一步RT-PCR法檢測蘋果銹果類病毒和蘋果凹果類病毒

DOI：" 10.13855/j.cnki.lygs.2024.03.003

摘" 要：由類病毒引起的蘋果病害在中國蘋果主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。對采自不同地區(qū)的帶有典型癥狀的弘前富士、南方脆及惠民短枝富士果實(shí)，進(jìn)行蘋果銹果類病毒（ASSVd）和凹果類病毒（ADFVd）檢測，發(fā)現(xiàn)兩種病毒能夠共侵染。根據(jù)ASSVd和ADFVd保守序列設(shè)計(jì)通用引物，建立了能快速、同時檢測兩種類病毒的RT-PCR方法。

關(guān)鍵詞：蘋果銹果類病毒; 蘋果凹果類病毒; RT-PCR檢測

中圖分類號：" S661.1" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

文章編號：" 1002-2910（2024）03-0010-04

收稿日期：2023-08-07

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（鄉(xiāng)村振興科技創(chuàng)新提振行動計(jì)劃）（2022TZXD008）；山東省果品產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-06-03）。

*通信作者：張振魯（1988-），男，山東惠民人，副教授，從事蘋果病害抗性研究工作。E-mail： zzhenlu0526@sdau.edu.cn

作者簡介：馬寧（2000-），女，山東德州人，在讀碩士研究生，從事果樹分子生物學(xué)研究工作。E-mail：1535718054@qq.com

Rapid and simultaneous detection of ASSVD and ADFVd by a one-step RT-PCR method

MA Ning1， KONG Lingrong2， ZHANG Xueyong3， ZHAO Lingling3， YOU Chunxiang1， ZHANG Zhenlu1*

（1.College of Horticultural Science and Engineering， Shandong Agricultural University/National Apple Engineering Research Center， Tai’an， Shandong 271018， China; 2.Agriculture and Rural Bureau of Qufu， Jining， Shandong 273100， China; 3.Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai， Shandong 264000，China）

Abstract：Viroid-induced apple diseases are widely distributed in the main apple producing areas in China， which seriously restricts the heathy development of apple industry. By analyzing the apple fruits of Hongqian Fuji， Nanfangcui and Huimin Duanzhi with typical symptom from different regions using RT-PCR method， it was found that both apple scar skin viroid （ASSVd） and apple dimple fruit viroid （ADFVd） were detected from the same sample， suggesting the co-infection of these two viroids. Moreover， a rapid detection method that could simultaneously detect the two viroids was established based on the designed primers from the conserved region of the two viroids. The one-step RT-PCR method will facilitate the rapid detection of ASSVd and ADFVd all at once in the future.

Key words：ASSVd; ADFVd; RT-PCR detection

中國是世界最大的蘋果生產(chǎn)國和消費(fèi)國。隨著蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蘋果樹感染病毒病的幾率普遍升高。目前蘋果生產(chǎn)栽培中常見的病毒主要包括蘋果花葉病毒（Apple mosaic virus， ApMV）［1］、蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）［2］、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus， ASGV）［3］、蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）［4］、蘋果壞死花葉病毒（Apple necrotic mosaic virus， ApNMV）［5］、蘋果銹果類病毒（Apple scar skin viroid， ASSVd）和蘋果凹果類病毒（Apple dimple fruit viroid， ADFVd）［4，6］。

類病毒是由246～434個核苷酸組成的單鏈、共價閉合環(huán)狀的RNA［7］，主要通過機(jī)械接觸、苗木、嫁接等直接或間接的接觸進(jìn)行傳播［8］，由類病毒引發(fā)的病害，危害多種經(jīng)濟(jì)作物如蘋果、梨等［9，10］。ASSVd屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospiviroidae）蘋果銹果類病毒屬（Apscarviroid）［11］，可引發(fā)蘋果銹果病。蘋果銹果病最初在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)，目前在中國蘋果主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生［12］。研究發(fā)現(xiàn)，ASSVd侵染蘋果后根據(jù)品種不同引起果實(shí)產(chǎn)生銹果型、花臉型和銹果-花臉混合型等癥狀，銹果型癥狀主要是在果實(shí)上生有與心室頂部對應(yīng)的五條規(guī)則的木栓化斑紋，花臉型癥狀主要是在果皮表面形成圓形的黃綠色或紅色斑點(diǎn)，銹果-花臉混合型呈現(xiàn)上述兩種癥狀的復(fù)合癥狀［13］。蘋果果實(shí)受ASSVd侵染后，果個變小，風(fēng)味變差，嚴(yán)重影響果實(shí)的商品價值。ADFVd首次在意大利種植的蘋果品種紅星果實(shí)上被報道，因其表現(xiàn)出明顯的凹果癥狀而得名［14］。其RNA由306～307個核苷酸組成，與ASSVd同為Pospiviroidae科Apscaviroid屬成員，且二者的序列相似性為63.5%，包含了ASSVd基因組的整個保守區(qū)域［15］。趙英［16］等最早在新疆栽培的國光品種中檢測到該病毒，侵染蘋果后主要表現(xiàn)為果實(shí)畸形、果皮表面形成3～4 mm的凹形綠色斑點(diǎn)。此外，在金冠等一些蘋果品種中也發(fā)現(xiàn)了與ASSVd侵染相似的斑點(diǎn)癥狀［17］。

有些類病毒存在潛伏侵染，且多種類病毒還可以復(fù)合侵染，對于植株本身和鄰近植株都存在潛在風(fēng)險。蘋果樹體一旦感染類病毒將終身帶毒，目前尚無有效治療手段。近年來蘋果類病毒侵染在中國發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，在山東、陜西、河北等蘋果主產(chǎn)區(qū)常有報道。針對類病毒的危害特性，快速、準(zhǔn)確的檢測類病毒是預(yù)防樹體染病的重點(diǎn)。目前類病毒檢測方法主要有生物學(xué)檢測［18］、高通量測序技術(shù)［19，20］、分子生物學(xué)檢測［21，22］等。分子生物學(xué)檢測技術(shù)近年來發(fā)展迅速，主要包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、實(shí)時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR）以及核酸分子雜交技術(shù)等。RT-PCR檢測技術(shù)以其操作簡單、快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前常用的技術(shù)。

筆者對采自不同地區(qū)帶有典型癥狀的弘前富士、南方脆及惠民短枝富士果實(shí)，進(jìn)行ASSVd和ADFVd檢測，根據(jù)ASSVd和ADFVd保守序列設(shè)計(jì)通用引物，建立了能快速、同時檢測兩種類病毒的RT-PCR方法。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

2022年10月從山東煙臺、臨沂、泰安3個地區(qū)采集帶有ASSVd和ADFVd典型癥狀的弘前富士、南方脆、惠民短枝富士果實(shí)樣品和對照樣品（圖1），取樣后削取果皮，立即液氮冷凍，后置于-80 ℃保存。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成" 取液氮保存的蘋果果皮，用試劑盒法提取總RNA，用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及檢測" 根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載收錄的不同地區(qū)、不同變種的ASSVd和ADFVd序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，在同源性高的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增ASSVd和ADFVd基因序列。ASSVd引物序列為ASSVd-F： 5’-ACGAAGGCCGGTGAGAAAG-3’，ASSVd-R： 5’-CGACGACGACAGGTGAGTT-3’；ADFVd引物序列為ADFVd-F： 5’-GTCGACGAAGGCTGGTAAG-3’， ADFVd-R： 5’-GACGACAGGTAAGTCTCTTCAC-3’。反應(yīng)體系為cDNA 0.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）17.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，30個循環(huán)。

1.2.3 ASSVd和ADFVd通用引物檢測" 利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，設(shè)計(jì)ASSVd、ADFVd通用引物，檢測樣品中是否同時攜帶ASSVd和ADFVd，引物序列為AS-AD-F： 5’-ACCTGTCGTCGTCGACGAAGG-3’，AS-AD-R： 5’-TCCGCTCGACTAGCGGC-3’。反應(yīng)體系為cDNA 1.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）25 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各2.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" ASSVd和ADFVd特異性引物檢測分析

利用引物ASSVd-F/R和ADFVd-F/R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到300 bp左右的條帶，產(chǎn)物回收后連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple上，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽性克隆載體后進(jìn)行測序。利用SnapGene軟件比對分析，結(jié)果表明ASSVd-F/R、ADFVd-F/R擴(kuò)增序列分別與ASSVd陜西蘋果分離物（GenBank登錄號NC_001340.1）、ADFVd 陜西蘋果分離物（GenBank登錄號EF088665.1）全長序列完全一致，然后分別提取質(zhì)粒得到ASSVd和ADFVd的陽性對照。

分別利用引物 ASSVd-F/R和ADFVd-F/R對帶有典型癥狀的5個不同地區(qū)樣品（A惠民短枝富士，煙臺地區(qū)；B弘前富士，煙臺地區(qū)；C惠民短枝富士，臨沂地區(qū)；D南方脆，臨沂地區(qū)；E惠民短枝富士，泰安地區(qū)）的蘋果果皮及對照健康果皮進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，ASSVd在帶有典型癥狀的5個不同樣品均檢測出約300 bp的條帶，且條帶清晰明亮，在健康蘋果果皮中未檢測出條帶（圖 2）。ADFVd在A1、A2、B1、B2、B3、C2、D1、E1 8個樣品中檢測到單一且清晰明亮的條帶，而在其他樣品及健康果皮中沒有檢測到條帶（圖 3）。

2.2" ASSVd、ADFVd通用引物的設(shè)計(jì)及檢測分析

從NCBI選取5條ASSVd的不同序列和7條ADFVd的不同序列，利用DNAMAN進(jìn)行保守序列分析（圖4），并根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)通用引物AS-AD-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得165 bp的ASSVd條帶和135 bp的ADFVd條帶，通過3%的瓊脂糖凝膠電泳可以區(qū)分兩種類病毒。

為驗(yàn)證通用引物的準(zhǔn)確性，根據(jù)圖2和圖3的檢測結(jié)果，選取兩種類病毒均能檢測到的A1、B2、C2、D1、E1五個樣品（依次命名1～5），并利用通用引物AS-AD-F/R進(jìn)行RT-PCR檢測（圖5）。結(jié)果表明，除樣品4外，其余4個樣品均能分離出2個條帶，即ASSVd為165 bp，ADFVd為135 bp。在樣品4中僅檢測到與ASSVd（165 bp）相似的序列。將PCR獲得的DNA片段進(jìn)行測序，結(jié)果表明165 bp的片段序列與ASSVd序列均一致，而135 bp的片段序列與ADFVd序列均一致。由上表明，本研究中設(shè)計(jì)的通用引物能夠有效的區(qū)分ASSVd和ADFVd，可用于快速檢測并區(qū)分兩種類病毒。

3" 討論

蘋果類病毒侵染常通過嫁接、根系接觸等方式進(jìn)行傳播，侵染樹體后，會引起樹勢衰弱、葉片和果實(shí)發(fā)育不良，砧穗親和力降低，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，蘋果類病毒檢測難以應(yīng)用生物學(xué)檢測、血清學(xué)檢測等方法，而RT-PCR技術(shù)因其具有準(zhǔn)確、高效、靈敏度高、適合大量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)成為主流檢測方法［22］，其工作原理是將RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，盡早發(fā)現(xiàn)并清除病株［23］。使用RT-PCR技術(shù)對ASSVd、ADFVd進(jìn)行檢測，要綜合考慮這兩類病毒擁有大量變體，因而引物的設(shè)計(jì)應(yīng)適用范圍廣，以便檢測到感病樣品中的類病毒。本研究通過NCBI數(shù)據(jù)庫下載了不同變種的序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，可以檢測到感病樣品中全部或大部分的ASSVd、ADFVd。在感病樣品中同時檢測到ASSVd、ADFVd兩種類病毒，說明感病蘋果中存在ASSVd、ADFVd復(fù)合侵染。

生產(chǎn)無病毒苗木需在苗木繁殖前后進(jìn)行病毒病檢測，以便能有效排除遭遇病毒侵染的植株，提高苗木質(zhì)量。本研究根據(jù)ASSVd和ADFVd保守序列設(shè)計(jì)的通用引物可同時快速檢測到ASSVd、ADFVd兩種類病毒，對提高蘋果類病毒的檢測效率，保障無病毒苗木生產(chǎn)具有重要意義。

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