獸藥標準物質中鈉含量的定值研究

王 軒,楊 星,楊秀玉,周天慧,彭文繡,趙富華,葉能勝,張秀英,*,韓寧寧,*

(1. 中國獸醫藥品監察所,北京 100081;2. 北京市疾病預防控制中心 食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室,北京 100013;3. 首都師范大學化學系,北京 100048)

國家獸藥標準物質是規范獸藥質量的一把尺子,是獸藥質量檢驗中的實物標準[1]。為了確保獸用化學藥品標準物質的賦值準確性,其定值方式一般采用質量平衡法,該方法是通過將水分、揮發性物質、灰分、成鹽離子等雜質扣除,再根據主成分在有機成分中的百分比來確定標準物質含量[2-3]。這其中,成鹽離子的含量測定,直接影響了獸藥標準物質的純度準確性。因此,如何對獸藥標準物質中的成鹽離子進行準確定值尤為重要。

多種獸用原料藥是以成鹽的形式存在,以提升獸藥的溶解度和生物利用度。目前,成鹽離子的賦值方式通常采用液相色譜—蒸發光散射檢測器法[4-5]、原子吸收光譜法[6]、離子色譜法[7-9]等。液相色譜-蒸發光散射檢測器是一種通用型檢測方法,也可用于成鹽離子的測定。但由于其檢測窗口較小,線性范圍一般較窄,不利于新方法的開發。電感耦合等離子質譜法擁有出色的檢測靈敏度,但伴隨著更加復雜的前處理過程和更高的檢測成本。對于獸藥原料藥,成鹽離子含量較高,離子色譜法即可滿足其需求,更加經濟適用。綜上分析,在方法建立初期,本研究選擇離子色譜法作為分析手段開展研究工作。近年來,離子色譜法因其高效準確、價格低廉、能夠有效對多種離子進行同時檢測等特點,受到越來越多的關注[10],并且已經廣泛應用于各類檢驗檢測工作中,包括環境分析[11-13]、食品分析[14-17]、考古研究[18-20]和藥物分析[21-23]等領域。張才煜等[9]建立了測定化學對照品中鹽酸鹽含量的離子色譜法,對維生素BT、鹽酸克侖特羅等對照品中的氯離子含量進行檢測定,并深入討論了原料成鹽情況對化學對照品的賦值造成的影響,同時結合核磁定量法對其結果進行確證。潘忠全等[21]建立了一種同時測定藥品中巴比妥酸和硝酸鹽的離子色譜法,實現了巴比妥等樣品中微量巴比妥酸和硝酸鹽的定量分析。在藥物分析領域,離子色譜法已逐漸成為成鹽離子定量分析的首選方法。

為探索一種普適性獸藥標準物質中鈉含量的測定方法,本文選擇安乃近對照品原料以及青霉素、磺胺氯達嗪鈉、磺胺氯吡嗪鈉、莫能菌素對照品作為分析對象,以離子色譜法作為測定手段,建立一種能夠準確定值獸藥標準物質中鈉含量的方法。本方法靈敏度高、結果準確、專屬性強,可作為國家獸藥標準物質中鈉離子檢測的通用方法,為國家獸藥標準物質的準確賦值提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Dionex Integrion離子色譜儀,配有CSRS 300(4 mm)抑制器、電導檢測器和甲烷磺酸(MSA)在線淋洗液發生器(Thermo公司,Chromeleon 7色譜工作站);Milli-Q去離子水發生系統(Millipore公司);METTLER XSR205DU型分析天平(Mettler公司)。

安乃近原料來自某獸藥生產企業(批號2204088),青霉素對照品(批號:K0251509)、磺胺氯吡嗪鈉對照品(批號:H0981912)、磺胺氯達嗪鈉對照品(批號:H0221704)、莫能菌素對照品(批號K0281911)來自中國獸醫藥品監察所,其原料均來源于獸藥生產企業。鈉元素標準物質[GBW(E)080127,含量1000 μg/mL]來自中國計量科學院,水中鋰鈉鉀鈣鎂銨根成分分析標準物質(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)(SGB-YYA01039H)和甲烷磺酸淋洗液發生罐(Dionex EGC III)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,甲醇為色譜純,水為超純水。

1.2 色譜條件 采用DIONEX IonPac CX12A(250 mm×4 mm)陽離子交換色譜柱,DIONEX IonPac CG12A(50 mm×4 mm)保護柱,以淋洗液發生器產生的23 mmol/L甲烷磺酸溶液為流動相,流速1.0 mL/min,檢測方式為電導檢測器,進樣體積25 μL,檢測池溫度35 ℃,柱溫35 ℃,采用Chromeleon 7色譜工作站對數據進行采集和處理。

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合陽離子溶液 精密量取陽離子混合標準溶液5 mL,置100 mL量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,作為混合陽離子溶液。

1.3.2 對照品溶液 精密量取鈉單元素標準溶液(含Na+1000 μg/mL)1 mL,置100 mL量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液 取安乃近原料、青霉素、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺氯達嗪鈉對照品適量,加去離子水溶解并稀釋至每毫升約含10 μg鈉離子的溶液,作為供試品溶液。對于水溶性較差的原料或對照品(如莫能菌素),可在溶解時加入適量有機溶劑助溶,并用去離子水稀釋至每毫升約含10 μg鈉離子的溶液。

1.3.4 空白溶液 對于水溶性好的標準物質,以去離子水作為空白溶液。對于水溶性較差的標準物質,配制與供試品溶液相同的溶劑空白溶液。

1.4 計算公式 本方法測量結果的計算公式為:鈉含量=(供試品溶液峰面積×對照品體積×對照品含量×供試品稀釋倍數)×100%/(對照品溶液峰面積×供試品質量×對照品稀釋倍數)

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性考察 取1.3.1項下混合陽離子溶液,照1.2項下色譜條件測定。結果顯示,在該色譜條件下,Na+與其他陽離子間分離效果良好,相鄰色譜峰間分離度均大于2.0,在含量測定的過程中不受其他陽離子的干擾,方法專屬性良好。專屬性色譜圖見圖1。

圖1 專屬性離子色譜圖。其中:1為Li+、2為Na+、3為K+、4為NH4+、5為Mg2+、6為Ca2+

2.1.2 線性關系考察 取鈉元素標準溶液適量,用去離子水稀釋制成濃度為50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的溶液。以線性曲線溶液色譜圖中峰面積對鈉離子濃度進行線性回歸,得到回歸方程為:y=0.253x+0.0258(r2=0.9999)。本方法在鈉離子濃度為0.1～50 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。對照品色譜圖見圖2。其中,銨根離子存在于實驗用去離子水中。

圖2 鈉標準溶液(10 μg/mL)離子色譜圖。其中:1為Na+、2為NH4+

2.1.3 精密度試驗 取濃度為10 μg/mL的對照品溶液,照1.2項下色譜條件,在同一天內連續重復進樣6次,計算保留時間和峰面積的精密度。Na+峰面積的精密度按保留時間計為0.05%,按峰面積計為0.44%。結果表明本方法精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 平行配制安乃近供試品溶液6份,照2.1項下色譜條件進行測定。Na+含量分別為6.49%、6.47%、6.35%、6.56%、6.41%、6.40%,平均值為6.45%,RSD為1.06%(n=6)。平行配制青霉素供試品溶液6份,照2.1項下色譜條件進行測定。Na+含量分別為6.37%、6.48%、6.39%、6.42%、6.51%、6.49%,平均值為6.44%,RSD為0.82%(n=6)。實驗結果表明本方法重復性良好。

2.1.5 回收率試驗 采用在安乃近原料和青霉素對照品中標準加入鈉離子的方法測定本方法的回收率。取安乃近原料約387 mg,置于50 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為回收率試驗儲備溶液。精密量取9份上述溶液,每份1 mL,分別置于9個100 mL量瓶中,再精密加入鈉標準溶液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL,用水稀釋至刻度,搖勻,制成低、中、高3個水平的溶液各三份。照2.1項下色譜條件,采用外標法測定回收率。取青霉素對照品適量,同法測定,結果見表1。安乃近中鈉離子平均回收率為102.7%(n=9),RSD為0.59%。青霉素中鈉離子平均回收率為99.4%(n=9),RSD為0.42%。結果表明,本方法回收率良好。

表1 鈉離子在安乃近原料和青霉素對照品中的回收率

2.1.6 檢測限與定量限 取鈉離子線性試驗溶液適量,用水逐級稀釋至一定濃度,以信噪比大于3作為檢測限,以信噪比大于10作為定量限。方法檢測限為0.02 μg/mL,定量限為0.05 μg/mL。

2.1.7 耐用性試驗 采用1.3.1項下混合陽離子溶液,使用不同淋洗液濃度、柱溫、流速對方法耐用性進行考察。結果如表2所示。在不同淋洗液濃度、柱溫、流速條件下,Na+與其他陽離子間的分離度均大于2.0,理論塔板數大于5000,表明方法耐用性良好。

表2 方法耐用性考察

2.2 樣品測定 取1.3.3項下供試品溶液,照1.2項下色譜條件測定,采用外標法以峰面積計算,結果見表3。典型離子色譜圖和溶劑空白圖見圖3、圖4所示。其中,理論含量為根據分子量,按100%成鹽率計算結果。

表3 供試品中鈉含量測定結果

圖3 供試品典型離子色譜圖。其中:1為Na+、2為K+、3為NH4+

圖4 溶劑空白圖。其中:1為Na+、2為K+、3為NH4+

3 討論與結論

3.1 方法可靠性 為了考察方法的專屬性,防止其他陽離子干擾鈉離子的測定,采用陽離子混合標準溶液,用去離子水稀釋制成約含Na+10 μg/mL的系統適用性溶液。結果表明,在建立的色譜條件下,鈉離子峰與相鄰離子峰間的分離度大于2.0,理論塔板數大于5000,能夠有效避免其他陽離子對測定鈉離子含量的干擾。同時,為了考察本方法的耐用性,使用陽離子混合標準溶液,將建立的方法在改變淋洗液濃度(±10%)、柱溫(±5 ℃)和流速(±10%)后進行試驗。結果表明,鈉離子峰與相鄰離子峰間的分離度均大于2.0,均能夠實現基線分離,理論塔板數均大于5000 plate/m,證明方法具有較高的可靠性和良好的耐用性。

3.2 供試品制備方法的選擇 通過將安乃近、青霉素、磺胺氯達嗪鈉和磺胺氯吡嗪鈉的測定值和理論值進行比較發現,本方法對上述水溶性較好的原料及對照品能夠實現良好的測定,對于一些水溶性較差的對照品(如鹽霉素鈉、莫能菌素鈉等),需在供試品配制的過程中加入適量有機溶劑(如乙醇、甲醇等)助溶,使得鈉離子能夠更好的溶解于供試品溶液中,并增加溶劑空白試驗,扣去溶劑中的鈉含量,從而實現準確測定。

以水溶性較差的莫能菌素對照品為例,取莫能菌素對照品適量,加水溶解并稀釋制成約10 μg/mL的溶液,使用1.2項色譜條件進行測定,結果鈉含量為2.01%,遠低于理論數值。改變供試品溶液配制過程為:取莫能菌素對照品適量,置100 mL量瓶中,加入10 mL甲醇使溶解,用水稀釋制成約10 μg/mL的溶液,使用1.2項色譜條件進行測定,并配制相同溶劑空白,扣除溶劑中的鈉含量,結果表明該批莫能菌素對照品中鈉含量為3.21%,與理論數值一致。

3.3 方法的拓展應用 本方法建立了獸藥標準物質中鈉含量的測定方法。通過專屬性試驗結果可知,在本方法條件下,鋰、鈉、鉀、銨根、鎂、鈣之間均能實現基線分離(Rs>2.0)。因此,對于獸藥標準物質中常見的其他陽離子,本方法能夠應用于獸藥標準物質中其他常見陽離子的測定。在測定時需根據標準物質的溶解性對供試品的配制方法進行優化,并進行必要的方法學考察驗證。

3.4 方法的選擇與比較 將本方法與已發表的其他鈉含量測定方法進行比較,結果見表4。結果表明,本方法在較寬的線性范圍內,重復性良好,并擁有良好的回收率,檢測限較低。

表4 與其他鈉含量測定方法進行比較

建立了一種測定獸用標準物質中鈉離子含量的離子色譜法。本方法在較寬的線性范圍內擁有良好的精密度和重現性,通過對獸用原料和對照品的加標回收試驗,證明了本方法的準確度。本方法簡單、高效、準確,可以作為通用方法測定獸用標準物質中的鈉離子,并可以拓展應用于其他常見陽離子的測定中。