河南省西峽縣雞源沙門氏菌分離鑒定及藥敏性檢測

摘 要：為探究河南省南陽市西峽縣雞源沙門氏菌的流行及耐藥性情況，對來自養雞場的疑似感染雞沙門氏菌的病死雞的54份病料組織進行分離菌培養及鏡檢、生化鑒定反應和PCR鑒定，并檢測所有分離菌株對14種抗生素的耐藥性。檢測結果顯示，共分離出18株雞沙門氏菌，檢出率為33.33%；其中，雞白痢沙門氏菌有12株，腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌各3株；分離出的菌株對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素的耐藥性較高，對四環素、頭孢噻肟、環丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟較敏感，耐藥種類分布在1種到8種之間，多重耐藥率為88.89%（16/18），以耐5種抗生素的菌株最多。研究結果可為西峽縣沙門氏菌流行態勢的評估和防治措施的制定提供參考。

關鍵詞：雞；沙門氏菌；分離鑒定；耐藥性

中圖分類號：S852.61 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2024）2-101-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.02.023

0 引言

雞沙門氏菌病是由沙門氏菌（Salmonella）引起的、廣泛存在于養雞場中的細菌性疾病。雛雞感染該病菌后，會出現腹瀉、消瘦、脫水癥狀；母雞感染該病菌后，會出現卵囊炎、腹膜炎癥狀，產蛋率下降，且發病率和死亡率較高，從而給養雞業帶來嚴重的經濟損失［1］。沙門氏菌屬腸桿菌科，是一種人畜共患的革蘭氏陰性菌和條件致病菌，通常寄生在動物和人類的腸道內，在宿主機體免疫力下降、外界環境變化時會成為優勢菌，并導致宿主發病。沙門氏菌可通過污染的飲水、飼料、飼用器具和糞污等在雞群中進行水平傳播，還能通過感染受精卵進行垂直傳播。沙門氏菌血清型眾多，迄今為止已發現2 600多種血清型，我國主要流行的沙門氏菌血清型為雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌［2-3］。不同地區不同時期流行的沙門氏菌血清型不一致，明確當地流行的沙門氏菌血清型對實現沙門氏菌病的有效防治具有重要指導意義。抗生素可用于防治家禽的多種疾病，能提高家禽生產性能、降低飼料成本和疾病發生風險，但長期不合理使用抗生素會導致耐藥菌株日益增多，且形成多種耐藥性，嚴重影響抗生素的臨床應用效果。對當地流行菌株的耐藥性進行檢測，可為臨床合理使用抗生素提供參考，從而提高抗生素藥效。筆者通過調查河南省南陽市西峽縣部分養雞場，對當地雞源沙門氏菌流行的血清型進行鑒定，并對養雞場常用抗生素的耐藥性進行檢測分析，為雞沙門氏菌病的防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 臨床病料采集及質控菌株

無菌采集西峽縣5家養雞場內疑似患沙門氏菌病死亡的雞的心、肝、腸等器官組織，共54份，并裝袋編號送檢。以大腸埃希菌ATCC25922為標準質控菌株（購自廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.2 主要培養基和試劑

測試所用的材料包括緩沖蛋白胨水（BPW）、麥康凱瓊脂培養基（MAC）、LB固體培養基（均購自青島青藥生物工程有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒、細菌生化鑒定管（均購自北京索萊寶科技有限公司），DL 2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix（均購自北京百奧萊博科技有限公司），藥敏紙片（購自杭州濱河微生物科技有限公司）。

1.3 分離菌培養及鏡檢

在無菌環境中挑取病料，并將其接種于緩沖蛋白胨水中進行預增菌。將菌懸液分別接種于LB固體培養基、麥康凱培養基中，于37 ℃下培養18～24 h，觀察菌落特征。挑取特征菌落進行革蘭氏染色，并對涂片進行鏡檢，觀察分離菌的形態特性。

1.4 生化鑒定反應

按照細菌生化鑒定管操作說明書中的要求，將上述增菌液接種于生化反應鑒定管中，并觀察反應結果，根據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）［4］中的要求對反應結果進行判斷。

1.5 PCR鑒定

參照文獻［5］～［7］，設計invA、stn、sdf、P1、P2、STM4497共6對引物（引物的基本信息見表1），用來對沙門氏菌血清型進行鑒定，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。用細菌基因組DNA提取試劑盒來提取增菌液中的DNA，并以此為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為分離菌1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性35 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共運行35個循環，最后72 ℃延伸8 min。取部分擴增產物，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將結果在Genbank數據庫經BLAST比對。

1.6 藥敏試驗

參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）推薦的K-B紙片法，檢測沙門氏菌對氯霉素、青霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、多西環素、氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素、四環素、左氧氟沙星、復方新諾明、多黏菌素、阿米卡星等14種抗生素藥物的耐藥性。檢測試驗以大腸埃希菌ATCC25922為對照組。將吸取到的菌懸液均勻地涂布在LB固體營養瓊脂平板上，并在表面平鋪藥敏紙片（紙片之間要保持適當距離），于37 ℃恒溫培養16～24 h，然后測量抑菌圈直徑，并判定沙門氏菌對每種抗生素的敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

2 結果與分析

2.1 分離菌培養及鏡檢

對病料分別進行接種和培養后，分離菌菌落形態與鏡檢結果如圖1所示。由圖1可知，接種分離菌的LB固體培養基和麥康凱培養基會形成邊緣整齊、表面無色透明的菌落。革蘭氏染色鏡檢結果見圖1（c），分離菌為單個分散或數個聚集分布、兩端鈍圓的陰性菌，共有18個菌落的形態和鏡檢特征基本符合沙門氏菌特性。

2.2 生化鑒定反應

細菌微量生化鑒定反應結果見表2。有18株分離菌發酵為葡萄糖、鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶，6株分離菌具有運動性，7株分離菌發酵為衛矛醇，18株分離菌不發酵乳糖，且尿素和氰化鉀試驗為陰性，上述結果與沙門氏菌生化特性一致。根據傷寒沙門氏菌不發酵鳥氨酸的生化特點，且分離菌株均不能發酵鳥氨酸，所以判斷分離菌株不含雞傷寒沙門氏菌。結合雞白痢沙門氏菌無運動性的特性，判斷有12株雞白痢沙門氏菌。綜上所述，18株分離菌中有12株雞白痢沙門氏菌，6株為副傷寒沙門氏菌。

2.3 PCR擴增

經PCR擴增鑒定后，18株分離菌均可得到長約為605 bp、260 bp的目的條帶，分別與invA和stn基因符合，這表明18株分離菌均為沙門氏菌屬，見圖2（a）；12株分離菌均可獲得長約為417 bp的目的條帶，與P1基因符合，表明這12株分離菌為雞白痢沙門氏菌，見圖2（b）；3株分離菌均可獲得長約為203 bp的目的條帶，與sdf基因符合，表明這3株分離菌為腸炎沙門氏菌，見圖2（c）；3株分離菌均可獲得長約為523 bp的目的條帶，與STM4497基因符合，表明這3株分離菌為鼠傷寒沙門氏菌，見圖2（d）。未見同時擴增獲得P1和P2基因條帶，這表明分離菌中無雞傷寒沙門氏菌。將基因測序結果在Genbank數據庫內經BLAST比對可知，核酸相似性在97.6%以上。

2.4 藥敏試驗

對18株分離菌進行14種抗生素耐藥性K-B法檢測，結果見表3。分離菌株對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素的耐藥性比較嚴重，耐藥率為62.31%～81.98%；對四環素、頭孢噻肟、環丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟比較敏感，敏感率在50%以上。分離菌株耐藥種類分布如圖3所示，耐藥種類分布在1種到8種之間，多重耐藥率（耐3種及3種藥物以上）為88.89%（16/18），以耐5種抗生素最多，耐藥率為27.78%（5/18）。

3 結論

沙門氏菌廣泛存在于自然界，是影響畜牧業發展的常見病原菌，也是重要的食源性人畜共患病病原菌之一，并具有多重耐藥性，對全球公共衛生安全構成威脅［8］。通過對采集自西峽縣部分養雞場疑似感染沙門氏菌病的病死雞的54份器官組織病料進行細菌培養、生化試驗和PCR擴增反應，鑒定出18株雞沙門氏菌，檢出率為33.33%（18/54），這表明雞沙門氏菌病在當地較為流行。楊瑞等［9］研究發現，秦皇島地區雞源沙門氏菌的分離率為17.06%；宋欣媛等［10］研究發現，昆明周邊養雞場沙門氏菌感染率為16.00%。各地區雞源沙門氏菌的檢出率不同，可能與養殖環境、采樣部位、時間、菌株流行程度等因素有關。沙門氏菌的血清型不同，其致病力也存在差異，確定一個地區的雞沙門氏菌血清型有助于疫苗研發和提高防治成效。筆者對18株沙門氏菌進行異性引物PCR擴增和測序驗證，發現12株為雞白痢沙門氏菌，3株為腸炎沙門氏菌，3株為鼠傷寒沙門氏菌，表明西峽縣雞沙門氏菌流行的優勢菌株為雞白痢沙門氏菌。這可為下一步防治明確重點方向。此研究結果與鞏新廷等［11］、宋艷等［12］的研究結果基本一致。

由于長期不規范使用抗生素，雞沙門氏菌的耐藥性較高，嚴重降低了抗生素的治療效果。此研究結果表明，從西峽縣部分養雞場分離的18株雞源致病性沙門氏菌均具有耐藥性，耐藥種類分布在1種到8種之間，且多重耐藥率（耐3種及3種藥物以上）為88.89%（16/18），以耐5種抗生素的菌株最多，且對氯霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素耐藥性比較嚴重，對四環素、頭孢噻肟、環丙沙星、紅霉素、頭孢吡肟較為敏感。這可能與當地養雞場臨床使用抗生素習慣、飼養管理模式和菌株致病力等有關。耐藥性研究結果表明，西峽縣雞源致病性沙門氏菌的耐藥情況較為嚴重，多重耐藥率較高，可通過輪換用藥、選用敏感性藥物、使用抑菌中草藥等方式來防治雞沙門氏菌病，避免細菌的耐藥性進一步增強。

參考文獻：

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［10］宋欣媛，譚珊，吳培福.昆明地區雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析［J］.現代畜牧獸醫，2019（4）：1-5.

［11］鞏新廷，石巖，蘇玉賢.河南省部分地區雞源沙門氏菌分離鑒定與耐藥性分析［J］.中國動物傳染病學報，2022（6）：153-157.

［12］宋艷，張富友，顧小雪，等.山東濟寧地區百日雞群沙門氏菌的鑒定及耐藥特性研究［J］.中國預防獸醫學報，2021（1）：21-28.