科學家成功構建胚胎干細胞嵌合體猴

[本刊訊] 由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心劉真研究組、腦智卓越中心非人靈長類研究平臺孫強研究團隊和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院M. A. Esteban研究組合作，首次成功構建高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴，并證實猴胚胎干細胞可高效地貢獻到胚外胎盤組織和生殖細胞。這對理解靈長類胚胎干細胞的全能性具重要意義，為遺傳修飾模型猴的構建奠定了基礎。成果以“高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴”為題，于2023年11月9日以封面文章形式發表在《細胞》（Cell）上。

胚胎干細胞是指由著床前囊胚的內細胞團在體外分離培養而來的多能性細胞，在模式動物構建、細胞治療、器官再生、類器官模型等領域有重要作用。它有體外無限自我復制更新、誘導實現多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關鍵特征，其中胚胎注射形成嵌合體是評估胚胎干細胞多向分化潛能的金標準。之前已實現小鼠、大鼠胚胎干細胞胚胎注射形成嵌合體，但非人靈長類胚胎干細胞嵌合體研究一直進展緩慢。

為獲得具有高效發育潛能的胚胎干細胞。研究者建立了6種不同培養體系下的食蟹猴胚胎干細胞，從克隆形態、免疫熒光、單細胞轉錄組、線粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等方面，對它們進行全面系統的評估。發現5iLAF、4CL和PXGL體系下的食蟹猴胚胎干細胞具有較高多能性，且4CL體系下的干細胞具有更好的傳代穩定性和基因組穩定性。

胚胎干細胞注射入受體胚胎后的快速凋亡是影響胚胎干細胞成功嵌合的關鍵。研究者選用綠色熒光蛋白標記的4CL條件下的胚胎干細胞進行猴胚胎注射，通過測試干細胞注射入胚胎后的不同培養基和培養時間的組合，得到既不影響胚胎正常發育，又能保證干細胞存活的最優嵌合胚胎培養條件。5iLAF、Primed體系下的胚胎干細胞在該優化條件下也表現出胚胎注射后的高存活率。將注射了4CL和5iLAF干細胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養到第17天，發現注射的胚胎干細胞仍可高效存活，單細胞測序表明猴胚胎干細胞可與受體胚胎細胞同步發育，且貢獻到第17天猴胚胎的不同細胞譜系中。

在系統性評估不同培養條件下，猴胚胎干細胞狀態和改進優化了嵌合胚胎培養條件的基礎上，研究者將注射了綠色熒光標記的4CL干細胞的胚胎移植到代孕母猴內。在一只出生存活猴和一只流產猴中檢測到胚胎干細胞的嵌合。通過一系列嵌合體分析流程，發現出生存活猴中胚胎干細胞的貢獻比例高達70%，流產猴中胚胎干細胞的貢獻比例約20%。單細胞轉錄組測序也表明注射的胚胎干細胞可以與受體胚胎細胞同步分化到出生個體猴的各種不同細胞譜系中。

胎盤組織和生殖細胞是胚胎發育和重編程過程中兩類特殊組織和細胞。胎盤組織由滋養外胚層發育而來，而生殖細胞在發育過程中要經歷更加劇烈的表觀重編程。研究者在兩只嵌合體猴的胎盤組織中均發現了胚胎干細胞的高比例貢獻。考慮到小鼠胚胎干細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，該結果說明靈長類胚胎干細胞可能具有不同于嚙齒類的獨特的發育全能性特征。此外，兩只嵌合體猴的生殖細胞中也發現了胚胎干細胞的高比例貢獻，這對后續基于該技術的遺傳修飾模型構建至關重要。

該工作建立了系統評估不同培養條件下，猴胚胎干細胞多能性狀態的研究體系，并探索得到有利于胚胎干細胞存活的胚胎嵌合體的培養條件，顯著提升了胚胎干細胞注入胚胎后的存活效率，最終得到出生存活的高比例胚胎干細胞貢獻的嵌合體猴，證實注入的猴胚胎干細胞可高效貢獻到包括胎盤和生殖細胞在內的各種不同組織和細胞。這對于理解靈長類胚胎干細胞全能性和發育潛能具有重要意義，為建立基于猴胚胎干細胞嵌合體的基因打靶和模型構建技術奠定了基礎。

該研究嚴格遵守生物倫理規范，所有實驗均符合國際干細胞研究學會的研究指南，并經腦智卓越中心倫理委員會審核。

（曉 工）