用胰蛋白酶進行消化并離心，重懸細胞，對細胞懸液濃度進行調整（4.5×105個/mL）。Transwell上室加細胞懸液200 μL，下室加含10%胎牛血清的細胞培養液500 μL。在37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，采用甲醇對小室進行15 min固定，染色（1%結晶紫染色液）20 min。光學顯微鏡下觀察拍照，Image J分析遷移細胞數。

1.2.6 細胞中EMT相關因子mRNA相對表達量的測定

提取各組的細胞總RNA，利用超微量分光光度計法檢測濃度、純度，逆轉錄試劑盒逆轉得到的第一鏈DNA通過PCR儀進行片段擴增，內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），使用2-△△CT法計算目的mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

1.2.7 細胞中EMT和TGF-β1/Smads通路相關蛋白表達的測定

干預后提取蛋白，定量并上樣，進行凝膠電泳，轉膜，利用脫脂牛奶法進行膜封閉，接著加入抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad7、FN、vimentin、N-cadherin、E-cadherin及β-actin的抗體稀釋液，4℃孵育過夜；隨后使用二抗稀釋液，室溫孵育2 h；最后加入堿性磷酸酯酶染色工作液，室溫避光孵育30 min或更長時間，最后在凝膠成像系統中進行圖片采集。蛋白灰度值的分析方法為Image J軟件，目的蛋白表達值用目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值來表示。

1.3 統計學分析

利用GraphPad Prism 9軟件作圖，利用Image J軟件分析計算蛋白灰度值，所有數據均符合正態分布。數據以平均值±標準差（x±s）表示，多組間利用單因素方差分析，兩組間采用Dunnett’s t檢驗。Plt;0.05為差異性有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 細胞增殖活力的比較

2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞增殖活力低于對照組（Plt;0.05）。抑制劑組細胞的增殖活力低于5.00 mmol/L二甲雙胍組（Plt;0.05）（圖1）。

2.2 細胞增殖率的比較

2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞增殖率低于對照組（Plt;0.05）；抑制劑組細胞的增殖率則低于5.00 mmol/L二甲雙胍組（Plt;0.05）（圖2）。

2.3 細胞遷移能力的的對比

1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組和抑制劑組的遷移數低于對照組（Plt;0.05）；抑制劑組的遷移數低于5.00 mmol/L二甲雙胍組（Plt;0.05）（圖3）。

2.4 細胞中EMT相關因子表達水平的比較

由圖4可見，各處理組N-cadherin、vimentin和FN的mRNA和蛋白質的表達水平均低于對照組，E-cadherin的mRNA和蛋白質的表達水平高于對照組（Plt;0.05）。抑制劑組N-cadherin、Vimentin和FN的mRNA和蛋白質的表達水平低于5.00 mmol/L二甲雙胍組，E-cadherin的mRNA和蛋白質的表達水平高于5.00 mmol/L二甲雙胍組（Plt;0.05）。

2.5 細胞中TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達水平的比較

由圖5可知：1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組和抑制劑組TGF-β1和p-Smad3蛋白的表達水平低于對照組，p-Smad7蛋白的表達水平高于對照組（Plt;0.05）；Smad3蛋白的表達水平差異無統計學意義（Pgt;0.05）；抑制劑加入后，與5.00 mmol/L二甲雙胍組相比，TGF-β1和p-Smad3蛋白的表達水平進一步減少，而p-Smad7蛋白的表達水平增加（Plt;0.05）。

3 討論

在全球癌癥中，肝癌有著較高的死亡率，病因較復雜，環境、肥胖及基因遺傳等都會成為其發病的誘因。近年來，其發病率呈現逐年上升且年輕化的趨勢。大多數患者在早期幾乎沒有明顯的癥狀，診療時往往已是中晚期。目前治療肝癌的手段尚存在復發等問題。因此，對肝癌治療藥物相關機制進行相關研究，在臨床輔助治療肝癌方面具有極為重要的意義。

二甲雙胍是雙胍類口服降糖藥，其發現由來已久。17世紀，Nicholas Culpeper發現了山羊豆的抗糖尿病作用；19世紀初，人們發現山羊豆含大量胍類化合物，且證實其具有降血糖功效；1922年，愛爾蘭科學家Werner和Bell首次人工合成了二甲雙胍，但使其真正的成為臨床降糖藥物是Jean Sterne。自此，二甲雙胍由于其低毒、價廉、效果佳的特點，成為了治療2型糖尿病的臨床藥物［6-7］。二甲雙胍能夠抑制包括前列腺癌、結腸癌及肺癌在內的等多種惡性腫瘤，且能夠抑制其細胞增殖，進而發揮抗腫瘤作用［8-11］。Ma等［12］通過Meta分析發現，二甲雙胍可以降低糖尿病患者的肝癌發生率。Kim等［13］的研究顯示，二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞的增殖。這提示，二甲雙胍能夠在一定程度上抑制肝癌細胞的惡性生物學反應，但其作用機制當前尚不清晰。本研究發現，2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞活力、增殖活力高于對照組，且1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞遷移能力低于對照組，提示二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞的增殖和遷移。胡晨等［14］的研究表明，二甲雙胍可以逆轉EMT，抑制癌細胞的增殖和遷移。在肝癌中，二甲雙胍抑制EMT也有相關報道［15］。本研究發現，1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍組中N-cadherin、vimentin和FN的mRNA與蛋白質的表達水平較對照組減少，E-cadherin的mRNA與蛋白質的表達水平較對照組增加，說明二甲雙胍對肝癌細胞的EMT進程具有抑制作用。

TGF-β1/Smad信號通路具有多種生物學活性，參與腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等過程，是比較經典的信號傳導通路［16］。TGF-β1和Smad7在肝癌組織中表達顯著，說明TGF-β1/Smads通路參與了肝癌的發生發展［17］。因此，調控TGF-β1/Smads通路的表達和治療肝癌直接具有密切關系。研究表明，TGF-β1是目前研究較為廣泛、有效的EMT誘導因子之一，能夠誘導腫瘤細胞發生EMT［18］。EMT是癌細胞轉移的關鍵，抑制癌癥細胞中的EMT有助于控制癌細胞的轉移。已有研究表明，二甲雙胍在宮頸癌中可以逆轉TGF-β1建立的EMT，其可通過抑制SMAD3的磷酸化打斷與其他因子間的相互作用，抑制黑色素瘤的發生發展［19-20］。呂美嫻等［21］研究表明，在肝癌中，TGF-β1/Smad通路與細胞遷移和EMT進程相關。另有研究顯示，TGF-β/Smad通路與肝癌細胞遷移作用有關［22］。在本研究中，各處理組E-cadherin的mRNA與蛋白質的表達水平、p-Smad7蛋白的表達水平較對照組增加，TGF-β1、p-Smad3蛋白的表達水平、N-cadherin、vimentin、FN的mRNA和蛋白質的表達水平較對照組減少，說明二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞的EMT進程。本研究發現5.00 mmol/L二甲雙胍組細胞活力接近50%，故選擇該濃度進行后續試驗。結果顯示，抑制劑組細胞的增殖活力、增殖率、遷移數以及TGF-β1、p-Smad3、N-cadherin、vimentin和FN相關蛋白的表達水平較5.00 mmol/L二甲雙胍組減少，E-cadherin和p-Smad7蛋白的表達水平較5.00 mmol/L二甲雙胍組增加。這提示，二甲雙胍可以抑制MHCC97H細胞增殖、遷移及EMT進程，可能依賴于TGF-β1/Smad通路抑制。

綜上所述，二甲雙胍可抑制MHCC97H細胞的增殖、遷移及EMT進程，依賴于對TGF-β1/Smad通路的抑制作用。但目前對于二甲雙胍的抗肝癌作用的分子傳導機制有待進一步深入探討。

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