訂書抗菌肽的研究進展

摘要：當前抗菌藥物面臨日趨嚴重的抗生素耐藥性問題，亟需新結構或新作用機制的抗菌藥。抗菌肽因其具有廣譜抗菌活性和獨特的殺菌機制，被認為是對抗多重耐藥細菌的潛在治療藥物，有很好的發展前景。但是，抗菌肽存在結構不穩定，易被蛋白酶水解等缺點，為抗菌肽的臨床轉化帶來了阻礙。提高多肽結構穩定性可以使用非天然氨基酸修飾、環化等方法，近年來一種被稱為訂書修飾的特殊環化方法受到廣泛關注，包括使用全碳氫鏈、三唑基或者硫代碳鏈橋環釘子等。訂書結構的引入可以提高抗菌肽結構的穩定性，尤其是α-螺旋結構的穩定性，增強抗菌肽的活性，還可以抵抗蛋白酶水解，但也存在提高溶血毒副作用的可能。本文介紹了訂書肽的結構、合成以及研究中的訂書抗菌肽，并討論了影響其活性的主要因素，以期為新型抗耐藥菌藥物研發提供幫助。

關鍵詞：抗菌肽；訂書肽；環化修飾；穩定性；結構

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）04-0217-09

Research Progress on Stapled Antimicrobial Peptides

Mo Qin-zi1，" "Zheng" Heng2

（1 School of Basic Medical Sciences， Guangxi Medical University，" " Nanning" " 530199;

2 College of Life Science and Technology， China Pharmaceutical University，" " Nanjing" "210009）

Abstract：Current antimicrobial chemotherapy faces a significant threat from antibiotic resistance， and novel antimicrobial medication architectures or modes of action are desperately needed." Antimicrobial peptides， due to their broad-spectrum antimicrobial activity and unique bactericidal mechanisms， are considered potential therapeutic agents against multidrug-resistant bacteria with good development prospects. However， antimicrobial peptides have disadvantages such as structural instability and susceptibility to proteolytic degradation， which hinder the clinical translation of these peptides. Improving the structural stability of peptides can be achieved by various methods， such as non-natural amino acid modifications and cyclization. In recent years， a particular cyclization method called stapling modification has gained significant attention. This method involves the use of all carbon-hydrogen， triazole or thioether based staples. The addition of stapling structures can enhance antimicrobial activity， improve the stability of antimicrobial peptide structures， especially α-helical structures， and resist proteolytic degradation. However， it may also increase hemolytic side effects. This review introduces the structure， and synthesis of stapled peptides." In an effort to support the creation of novel antimicrobial medications against resistant bacteria， we present instances of stapled antimicrobial peptides in research and go over the key variables affecting their efficacy..

Key words： antimicrobial peptides；stapled peptides；cyclization modifications；stability；structure

抗生素的臨床使用對治療細菌感染、降低死亡率、延長人類壽命起到了重要作用，然而細菌耐藥性的出現使得抗生素的抗菌效力不斷下降，抗生素耐藥性（Anti-microbial resistance，AMR）問題已成為全球十大健康威脅之一[1]，據估計，2019年全球有495萬人的死亡與AMR有關，其中有127萬是直接由AMR導致的死亡[2]。解決抗生素耐藥性的一個直接策略是尋找具有新型作用機制的抗菌化合物，并且盡可能不易產生耐藥性。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一類天然的宿主防御短肽，由生物體的固有免疫系統產生，具有廣譜的抗菌活性[3-4]，其作用機制包括破壞細胞膜、抑制DNA或蛋白質合成等，與常規的抗生素相比，由于作用機制類型繁多，微生物難以對抗菌肽產生耐藥性[5]，在抗耐藥菌領域的研發日益受到關注。

目前雖然已鑒定、設計和合成許多高活性抗菌肽，如在我們構建的DRAMP數據庫中已收錄2萬多條AMPs[6]，但是進入臨床的抗菌肽仍較少，且大多是外用消炎抗菌[7]。這主要是因為天然氨基酸組成的抗菌肽易被蛋白酶降解、體內穩定性低、在血清和高鹽濃度中易失活[7]，而含非天然氨基酸的抗菌肽制備工藝復雜，限制了其研究和應用。此外，抗菌肽還可能具有非特異性的溶膜作用，產生溶血和細胞毒性等，為此需要研發新的改造手段，以期提高抗菌肽穩定性、降低毒性，促其臨床轉化。

訂書肽是一種特殊的環化修飾結構肽，最初是在研究蛋白質—蛋白質相互作用（Protein–protein interactions，PPI）時被引入。很多PPI是以二級結構為支撐骨架的亞結構形成，其中α-螺旋結構是最為普遍的作用片段[8]，這些 α-螺旋肽的平均長度較短，可單獨合成PPI界面上的α-螺旋肽，并有望得到能與靶標蛋白特異性結合的活性多肽藥物。但是參與PPI的 α-螺旋長度較短，通常在8～12個氨基酸殘基，直接截取合成該片段難以保持穩定的α-螺旋結構[9]。2000年，Verdine等報道了一種穩定多肽α-螺旋結構的方法[10]，根據α-螺旋主鏈 i、i+4、i+7等位點上側鏈處于同側的結構特點， 如果將i和 i+4、i+7 之間側鏈用連接分子橋接成環狀，則可以穩定 α-螺旋構象，該結構類似用訂書釘將α-螺旋結構固定，故被稱為訂書肽 （Stapled peptide）[9]。訂書肽這一特殊結構使多肽可通過細胞膜，難被蛋白酶水解，在生物體內的半衰期延長，被應用于抗腫瘤、抗菌、抗病毒及細胞信號通路等研究領域。本文將著重介紹訂書肽在抗菌領域的應用，以期為新型抗耐藥菌藥物研發提供幫助。

1 抗菌肽的結構和作用機制

1.1 抗菌肽的結構

從結構上看，抗菌肽通常有四種類型：α-螺旋，β-折疊，αβ混合和無規則卷曲結構。目前研究較為廣泛的是α-螺旋結構[11]，該類抗菌肽能與各種類型的膜相互作用，具有廣譜的抗微生物活性。通常α-螺旋結構的抗菌肽由不超過50個氨基酸殘基組成，含兩親性的分子結構，序列中疏水性殘基區域通常大于30%，凈電荷一般在+2至+10之間，這些特性有助于陽離子抗菌肽與陰離子的細菌細胞膜相互結合。目前已有一些抗菌肽處于臨床試驗期，如Pexiganan，Maginin的類似物，Omiganan和Indolicidin類似物等[12]。

1.2 抗菌肽的作用機制

抗菌肽的作用機制和其序列及結構有關，通常可以分為膜靶向作用和非膜靶向作用。膜靶向作用指抗菌肽通過破壞細菌細胞膜，使得細胞質內容物泄露而殺死細菌[13]。這是抗菌肽發揮抗菌作用的主要方式，具體還可以分成三種主要的機制模型，即桶壁模型，環孔模型和地毯模型。所謂桶壁模型，就是抗菌肽分子垂直插入細菌細胞膜的雙分子層，當多肽數量達到一定閾值時，就會導致跨膜孔洞的形成，典型的如Alamethicin抗菌肽的破膜機制[14]。環孔模型是指抗菌肽分子插入細菌細胞膜后，抗菌肽的親水部分與細胞膜磷脂的極性部分相互作用，不斷地誘導磷脂單層彎曲，形成一個由多肽和磷脂頭部基團排列的孔，具有這種破壞機制最常見的抗菌肽是MagininⅡ和Lacticin Q[15-16]。而在地毯模型中抗菌肽的多肽分子會聚集在膜表面，以類似地毯的形式覆蓋它，引起雙分子層張力，從而導致細菌細胞膜的破壞和膠束形成[17]。

在非膜靶向作用機制中，抗菌肽的作用不改變膜的完整性，而是通過誘導細胞凋亡或者抑制細胞壁、核酸和蛋白質的合成來發揮抗菌作用[18]；或者通過誘導宿主免疫防御機制，如誘導產生趨化因子或促進抗原呈遞細胞轉移到感染部位等發揮抗菌作用[19]。

1.3 抗菌肽臨床轉化存在的問題

雖然抗菌肽具有與傳統抗生素不同的多種作用機制，不易誘導細菌產生耐藥性，在抗多重耐藥菌領域是極具潛力的候選藥物，但是抗菌肽的臨床應用仍存在極大挑戰。首先，由于天然氨基酸組成的抗菌肽對于肽酶具有高靈敏性，其生物利用率較低，當抗菌肽進入到體內，往往會被各種肽酶降解從而無法發揮其抗菌作用[20]。其次，一些抗菌肽具有較高的溶血活性，細胞選擇性差，可能會同時作用于細菌細胞和宿主細胞而產生毒副作用[21]。第三，大多數天然抗菌肽的抗菌活性小于抗生素，并且與傳統的小分子抗菌藥物相比，生產成本較高。此外，抗菌肽結構的不穩定性使得其易受外在環境（例如鹽和血清）影響，如一些抗菌肽局部用藥時，其在體內處于解螺旋狀態而使得抗菌活性大大降低，因此其體內抗菌活性可能會與體外活性有相當程度的變化，使得對于抗菌肽在臨床階段的活性預測變得極為困難[22]。因此，需要設計篩選新型抗菌肽，提升其體內外穩定性，降低潛在的毒副作用，促其臨床應用。

2 訂書肽的結構

為提高抗菌肽穩定性，可采用的方法包括末端乙酰化或酰胺化、分子內二硫鍵、D型氨基酸替換、首尾鏈接成環[23]以及側鏈烯烴環化（訂書肽）[9] 等。其中，烯烴環化修飾是近年來日益受到關注的改造方法，它可以穩定多肽尤其是α-螺旋結構的穩定性，并可提高對肽酶或蛋白酶的穩定性。由于這種鏈接結構像是在多肽側鏈打入一個訂書釘，因此類似修飾方式形成的多肽也被稱為訂書肽，位于訂書肽上的成環結構便稱作釘子（或訂書釘）。

2.1 訂書側鏈修飾的位置

理論上，釘子的連接必須要位于螺旋同一表面的兩個氨基酸側鏈之間，在這種情況下的釘子修飾可以起到穩定α-螺旋多肽二級結構的作用；因此，考慮到一個完整的螺旋含有3.6個氨基酸殘基，同時兩個殘基的釘子總是出現在螺旋的同一側，那么釘子的位置通常會位于（i，i+3）、（i，i+4）、（i，i+7） 和 （i，i+11） （圖1A-C）。如果多肽的長度較長，可以引入兩個或以上的釘子進行修飾，或者以一個共用殘基的方式形成雙重訂書橋（圖1D），從而可以大幅度地提高α-螺旋穩定性[24]。這種雙重連接結構類似于用線縫合的形式，因此也稱為縫合肽（Stitched peptides）[25]。

2.2 釘子類型

自從2000年Verdine使用烯烴作為側鏈連接橋，獲得的訂書肽具有穩定性高，可穿過細胞膜等特點，在化學性質及生物活性方面優于其他環化結構，以烯烴為代表的全碳氫鏈（All hydrocarbon stapling）連接橋就成為了訂書肽最主要的釘子類型，除了這一類型外，其他常用的釘子類型還有二硫鍵鏈接[26]、巰基[27]、三唑[28]和偶氮苯[29]等。在本實驗室構建的DRAMP數據庫中收錄了181條訂書抗菌肽，采用全碳氫鏈釘子類型的訂書抗菌肽占89.5%，其他類型的占10.5%。而在訂書位點間隔上，（i， i+4）和（i， i+7）是最常見的間隔模式，代表對肽鏈中一個螺旋和兩個螺旋的同側位點進行橋接，所占比重分別為82.4%和16.5%，其他類型僅占1.1%[6]。

3 訂書肽的合成

3.1 烯烴關環復分解（RCM）反應

1998年Grubbs將烯烴關環復分解（RCM）反應引入多肽共價鍵環化，在合成多肽后通過對肽鏈i和i+4位的絲氨酸進行側鏈烯丙基醚化，再通過烯烴復分解反應得到環烯基橋穩定的α-螺旋肽[30]。Verdine 及其團隊在此基礎上，使用末端具烯烴側鏈的非天然氨基酸替換訂子位置的氨基酸殘基，并通過烯烴復分解反應形成環烯橋。該方法可以在標準固相多肽合成過程中，在樹脂結合肽上通過釕催化，將一個Cα-烯基氨基酸與另一個結合形成短鏈。如圖2所示，先將i和i+4 位置的兩個氨基酸先替換為 （S）-戊烯基丙氨酸（S-pentenyl alanine，S5），然后在釕催化下通過RCM反應生成全碳氫鏈訂書肽[9]。Cα的構型和短釘的長度會影響多肽穩定性和生物活性，通常Sn或Rn表示Cα的構型和非天然氨基酸側鏈長度。研究表明，對于i， i+3類釘子，最佳立體化學為（R， S），釘子的最佳長度為6個碳或8個碳，通常為（R3+S5）和（R5+S5）；對于i， i+4類釘子，最佳的立體化學和連接體長度為（S5+S5）；對于i， i+7類釘子是（R8+S5或R5+S8）[31]。除了單釘子外，雙釘子也有所應用，通常用來修飾較長的肽，它們在生物活性方面比單釘表現得更好。

3.2 三唑橋環

三唑橋環方法利用點擊化學（Click chemistry） 中的Huisgen-1，3 偶極環加成反應，在釘子位置分別引入α-末端具有炔基和疊氮基的非天然氨基酸，然后在 CuSO4與抗壞血酸的催化下發生Click反應，炔基與疊氮基形成三唑橋環結構（圖3）[32]。與RCM反應引入的烯烴環相比，該方法所用的銅催化劑遠比釕催化價格便宜，且毒性較低，但是這一方法在提高多肽酶解穩定性及α-螺旋結構穩定性方面還需深入研究[7]。

3.3 巰基-烯點擊反應

利用巰基—烯點擊反應，在室溫，365 nm光照下，可以將不同長度的二烯與肽鏈上的巰基縮合構建硫代橋環（圖4）。這一方法先將多肽鏈上釘子位點氨基酸替換成半胱氨酸，然后使用合適長度的二烯進行環合，具有反應條件溫和，其他官能團不發生反應，可以在側鏈氨基酸未經保護的狀態下引入硫代環橋，不需要使用金屬催化劑等優點[33]。但是使用該方法母肽序列中不能含半胱氨酸，或者需要預先替換為其他氨基酸殘基，另外生成的硫代橋環訂書肽的穩定性和毒副作用等還需要進一步深入研究。

4 訂書抗菌肽的研究

訂書肽通過側鏈環化的方法，提高了α-螺旋結構的構象穩定性和代謝穩定性，在研究蛋白質—蛋白質相互作用界面，開發靶向蛋白質的多肽藥物等方向提供了新的思路。同時，由于大部分作用于細胞膜的抗菌肽具有兩親結構，其α-螺旋結構穩定性直接影響其抗菌活性，引入訂書結構后可增強抗菌活性和穩定性，因此，在抗菌、抗腫瘤、抗病毒等領域都有良好的應用前景。表1列舉了近年來報道的訂書抗菌肽。

Mourtada等[34]基于Magainin Ⅱ設計了新型訂書肽Mag（i+4）1，15 （A9K， B21A， N22K， S23K）（圖5A），體外抑菌實驗顯示，該訂書肽與母肽Magainin Ⅱ相比，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性增加，且無溶血和細胞毒性。在小鼠腹膜炎敗血癥模型中，對耐黏菌素的鮑曼不動桿菌感染顯示出顯著療效，每天靜脈團注（Intravenous bolus injection）兩次5 mg/kg訂書肽，24 h小鼠存活率達75%，而Magainin Ⅱ給藥組死亡75%，溶劑對照組小鼠在12 h內全部死亡。治療組未觀測到溶血及腎毒性等副作用，顯示出潛在的臨床應用前景。

Yeh等[35]報道了基于Tilapia piscidin 4 （TP4）的訂書肽設計，通過改變訂書殘基位置和數量，比較了4種不同訂書肽的體外抗菌活性，其中TP4-3（圖5B）對鮑曼不動桿菌的活性與母肽TP4相當，但是在人血清中穩定性比母肽大幅度增加。在多微生物敗血癥的盲腸結扎和穿刺（CLP）小鼠模型中，TP4-3改善了存活率（d7時為87.5%）。此外，與僅使用美羅培南（Meropenem）相比，TP4-3聯合使用提高了美羅培南治療多微生物敗血癥的療效（d7時100%存活），而單獨使用美羅培南的存活率在d7時為37.5%。

Polybia-MP1是一種天然抗菌肽，長度為14個氨基酸殘基。Luong等[36] 將MP1及其突變序列第6位和第10位側鏈通過全碳氫鏈橋聯，得到MP1S、MP1S-D8N和MP1S-Q12K三種訂書肽（圖5C）。與母肽相比，訂書肽類似物的螺旋度提升了三倍，對革蘭陽性菌的活性大幅度提升，溶血活性有中等程度提升。同時，訂書結構修飾使MP1酶解穩定性提高了大約70倍，大幅度增加了抗菌肽在體內的穩定性，表明全碳氫訂書結構是一種提高多肽穩定性的有效手段。

盡管全碳氫鏈橋聯是最常用的訂書肽結構，一些研究中還嘗試了其他類型的釘子。如Liu等[37]通過銅（I）催化的疊氮化物—炔烴環加成得到三唑環橋訂書肽C-MP-1（圖5D），C-MPI-1表現出與母肽相似的抗菌活性，但對胰蛋白酶抗性增強。通過圓二色散光譜測定了肽的二級結構，表明C-MPI-1在水溶液中采用α-螺旋結構溶液，在30 mmol/L十二烷基硫酸鈉和50%三氟乙基中α-螺旋構象率比母肽更高，膜穿透性實驗表明MPI和訂書肽C-MPI-1都是作用在膜上的，表明這些肽將不易受常規抗性機制的影響。

除了直接對抗菌肽進行訂書結構改造外，研究人員還對抗菌蛋白等進行截短和改造。例如CXCL10是一種由宿主對微生物感染產生的促炎趨化因子，除了影響免疫細胞遷移和激活的典型受體依賴性作用外，CXCL10還被發現可以直接殺死多種致病菌。Crawford等[38]使用多肽掃描（Peptide-based mapping）方法將CXCL10分為了9段連續的多肽，其中C末端片段P9顯示出抗菌活性，但僅在低鹽環境下可形成α-螺旋構象時才對革蘭陰性菌有抗菌活性。通過將P9進行訂書結構修飾（圖5E），得到的訂書肽對革蘭陽性菌和陰性菌均有抗菌活性。

另一種策略是基于蛋白質相互作用界面（PPI）的設計，通過分析PPI介導的細胞功能和信號通路，發現新的抗菌作用靶點。例如Kang等[39]利用結核分枝桿菌毒素—抗毒素（TA）系統設計了新型訂書抗菌肽。在結核分枝桿菌TA系統VapBC30中，VapC30作為毒素，具有RNA酶活性引起細菌死亡；而VapB30是對應的抗毒素，可與VapC30結合，從而對VapC30起抑制作用。在結核分枝桿菌H37Rv全基因組中，有大量的TA系統，占總蛋白的5%。通過分析VapB30和VapC30相互作用界面，Kang等截取了VapB30中的一段多肽，它可以VapC30非活性區結合，阻止VapB30的結合，從而使VapC30的RNA酶催化區保留活性，抑制結核桿菌生長。但由于游離多肽柔性大，通過添加訂書修飾得到V30-sp-8（圖5F），可以提高結構穩定性和細胞膜穿透性，對恥垢分枝桿菌MIC50lt;6.25 μmol/L，優于萬古霉素和線性的母肽 [39]。

本文所在實驗室構建了訂書肽活性預測模型，基于Magainin Ⅱ母肽設計了硫代環橋訂書肽Mag2（i+4）0St（圖5G）和Mag2（i+7）11St（圖5F），抗菌活性尤其是抗大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的活性顯著增加[40]。與全碳氫鏈橋聯相比，序列中不需要引入非天然氨基酸S5，也不需要使用釕催化劑，直接將需要加入釘子的氨基酸殘基替換為半胱氨酸，通過巰基—烯點擊反應即可合成。但是缺點是母肽序列中如果有半胱氨酸或者蛋氨酸，需要預先保護或替換成其他氨基酸。另外，硫代環橋訂書肽在提高抗菌活性的同時，也可能提高溶血性和毒副作用，目前對于訂書肽毒副作用研究尚比較少，缺乏有效的計算機輔助設計手段。

5 總結與展望

抗菌肽因為穩定性和溶血性等問題限制了其臨床上的應用，通過化學修飾、引入非天然氨基酸以及環化等方法可以提高其結構穩定性。近年來出現的訂書結構環化修飾方法，可以有效地穩定多肽的螺旋結構，具有增加抗菌活性、增強膜通透性，防止蛋白酶水解等作用，是促進抗菌肽臨床轉化有效的策略[41]。目前改造和設計的方法主要集中于三類：第一種是直接在天然抗菌肽上改造，如對Magainin Ⅱ、TP4、Polybia-MP1等進行訂書結構修飾，可在不降低母肽抗菌活性的基礎上，提高其體內外穩定性，部分訂書肽在小鼠敗血癥模型中顯示出很好的保護效果；第二種是對細胞因子或抗菌蛋白質的截短及改造，隨著多肽固相合成技術的發展，短鏈多肽在生產、存儲等方面比蛋白質大分子更具優勢，因此也是獲得新型抗菌藥物的有效手段；第三種則是利用細菌體內TA系統，根據毒素—抗毒素相互作用設計新型訂書抗菌肽，由于真核細胞中缺乏TA系統[42]，因此是很有潛力的新型抗菌藥物研發策略。

但是，訂書結構修飾穩定α-螺旋結構的同時，也可能引起溶血或細胞毒性的增加。抗菌肽作用于細胞膜的選擇性，基于作用于細菌細胞膜的上陰離子細菌細胞，而哺乳動物細胞膜大多為兩性離子脂質[43]， 因而抗菌肽多帶正電荷。訂書結構修飾時引入的非天然氨基酸及環狀側鏈，可能會改變原有序列所帶電荷和疏水界面，從而影響其膜選擇性。在序列中引入堿性氨基酸如賴氨酸，可以增加膜選擇性，降低其溶血活性[34]。但是突變位置不同會產生不同的效應，往往需要進行大量的實驗篩選工作。

釘子引入的位置對于抗菌肽的活性及毒副作用也有重要的影響，為了避免關鍵殘基被替換引起活性喪失，通常可用丙氨酸掃描的方法來確定關鍵殘基[39]。釘子的數量可根據多肽長度不同考慮單釘子或者雙釘子修飾，通常雙釘子結構對α-螺旋具有更強的穩定作用。

然而不管使用丙氨酸掃描，還是其他氨基酸逐步替換，都需要進行大量的篩選實驗。基于肽庫的快速篩選技術，如SLAY （Surface localized antimicrobial display）[44]等可以加快天然氨基酸組成的抗菌肽篩選過程，但是對于訂書肽等修飾多肽尚缺乏高通量篩選平臺。機器學習和人工智能近年來發展迅速，并越來越多地被應用于抗菌肽設計篩選[45]，但目前大多數模型集中于天然氨基酸組成抗菌肽的活性預測，對于含修飾氨基酸或訂書結構的多肽尚缺乏相應模型，在抗菌肽溶血作用和穩定性方面的預測報道也相對較少，為此，需要對訂書抗菌肽的作用機制和構效關系進行深入研究，從而推進其理性設計和優化。

參 考 文 獻

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