尖尾芋一未知葉部病害的病原菌分離與鑒定

摘 要：為明確重慶市萬(wàn)州區(qū)種植的尖尾芋出現(xiàn)的一種葉部病害病原菌的種類(lèi)，采集受病原菌感染的尖尾芋葉片樣本，并對(duì)樣本進(jìn)行表面消毒處理，成功分離出病原菌。對(duì)該病原菌進(jìn)行培養(yǎng)和純化處理，最終得到純化后的病原菌菌株。對(duì)該病原菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察和生理生化試驗(yàn)，初步確認(rèn)該病原菌為真菌。通過(guò)DNA序列分析和比對(duì)，最終確定該病原菌為平頭炭疽菌。

關(guān)鍵詞：尖尾芋；炭疽病；分離鑒定；平頭炭疽菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2024）6-78-6

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.06.016

0 引言

尖尾芋［Alocasia cucullata（Lour.）Schott］又名老虎芋、大麻芋，是天南星科（Araceae Juss.）海芋屬（Alocasia）植物［1］，生品有毒，以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫鎮(zhèn)痛的功效［2］，內(nèi)服可治療高熱不退、流感和肺結(jié)核等疾病，外敷可治療疔瘡、燙火傷、毒蛇咬傷和毒蜂蜇傷等［3］，也是一種觀(guān)賞植物。在種植尖尾芋過(guò)程中，常見(jiàn)的病害有褐斑病、炭疽病、灰霉病、葉斑病，會(huì)導(dǎo)致尖尾芋葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)、枯萎、腐爛等癥狀，嚴(yán)重影響尖尾芋的產(chǎn)量和品質(zhì)，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。

2022—2023年，在重慶市萬(wàn)州區(qū)種植的尖尾芋出現(xiàn)一種葉部病害，發(fā)病部位失綠變?yōu)榛野咨笃诔霈F(xiàn)穿孔破損的現(xiàn)象，且之前沒(méi)有此類(lèi)病害的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

從重慶市萬(wàn)州區(qū)（東經(jīng)108°22′、北緯30°32′）尖尾芋種植基地采集具有典型癥狀的尖尾芋葉片作為供試病樣。試驗(yàn)使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，其配制方法如下：取馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL，于121 ℃下用高壓蒸汽滅菌20 min［5］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化

采用常規(guī)組織分離法［6］對(duì)采集到的、具有典型癥狀的葉片進(jìn)行分離。在病健交界處剪取5 mm×5 mm的組織塊，先用75%乙醇對(duì)其消毒30 s，之后用無(wú)菌水清洗1次，再用5%次氯酸鈉對(duì)其浸泡3 min，并用無(wú)菌水清洗3次。用無(wú)菌濾紙將樣品表面的水分吸干，將其接種到PDA培養(yǎng)基上，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5 d，用單孢分離法對(duì)病原菌進(jìn)行純化處理［7］。

1.2.2 外貌特征檢查

將純化后的菌株置于新的PDA平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，觀(guān)察并記錄菌落的形態(tài)［8］。在顯微鏡下觀(guān)察分生孢子、分生孢子盤(pán)，并測(cè)量分生孢子的大小（n=50）。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用真菌基因組DNA抽提試劑盒［購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司］提取病原菌的DNA。選用ITS、ACT、CHS-1、TUB2、GAPDH引物（見(jiàn)表1）對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的BLAST進(jìn)行對(duì)比，下載相關(guān)序列后，用MEGA11軟件對(duì)擴(kuò)增后的序列進(jìn)行單基因序列對(duì)齊與剪切，使用PhyloSuite軟件將擴(kuò)增序列按ITS-GAPDH-CHS-1-ACT-TUB2的順序進(jìn)行拼接，并利用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）來(lái)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 致病性測(cè)定

將純化后的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，并制備成直徑為5 mm的菌餅。選取健康成熟的尖尾芋葉片，用無(wú)菌接種針在尖尾芋葉片主脈兩側(cè)對(duì)稱(chēng)穿刺2次，并將菌餅正面緊貼在葉片一側(cè)穿刺處，在主脈另一側(cè)穿孔處接種相同規(guī)格的無(wú)菌PDA塊（作為對(duì)照），重復(fù)3次。接種后，將葉片放在溫度為28 ℃、相對(duì)濕度為85%的恒溫恒濕箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀(guān)察并記錄葉片的發(fā)病情況，直至葉片出現(xiàn)與田間相似的癥狀為止，對(duì)病斑再次進(jìn)行分離鑒定，確定其與提取的病原菌是否一致，從而完成科赫法則驗(yàn)證［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

種植的尖尾芋于5— 6月開(kāi)始發(fā)病，7—8月重慶市氣溫升高，該病發(fā)病嚴(yán)重，重病區(qū)的發(fā)病率可達(dá)45%。感染該病后，癥狀主要出現(xiàn)在葉片的中下部，會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則的片狀病斑，邊緣呈水漬狀，中央失綠變?yōu)榛野咨笃诖┛灼茡p，嚴(yán)重時(shí)病斑會(huì)連接成片，甚至?xí)斐扇~片壞死。尖尾芋炭疽病田間癥狀如圖1所示。

2.2 病原菌的外貌特征

在PDA培養(yǎng)基上，該病原菌菌落呈圓形，表面光滑且質(zhì)地較為濕潤(rùn)，邊緣較為模糊。尖尾芋炭疽病病原菌形態(tài)特征如圖2所示。菌落外層為灰白色，邊緣欠規(guī)則，中層為黃棕色，中心層為棕褐色，菌落中層和中心層上有不規(guī)則的白色濃密菌絲纏繞；剛毛為黑色，呈尖狀突起；分生孢子為淺綠色，類(lèi)似于新月形或鐮刀形，兩頭鈍尖，大小為（15.32～28.51 μm）×（3.04～6.23 μm）［15］。

2.3 致病性測(cè)定

健康葉片在接種菌餅后的第3 d開(kāi)始出現(xiàn)黃褐色病斑，病斑直徑為11～13 mm。而接種PDA瓊脂塊的一側(cè)僅有刺傷，沒(méi)出現(xiàn)其他病變［16］。接種病原菌后的尖尾芋葉片上的病癥如圖3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，在接種菌餅7 d后，接種葉片的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相似度非常高。從病變組織中重新分離病原菌，經(jīng)過(guò)純化和分子鑒定后，能成功分離出與供試菌株相同種類(lèi)的病原菌，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了科赫法則［17］。

2.4 病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

用最大似然法來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖4所示，建立進(jìn)化樹(shù)需要用到的登錄號(hào)見(jiàn)表2。多基因分析結(jié)果表明，菌株JWY8、JWY14、JWY18與平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）CBS 120709聚在一支，支持率為100%，將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI/GenBank，從而獲得登錄號(hào)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，從而將重慶市萬(wàn)州區(qū)種植的尖尾芋感染的炭疽病病原菌鑒定為平頭炭疽菌（C. truncatum）。

3 結(jié)束語(yǔ)

筆者結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因聯(lián)合分析，確定重慶市萬(wàn)州區(qū)種植的尖尾芋感染的炭疽病病原菌為平頭炭疽菌。這是由平頭炭疽菌引起尖尾芋炭疽病的首次報(bào)道。平頭炭疽菌是較為常見(jiàn)的致病菌，在大豆［18］、花生［19］和辣椒［20］等作物生長(zhǎng)過(guò)程中均有發(fā)生。1961年，美國(guó)植物病理學(xué)家Jenkins等在利馬豆上首次發(fā)現(xiàn)平頭炭疽菌，并將其認(rèn)定為一個(gè)單獨(dú)的種類(lèi)［21］。2012年，Lachado等［22］在研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的平頭炭疽菌在形態(tài)學(xué)、生理特征和遺傳水平上存在較大差異，從而將其認(rèn)定為一個(gè)復(fù)合種。平頭炭疽菌復(fù)合種包括短孢炭疽菌（C. brevisporum）［23］、尖孢炭疽菌（C. acutatum）［24］ 、平頭炭疽菌（C. truncatum）［22］和球花炭疽菌（C.incanum）［25］等。其中，平頭炭疽菌是炭疽菌復(fù)合種的代表性種類(lèi)［22］。

炭疽病是一種常見(jiàn)的植物病害，由炭疽菌引起。炭疽菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的致病菌，寄主范圍廣、變異豐富，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量造成嚴(yán)重危害。炭疽病可使植物葉片、莖、果實(shí)等部位發(fā)生病變，從而嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。炭疽菌通過(guò)孢子在植物之間傳播，易在潮濕環(huán)境下擴(kuò)散。因此，對(duì)炭疽病的防治顯得至關(guān)重要。采用合理的病害防控措施（如早期發(fā)現(xiàn)、清除病原菌、合理施肥、選用抗病品種等），能有效減輕炭疽病對(duì)農(nóng)作物的危害。

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基金項(xiàng)目：重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2020jscx-tpyzxX0007）；重慶市教委重點(diǎn)項(xiàng)目（KJZD-K202201207）。

作者簡(jiǎn)介：張少天（2000—），男，碩士生，研究方向：植物病原菌鑒定及病害防治。