HPLC-MS/MS法測定鹽酸拉貝洛爾中潛在基因毒性雜質

摘 要：為了更好地控制鹽酸拉貝洛爾中潛在的基因毒性雜質，保證用藥安全，建立了高效液相色譜-質譜（HPLC-MS/MS）法檢測鹽酸拉貝洛爾中潛在遺傳毒性雜質N-亞硝基拉貝洛爾。液相色譜條件：以Waters ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×3.0 mm， 1.7 μm）為色譜柱，流動相A為0.01 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫為50 ℃，進樣體積為10 μL。以電噴霧電離源為離子源，負離子模式，采用多反應監測，建立質譜條件，對鹽酸拉貝洛爾中N-亞硝基拉貝洛爾進行定量檢測。結果表明：N-亞硝基拉貝洛爾質量濃度在1.01～100.60 ng/mL范圍內有良好的線性關系；低、中、高3個濃度的加樣回收率（n=3）為96.84%～99.53%；檢測限和定量限分別為0.01 ng/mL和0.03 ng/mL；6批鹽酸拉貝洛爾樣品中N-亞硝基拉貝洛爾的含量為0.37～0.79 ng/mL。所提出的方法靈敏度高、專屬性強，可用于測定鹽酸拉貝洛爾中的N-亞硝基拉貝洛爾，為鹽酸拉貝洛爾的質量控制提供參考。

關鍵詞：化學分析；鹽酸拉貝洛爾；HPLC-MS/MS；基因毒性雜質；N-亞硝基拉貝洛爾

中圖分類號：TQ460.72；R917

文獻標識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2024yx03006

Determination of potential genotoxic impurities in labetalol

hydrochloride by HPLC-MS/MS method

HAN Jiarui1，2，XU Yanmei2，HAO Lijuan2，GAO Yanxia2

（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology，

Shijiazhuang，Hebei 050018，China;

2.NMPA Key Laboraory for Quality Control and Evaluation of Generic Drug， Hebei Institute for

Drug and Medical Device Inspection， Shijiazhuang， Hebei 050227， China）

Abstract：In order to better control the potential genotoxic impurities in labetalol hydrochloride and ensure the safety of medication， a high-performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC-MS/MS） method was established to detect potential genotoxic impurities N-nitroso-labetalol in labetalol hydrochloride. The liquid chromatographic conditions were as following： the chromatographic column was Waters ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm × 3.0 mm， 1.7 μm）， mobile phase A was 0.01 mol/L ammonium formate -0.1% formic acid aqueous solution， mobile phase B was acetonitrile solution， the gradient elute was adopted， flow rate was 0.5 mL/min， the column temperature was 50 ℃， and the injection volume was 10 μL. Mass spectrometry conditions were established by using the electrospray ionization source as the ion source， negative ion mode and the multiple reaction monitoring mode， so that N-nitroso-labetalol in labetalol hydrochloride was quantified. The results indicate that the calibration curves is in good linearity in the range of 1.01～100.60 ng/mL; The recoveries （n=3） at low， middle and high spiked concentrations are within 96.84%～99.53%; The limit of detection is 0.01 ng/mL， and the limit of quantification is 0.03 ng/mL; The amount of N-nitroso-laelalol in six batches of the hydrochloride samples is 0.37～0.79 ng/mL. The proposed method is sensitive and accurate， and can be used for the quantification of N-nitroso-labetalol in labetalol Hydrochloride， providing some reference for the quality control of labetalol hydrochloride.

Keywords：chemical analysis; labetalol hydrochloride; HPLC-MS/MS; genotoxic impurity; N-nitroso-laelalol

鹽酸拉貝洛爾化學名稱為5-[1-羥基-2（1-甲基-3苯丙胺基）-乙基]水楊酰胺鹽酸鹽，是α和β受體阻滯劑，通過抑制中樞和周圍的腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS），起到抑制心肌收縮力和減慢心率的作用，可阻斷腎上腺素受體，減少外周血管壓迫帶來的阻力。該藥物不進入母胎循環，對胎盤無影響[1-5]。因此，鹽酸拉貝洛爾作為治療妊娠期高血壓病（hypertensive disorders of pregnancy，HDP）的一線藥物，被推薦可以在哺乳期繼續使用[6]，但其用藥安全是急需關注的問題［7-12］。

基因毒性雜質是指微量直接或間接損傷細胞DNA，導致基因突變、染色體斷裂或染色體重排的雜質[13-16]。基因毒性雜質主要來源于原料藥合成過程中的起始物料、中間體、試劑和反應副產物，或者是由藥物在合成、儲存或者制劑過程中降解所產生的[17]。JOHN在19世紀80年代列出了致癌性的“警示結構”，含有這些結構的化合物被分為N-亞硝胺類、磺酸酯類、鹵代烷烴類、肼類和環氧化合物等，這些化合物可能與DNA發生作用，進而可能誘發癌癥[18]。自2018年人們在纈沙坦中檢出N-亞硝基二甲胺后，N-亞硝胺類化合物的檢出種類不斷增加，N-亞硝胺類化合物引起了科研人員的廣泛關注。2022年3月，加拿大衛生部發布通告，輝瑞制藥公司自愿召回29批次鹽酸普萘洛爾緩釋膠囊，此次召回是因為在這些批次中檢測出超過每天允許攝入量的N-亞硝基普萘洛爾[19]。N-亞硝基普萘洛爾是由原料藥中的仲胺結構與微量殘留的亞硝酸鹽反應生成的雜質，結構式與鹽酸拉貝洛爾相似，都含有仲胺結構，因此，鹽酸拉貝洛爾極有可能與生產過程中殘留的亞硝酸鹽反應生成N-亞硝基拉貝洛爾[20-22]。因此迫切需要開發一種靈敏度高、專屬性強的方法對鹽酸拉貝洛爾中可能存在的N-亞硝基拉貝洛爾進行檢測，以保證藥品安全。

基因毒性雜質的測定主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜法和氣相色譜-串聯質譜法。基因毒性雜質含量極低且種類較多，導致分離檢測較為困難。液相色譜-串聯質譜法具有高選擇性、高靈敏度的特點，是藥物研究檢測的一個高效、切實可行的分析技術[17]。目前國內外尚無對鹽酸拉貝洛爾中N-亞硝基拉貝洛爾檢測方法的報道。本文采用高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法檢測鹽酸拉貝洛爾中的N-亞硝基拉貝洛爾含量，為鹽酸拉貝洛爾中潛在基因毒性雜質的檢測提供技術支持。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

島津LC-30AD型高效液相色譜儀（日本島津公司提供）；SCIEX ATRAP 6500型質譜儀（美國AB公司提供）；XS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司提供，感量為0.01 mg）。

1.2 主要試劑

N-亞硝基拉貝洛爾（MOLCOO，含量為99.85%，批號為20230501）；鹽酸拉貝洛爾原料（某廠家提供，批號為18220501、18220502、18220503）；鹽酸拉貝洛爾片（某廠家提供，批號為08211002、08211102、08211103）；甲酸、甲酸銨（LC/MS級別，阿拉丁有限公司提供）；乙腈和甲醇（LC/MS級別，默克生命科學公司提供）；水（蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供）。

2 方法與結果

2.1 HPLC-MS/MS條件

2.1.1 HPLC條件

色譜分離采用Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（150 mm × 3.0 mm， 1.7 μm），以0.01 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈溶液為流動相B，柱溫為50 ℃，進樣體積為10 μL，流速為0.5 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

2.1.2 MS條件

電噴霧電離（electron spray ionization， ESI）源，采集模式為負離子模式；監測模式為質譜多反應監測（multiple reaction monitoring， MRM）；離子噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：350 ℃；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助氣（GS2）：50 psi；碰撞池氣體：Medium；氣簾氣（CUR）：20 psi；入口電壓（EP）：10 V；碰撞室出口電壓（CXP）：16 V；駐留時間：200 ms；以m/z 356.1→164.0作為定量離子對，錐孔電壓為140 V，碰撞電壓為35 V；以m/z 356.1→120.9作為定性離子對，錐孔電壓為140 V，碰撞電壓為80 V。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制

精密稱取N-亞硝基拉貝洛爾對照品10.06 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液，進一步用甲醇稀釋制備100 ng/mL的對照品溶液。用甲醇稀釋成質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL的系列校準標準溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制

原料藥制備：精密稱取鹽酸拉貝洛爾細粉50 mg，置于15 mL離心管中，精密加入10 mL甲醇，作為供試品溶液。

片劑制備：取本品10片，精密稱定，研細，混勻，精密稱取相當于鹽酸拉貝洛爾約50 mg的細粉，置于15 mL離心管中，精密加入10 mL甲醇，超聲5 min，并通過0.22 μm PTFE注射器過濾器過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗

取甲醇作為空白溶劑，以及“2.2”項下2 ng/mL的對照品溶液和供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，見圖1。在所建立的色譜和質譜條件下，N-亞硝基拉貝洛爾的保留時間為7.14 min，峰型良好，空白溶劑對檢測無干擾。

2.3.2 檢出限及定量限試驗

取“2.2.1”項下1 ng/mL的線性溶液，以甲醇作為稀釋劑逐步稀釋，當對照品溶液的質量濃度為0.03 ng/mL時，其信噪比不小于10，即為定量限。當對照品的質量濃度為0.01 ng/mL時，其信噪比不小于3，即為檢出限。N-亞硝基拉貝洛爾6個定量限的峰面積RSD值為2.1%。

2.3.3 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下系列線性溶液，進樣檢測，記錄色譜圖。以N-亞硝基拉貝洛爾峰面積Y為縱坐標，以質量濃度X（ng/mL）為橫坐標進行線性回歸，得到N-亞硝基拉貝洛爾的線性回歸方程為Y=9 010.51X+665.08（r=0.999 9）。結果表明，在1.01～100.60 ng/mL質量濃度范圍內，N-亞硝基拉貝洛爾峰面積與質量濃度之間呈現良好的線性關系。N-亞硝基拉貝洛爾的工作曲線見圖2。

2.3.4 精密度和重復性試驗

取“2.2.1”項下2.0 ng/mL的線性溶液連續進樣6次，得到N-亞硝基拉貝洛爾峰面積的RSD值為3.93%，表明系統精密度良好。取鹽酸拉貝洛爾，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣檢測，按標準曲線法計算N-亞硝基拉貝洛爾含量，計算得到6份供試品溶液中N-亞硝基拉貝洛爾含量的RSD值為4.41%。結果表明，方法具有良好的重復性。

2.3.5 穩定性考察

取“2.2.1”項下2.0 ng/mL的線性溶液和供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進樣檢測。結果顯示，N-亞硝基拉貝洛爾峰面積的RSD值為3.56%，表明室溫條件下對照品溶液和供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.6 回收率試驗

取鹽酸拉貝洛爾原料藥（批號為18220501），精密稱取約100 mg，置于20 mL容量瓶中，分別精密加入“2.2.1”項下100 ng/mL對照品溶液1.5、1.0、0.5 mL，定容至刻度，超聲5 min，作為回收率溶液，每個濃度點平行制備3份，進樣檢測，結果見表2。由表2可知，高、中、低濃度點的回收率分別為96.84%（RSD值為0.89%，n=3），99.53%（RSD值為1.93%，n=3）和97.33%（RSD值為1.03%，n=3），表明回收率良好。

2.3.7 耐用性試驗

耐用性是衡量不受方法參數微小故意變化影響的能力。通過改變流動相的流速和柱溫，對方法的耐用性進行分析。流動相的最佳流速為0.50 mL/min，流速由0.49 mL/min變化為0.51 mL/min，變化幅度為±0.01個單位。在49 ℃和51 ℃（非最佳溫度50 ℃）條件下考察了柱箱溫度對分辨率的影響，計算加標供試品溶液中N-亞硝基拉貝洛爾雜質的回收率。結果表明，在上述檢測條件下，N -亞硝基拉貝洛爾回收率良好，證明該方法具有較好的耐用性。

2.4 樣品測定

按“2.2”項所述方法制備鹽酸拉貝洛爾供試品溶液，依照“2.1”項下條件進樣檢測，記錄色譜圖。采用標準曲線法，以峰面積計算供試品溶液中N-亞硝基拉貝洛爾的含量，樣品測定結果見表3。結果表明，拉貝洛爾樣品中N-亞硝基拉貝洛爾的質量濃度為0.37～0.79 ng/mL。

3 討 論

1）采用ESI離子源和APCI離子源下針泵進樣，對N-亞硝基拉貝洛爾的響應及定量、定性離子進行了考察。結果表明，N-亞硝基拉貝洛爾在ESI離子源負離子采集模式下響應更好。通過對ESI條件進行優化，最終確定N-亞硝基拉貝洛爾定量離子對為m/z 356.1→164.0，錐孔電壓為140 V，碰撞電壓為35 V；定性離子對為m/z 356.1→120.9，錐孔電壓為140 V，碰撞電壓為80 V。

2）通過對色譜柱進行考察，最終得到了最合適的峰形和響應值。其中，在Agilent SB C18 （100 mm×3.0 mm，1.8 μm）色譜柱、ACE Excel C18-AR（4.6 mm×150 mm， 3 μm）色譜柱和phenomenex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）色譜柱檢測時的峰形較差。結果表明，Waters ACQUITY UPLC CSH C18（150 mm×3.0 mm， 1.7 μm）色譜柱在峰形和對分析物的響應方面具有良好的適用性。

3）采用0.1%甲酸水溶液、0.01 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液、0.01 mol/L甲酸銨水溶液3種水相探索了有機相甲醇和乙腈對色譜法靈敏度和響應值的影響。結果表明，使用0.01 mol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，色譜峰響應值、分辨率和峰形均達到最佳條件。為了避免因拉貝洛爾濃度過高而造成的污染，在質譜程序中，將0～6.0 min時的樣品進入廢液，6.0 min后的樣品進入質譜采集。通過考察水、甲醇和乙腈作為溶劑的色譜效率發現，N-亞硝基拉貝洛爾和拉貝洛爾在水、甲醇和乙腈中都具有良好的溶解性，但在甲醇中的響應值更高，所以選取甲醇作為溶劑。

4 結 語

N-亞硝基拉貝洛爾是潛在的基因毒性雜質，基因毒性雜質經過體內代謝后毒性極強，在藥物研發和生產過程中應該嚴格對其進行把控。本文建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定鹽酸拉貝洛爾中N -亞硝基拉貝洛爾的方法，具有較高的選擇性、靈敏度、精密度和準確度，可作為拉貝洛爾中N -亞硝基拉貝洛爾含量的快速、準確的檢測平臺。但目前對N-亞硝基拉貝洛爾仍沒有明確的控制限度，因而本文并未進行毒理學研究。今后還將對雜質進行更為深入的毒理研究，建立合理的控制限度，保證用藥安全。

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