智三針療法對PSCI大鼠學習和記憶能力的影響

翁瑜君 陳志寧 梁偉海 余永森 林國偉 唐梁 劉曉俊

廣州市第一人民醫院中醫科，廣州 510180

腦卒中后認知功能障礙（PSCI）屬于血管性認知功能障礙范疇［1］。根據2020 年《中國卒中報告》，中國卒中患病率為1 114.8/10萬，病死率為149.49/10萬［2］。大型國際隊列研究在近期的報道則顯示，發生卒中后的幸存者在10 年內PSCI 患病率高達61%［3］，而且卒中患者中，伴有認知功能障礙者，其病死率明顯升高。因自理能力減退，PSCI患者生存質量也隨之下降，家庭及社會也面臨較大負擔。PSCI 病因和發病機制較為復雜，根據我國現有的醫療資源，現代醫學治療該病，重點在控制危險因素和改善認知兩方面，以藥物治療為主［3-8］，但認知功能改善方面療效不甚理想。因此，積極尋求有效療法，使該疾病得到有效救治，具有較大意義。中醫理論認為，PSCI 病因病機為髓海不足，腦失所用。我國知名針灸學家靳瑞創建嶺南代表性“靳三針療法”，其中“智三針”具有補髓充腦、開竅益智的作用，該療法取穴少、易于操作、治療費用低，主要用于治療各種類型的認知障礙。同時通過文獻研究，智三針對PSCI 的相關研究報道較少［15-21］。因此，本實驗運用智三針療法治療PSCI大鼠，通過Morris 水迷宮實驗，觀察經智三針療法干預后，各組大鼠逃避潛伏期及游泳距離的變化，評價3 組大鼠在干預前及干預后的學習能力和記憶能力。分析智三針療法對改善PSCI 大鼠學習能力及記憶能力的療效，為智三針療法的臨床應用提供實驗參考。

材料與方法

1.材料

1.1.實驗動物 2022 年8 月2 日至10 月3 日進行動物實驗研究。本實驗動物由廣州輝園苑醫藥科技有限公司科研部動物實驗中心提供。用SPF 級體質量（305.19±12.44）g的SD 雄性大鼠45 只，所有大鼠均在濕度30%～50%，溫度21～23 ℃，模擬日夜系統的溫室下自由飲食飼養3 周。大鼠攝食穩定，體質量穩步增加。

1.2.實驗針灸器具 本實驗智三針療法采用東邦牌毫針，型號為0.3 mm×25.0 mm，從江蘇東邦醫療器械有限公司采購。

1.3.儀器 大鼠腦立體定位儀（北京銘泰佳信科技有限公司）；Morris水迷宮設備（江蘇賽昂斯科技有限公司）。

2.方法

2.1.分組及PSCI 大鼠模型的制備 實驗大鼠在適應性飼養3 周后，隨機分為3 組，假手術組、PSCI 大鼠對照組、智三針療法組，各15只。在造模前6 d均行Morris水迷宮實驗評定各組大鼠學習及記憶能力。⑴PSCI大鼠對照組及智三針療法組：使用大腦中動脈栓塞（MCAO）［9-10］法制備PSCI大鼠模型，并于術后第3 天用Morris 水迷宮實驗檢驗PSCI 大鼠模型。⑵假手術組：將大鼠麻醉，切開手術部位皮膚后，立即縫合，不進行MCAO 步驟。⑶造模方法：采用MCAO 法造模。大鼠造模前禁食12 h，禁水4 h，0.5 %戊巴比妥鈉麻醉，頸部備毛、消毒，做正中切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎相關動脈，用線栓經頸內動脈插入大腦中動脈的方式制造腦缺血及缺血再灌注狀態。完成操作后，縫合頸部傷口，進行常規飼養。⑷造模成功標準：與假手術組對比，PSCI 大鼠對照組及智三針療法組大鼠逃避潛伏期明顯延長，游泳距離明顯增長。

2.2.針灸干預 在采用MCAO 法造模術后第3 天，應用Morris 水迷宮實驗檢測各組大鼠學習和認知能力，并在Morris 水迷宮實驗結束后第1 天，分別對各組大鼠進行干預。智三針療法的穴位由神庭穴及兩側本神穴組成。參照《實驗針灸學》［11］大鼠腧穴定位，神庭穴：在大鼠兩眼連線中點頭正中線上2 mm凹陷處；本神穴：在神庭穴與耳根連線的內1/3 處。采用規格0.3 mm×25.0 mm 的毫針在穴位平刺進針8 mm，用捻轉手法，以90°捻轉刺激，捻轉速度60 次/min。持續刺激2 min 后，休息3 min，如此反復，總共操作15 min，1 次/d，共持續21 d。PSCI 大鼠對照組及假手術組：給予智三針療法組大鼠同樣的抓取、固定、取穴、消毒操作，但是不進行針刺治療。

2.3.Morris水迷宮實驗步驟 本實驗在造模前6 d、造模后3 d 及針灸干預結束后1 d 進行Morris 水迷宮實驗［12-13］。⑴定位航行實驗。實驗前1 d，先將大鼠放入水迷宮裝置中適應性游泳，然后分別在裝置的4 個象限對大鼠進行入水及尋找平臺訓練，每天每只大鼠訓練4次，共持續4 d。記錄大鼠在1 min內尋找到并登上平臺的時間即為逃避潛伏期。⑵空間探索實驗。在定位航行實驗結束后第2 天，撤離平臺，大鼠隨機點入水，通過對其游泳的軌跡計算尋找到平臺時總的游泳距離。

3.統計學分析

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，計量資料多組間比較用方差分析，LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，自身對照采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.大鼠一般情況

實驗開始時共45只大鼠，MCAO法造模過程中，智三針療法組死亡3 只，PSCI 大鼠對照組死亡2 只，假手術組死亡2 只。術后恢復及針灸干預過程中，智三針療法組死亡0 只，PSCI 大鼠對照組死亡2 只，假手術組死亡1 只。最終各組大鼠數為智三針療法組12 只、PSCI 大鼠對照組11 只、假手術組12只。

2.大鼠體質量變化（表1）

表1 3組大鼠干預前后體質量變化比較（g，± s）

表1 3組大鼠干預前后體質量變化比較（g，± s）

注：PSCI為腦卒中后認知功能障礙

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術組F值P值只數12 11 12干預前302.1±18.1 310.1±20.5 306.1±23.9 2.550 0.075干預后353.1±22.3 369.1±34.1 360.1±28.7 2.320 0.104 t值1.238 1.571 1.484 P值0.231 0.133 0.180

干預前（第1天）及干預后，3組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；通過t檢驗分析，3組大鼠在同組干預前后體質量增長無明顯差別，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

3.各組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結果（表2）

表2 3組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結果（± s）

表2 3組大鼠造模前后Morris水迷宮實驗結果（± s）

注：PSCI為腦卒中后認知功能障礙；與假手術組比較，aP＜0.05；與PSCI大鼠對照組比較，bP＞0.05

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術組F值P值只數12 11 12逃避潛伏期（s）造模前/假手術前37.32±6.19 35.90±6.08 37.66±7.02 2.210 0.093造模后/假手術后51.94±8.19ab 53.13±6.28a 41.66±6.65 4.060 0.022 t值2.713 2.692 1.478 P值0.026 0.029 0.183游泳距離（cm）造模前/假手術前623.52±42.22 629.36±39.87 617.96±45.60 2.190 0.092造模后/假手術后1 242.25±100.72ab 1 192.28±137.72a 702.92±85.60 4.240 0.017 t值2.208 2.276 1.372 P值0.046 0.044 0.195

造模前6 d，3 組大鼠逃避潛伏期、游泳距離比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），這提示造模前3 組大鼠的學習能力及記憶力無明顯差別。造模后3 d，3 組大鼠逃避潛伏期、游泳距離差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與假手術組比較，PSCI大鼠對照組、智三針療法組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離均明顯延長，差異均有統計學意義（t=2.228、2.219、2.304、2.343，均P＜0.05）；與PSCI大鼠對照組比較，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離差異均無統計學意義（t=1.630、1.866，均P＞0.05）。造模后3 d 與造模前6 d比較，智三針療法組、PSCI大鼠對照組的逃避潛伏期和游泳距離均有增長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與假手術前比較，假手術后大鼠的逃避潛伏期、游泳距離均無變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。

4.各組大鼠在針灸干預前后的Morris 水迷宮實驗結果（表3）

表3 3組大鼠在針灸干預前后的Morris水迷宮實驗結果（± s）

表3 3組大鼠在針灸干預前后的Morris水迷宮實驗結果（± s）

注：PSCI為腦卒中后認知功能障礙；與假手術組比較，aP＜0.05；與PSCI大鼠對照組比較，bP＜0.05

組別智三針療法組PSCI大鼠對照組假手術組F值P值只數12 11 12逃避潛伏期（s）干預前51.94±8.19 53.13±6.28 41.66±6.65 4.060 0.022針灸干預后45.64±7.70ab 56.33±10.32a 39.17±5.35 4.270 0.016 t值2.245 1.602 1.370 P值0.045 0.117 0.197游泳距離（cm）干預前1 242.25±100.72 1 192.28±137.72 702.92±85.60 4.240 0.017針灸干預后887.35±92.47ab 1 292.29±104.52a 621.33±56.41 4.320 0.015 t值2.211 1.681 1.824 P值0.046 0.108 0.075

智三針療法組大鼠針灸干預后逃避潛伏期與針灸干預前比較明顯縮短，游泳距離明顯減少，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；干預后，PSCI 大鼠對照組、假手術組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離與干預前比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。針灸干預結束后1 d，3組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與假手術組比較，PSCI 大鼠對照組、智三針療法組大鼠的逃避潛伏期、游泳距離均延長，差異均有統計學意義（t=2.508、2.482、2.473、2.318，均P＜0.05）；與PSCI 大鼠對照組比較，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期縮短，游泳距離明顯減少，差異均有統計學意義（t=2.261、2.201，均P＜0.05）。

討論

對于中風記載最早出現在《黃帝內經》中，如對昏迷、半身不遂等有“仆擊、大厥、偏風”等描述。根據主要臨床表現，“卒中后認知障礙”可歸屬為“呆病、善忘”等病癥。腦主元神是精神意識的主宰。我國知名針灸學家靳瑞在長期性的臨床實踐及科學研究過程中，創建嶺南代表性“靳三針療法”［19］。其中“智三針”由神庭和本神穴組成，主要用于治療各種認知障礙，前期已有研究均提示其對血管性認知功能障礙療效顯著［15-21］。目前，中醫界認為PSCI 的病因病機為髓海不足，腦失所用。其證候特征：虛證則以精氣虧虛，腦失所養；實證則以痰及瘀為主，痹阻腦竅。據此，筆者認為，神庭穴屬于督脈，督脈入絡腦；本神穴屬足少陽膽經穴位。本，人之根本，是頭部元神所在之處，主治神志病。針刺二穴可以起到補髓充腦，開竅益智的作用，適合用于PSCI 治療。通過文獻研究，智三針對PSCI 的相關研究及報道較少，加上智三針穴位組成較少，可以在大鼠上找到相應穴位，進行動物實驗的可行性較大［11，15-21］。基于此，本實驗開展智三針療法對PSCI 大鼠的學習能力和記憶能力的療效觀察，為該療法的臨床應用提供實驗參考。

本研究應用Morris 水迷宮實驗評定大鼠學習和記憶的能力。20 世紀80 年代初，英國心理學家Morris 設計出Morris 水迷宮，用于大腦的學習和記憶功能研究。此后，Morris 水迷宮系統被廣泛運用在神經生物學領域的相關研究。目前，Morris水迷宮實驗是世界公認的評價學習記憶的方法，主要實驗動物是大鼠和小鼠。Morris水迷宮實驗測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗。定位航行試驗記錄逃避潛伏期，反映動物的學習能力；空間探索試驗記錄游泳軌跡及距離，反映動物的記憶能力［12］。

Morris水迷宮實驗中，逃避潛伏期越短，學習能力越強；游泳距離越短，記憶能力越強。本研究顯示，MCAO 法造模后，智三針療法組、PSCI大鼠對照組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離較造模前均有增長。假手術組大鼠未進行MCAO 法操作，其學習能力及記憶能力較假手術前無變化。同時，造模后，與假手術組對比，智三針療法組、PSCI 大鼠對照組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離均明顯延長（均P＜0.05），且智三針組和PSCI 大鼠對照組對比，兩組大鼠的學習能力及記憶力無明顯差別（均P＞0.05），這提示造模成功。針灸干預后，智三針療法組大鼠的逃避潛伏期及游泳距離與干預前對比顯著縮短（均P＜0.05），同時較PSCI 大鼠對照組的逃避潛伏期及游泳距離也顯著縮短（均P＜0.05）。

大鼠在卒中后認知障礙狀態下，經過智三針療法干預，在學習能力及記憶力方面都有改善，這提示智三針療法對PSCI 大鼠有一定療效?；谠擁椦芯拷Y論，后續將嘗試進一步從膽堿能通路角度觀察智三針療法對PSCI 大鼠的作用靶點和療效機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明 翁瑜君：醞釀和設計試驗，實施研究，起草文章，統計分析；陳志寧：實施研究，采集數據；梁偉海：分析/解釋數據；余永森：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析；林國偉：采集數據；唐梁：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，指導；劉曉?。簩ξ恼碌闹R性內容作批評性審閱，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻