抑制鈣結(jié)合蛋白S100A4表達(dá)緩解小鼠膿毒血癥相關(guān)肺損傷的研究*

陳科，莫詩卉，張丁山，何菁菁，晏世榮，吳通前，余芳

（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.臨床檢驗(yàn)中心，2.臨床研究中心，貴州 貴陽 550004）

膿毒血癥是臨床常見的感染性疾病，由病原微生物或其毒素入血所致。2020年國內(nèi)40 家重癥監(jiān)護(hù)治療病房（intensive care unit,ICU）數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率為20.6%，而病死率為35.5%，嚴(yán)重者可達(dá)50%[1]。膿毒血癥機(jī)制復(fù)雜，感染早期即可出現(xiàn)免疫功能失衡，導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，進(jìn)而引起多器官衰竭[2]，膿毒血癥患者最常見肺損傷，且與患者預(yù)后密切相關(guān)[3]，因此，深入了解膿毒血癥相關(guān)肺損傷可能為疾病診療和患者管理提供新的見解。

S100A4 屬于鈣結(jié)合蛋白S100 家族，是一種多功能的分泌型蛋白，可參與多種生物調(diào)節(jié)活動，并且促進(jìn)炎癥進(jìn)展，在腫瘤、纖維化、過敏等多個疾病過程中均有不同的病理作用[4]。氯硝柳胺（Niclosamide）被認(rèn)為是S100A4 轉(zhuǎn)錄抑制劑，通過抑制S100A4 可能緩解肌萎縮側(cè)索硬化、腎纖維化和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移[5-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺S100A4 在小鼠肺纖維化模型中表達(dá)升高，而Niclosamide 可降低其表達(dá)，并緩解肺纖維化進(jìn)展[8]。在哮喘模型小鼠中，肺S100A4 表達(dá)明顯增加，經(jīng)S100A4 抗體預(yù)處理可顯著降低肺部炎癥[9]。然而Niclosamide 是否通過抑制肺S100A4 表達(dá)從而緩解膿毒血癥相關(guān)肺損傷，及其潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬通過復(fù)制膿毒血癥模型小鼠，研究肺S100A4 與膿毒血癥相關(guān)肺損傷的潛在關(guān)聯(lián)，并探索Niclosamide 對膿毒血癥相關(guān)肺損傷的潛在調(diào)控機(jī)制，旨在進(jìn)一步了解膿毒血癥相關(guān)肺損傷機(jī)制，為臨床診療和患者管理提供潛在選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與模型復(fù)制

實(shí)驗(yàn)用小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。將12 只4～8 周雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為對照組（Con 組）、膿毒血癥組（LPS 組）、Niclosamide對照組（Nic 組）及Niclosamide 預(yù)處理組（LPS+Nic組），每組3 只。所有小鼠均喂養(yǎng)于SPF 級動物房中，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，復(fù)制小鼠膿毒血癥模型。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過貴州醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)審批。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0011，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001。模型復(fù)制：Con 組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水（200 μL/20 g 體重），LPS 組小鼠腹腔注射LPS（20 mg/20 g 體重），Nic 組腹腔注射Niclosamide（20 mg/20 g 體重），LPS+Nic 組小鼠在給予LPS 刺激前1 h 腹腔注射Niclosamide。12 h 后麻醉處死小鼠。固定小鼠，剪開頸部皮膚使氣管暴露，使用一次性注射器吸取600 μL 生理鹽水，從氣管插入反復(fù)沖洗，收取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩４蜷_胸腔，收取左肺速凍，右肺浸泡于4%多聚甲醛，脫水、石蠟包埋后切片用于蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin staining，HE）染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.2 BCA蛋白定量檢測小鼠BALF總蛋白含量

預(yù)先配好BCA反應(yīng)液，取50 μL BALF加入100 μL BCA 反應(yīng)液，37 ℃避光孵育30 min，于562 nm 波長處讀取光密度（optical density,OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組小鼠BALF 總蛋白含量。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測小鼠肺勻漿上清液S100A4蛋白含量

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測肺勻漿上清液S100A4。將鼠S100A4 抗體（1∶500，武漢Proteintech 公司）在ELISA 包被液（NaHCO3-Na2CO3緩沖液，pH=9.6）中稀釋，以每孔50 μL 的體積加入96 孔板中，4 ℃包被過夜，包被完成后含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3 遍，加入300 μL 5%牛血清白蛋白4 ℃封閉過夜，PBST 洗滌3 遍，加入稀釋的肺勻漿上清液50 μL，4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 遍后再加入磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的兔S100A4 抗體（1∶1 000，英國Abcam公司），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3遍后加入5%牛血清白蛋白稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔IgG二抗（1∶1 000，英國Abcam公司），37 ℃孵育1 h。洗滌后加入四甲基聯(lián)苯胺顯色液（北京索萊寶科技有限公司），37 ℃顯色30 min，加入100 μL 終止液（北京索萊寶科技有限公司）立即使用Multiscan sky酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）于波長450 nm處讀取OD值。

1.4 HE染色

將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟2 次，5 min/次，再經(jīng)梯度乙醇（100%、90%、70%和50%）水化，每個梯度3 min，蒸餾水浸泡2 min。滴加適量蘇木素染色1 min，流水沖洗；滴加分化液30 s，流水沖洗；滴加伊紅染色1 min，流水沖洗；滴加反藍(lán)液10 s，流水沖洗，烘干后滴加中性樹脂封片。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

按照上述操作水化切片后，置于抗原修復(fù)液中微波加熱10 min，洗去修復(fù)液，滴加適量5%山羊血清，室溫封閉1 h，甩去血清后，滴加適量兔源一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次，5 min/次，滴加適量羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次，滴加適量二氨基聯(lián)苯胺底物液，反應(yīng)2 min 后，洗去底物。烘干后滴加中性樹脂封片于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 Western blotting 檢測Occlduin、STAT3、MAPK3蛋白相對表達(dá)量

取20 mg 小鼠肺組織，加入200 μL RIPA 裂解液，冰上超聲裂解至無明顯組織塊，冰上靜置30 min后以12 000 r/m 離心10 min，取上清液加入苯甲基磺酰氟后置于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量蛋白液與PBS、蛋白上樣緩沖液混合，100 ℃變性10 min，用于后續(xù)電泳。根據(jù)試劑盒配置聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳條件為：濃縮膠80 V，分離膠130 V；轉(zhuǎn)膜條件為0.45 μm PVDF膜，濕轉(zhuǎn)280 mA，70 min。隨后經(jīng)5% 脫脂奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h 及ECL顯影。以β-actin 和GAPDH 作為內(nèi)參蛋白檢測Occlduin、STAT3、MAPK3 蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad 8.0.2 統(tǒng)計軟件。Western blotting 檢測和免疫組織化學(xué)染色圖像采用Image J 和IHC Tool box 進(jìn)行半定量測量。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF 總蛋白含量和肺組織勻漿上清液S100A4水平比較

BCA 檢測結(jié)果顯示，各組小鼠BALF 總蛋白含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Con 組比較，LPS 組BALF 中總蛋白含量升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS + Nic 組BALF 中總蛋白含量降低（P＜0.05）。ELISA 檢測結(jié)果顯示，各組肺組織勻漿上清液S100A4 的OD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Con 組與LPS 組肺組織勻漿上清液S100A4 的OD 值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與LPS 組比較，LPS + Nic 組肺組織勻漿上清液S100A4 的OD 值下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠BALF總蛋白含量、肺組織勻漿上清液S100A4水平比較 （n=3，±s）

表1 各組小鼠BALF總蛋白含量、肺組織勻漿上清液S100A4水平比較 （n=3，±s）

注：①與Con組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05。

組別Con組LPS組Nic組LPS + Nic組F 值P 值ODS100A40 0.90±0.18 1.35±0.70 0.97±0.34 0.81±0.13②3.075 0.042 BALF 總蛋白/（mg/mL）0.53±0.19 0.81±0.41①0.42±0.06 0.49±0.11②4.776 0.007

2.2 Niclosamide緩解膿毒血癥肺損傷

HE 染色結(jié)果顯示，Con 組和Nic 組未觀察到炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無間質(zhì)水腫；LPS 組肺支氣管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)模糊；LPS +Nic 組支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)較LPS 組清晰。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變 （HE染色）

2.3 小鼠肺支氣管上皮細(xì)胞S100A4表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺S100A4 主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞而非肺泡上皮細(xì)胞。且各組肺支氣管上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Con 組比較，LPS 組肺支氣管上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS + Nic 組肺支氣管上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)下降（P＜0.05）。 見表2和圖2。

圖2 各組小鼠肺組織S100A4表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

表2 各組小鼠肺組織S100A4表達(dá)比較（n=3，±s）

表2 各組小鼠肺組織S100A4表達(dá)比較（n=3，±s）

注：①與Con組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05。

組別Con組LPS組Nic組LPS + Nic組F 值P 值ODS100A4 1.52×108±1.05×107 3.21×108±1.57×107①1.34×107±8.16×106 1.98×108±7.50×106②98.870 0.000

表3 各組小鼠肺組織Occlduin表達(dá)比較（n=3，±s）

表3 各組小鼠肺組織Occlduin表達(dá)比較（n=3，±s）

注：①與Con組比較，P＜0.05；②與LPS組比較P＜0.05。

組別Con組LPS組Nic組LPS + Nic組F 值P 值ODOccludin 值0.20±0.02 0.17±0.01①0.24±0.03 0.21±0.02②21.93 0.000

2.4 不同處理后小鼠肺組織Occludin表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，各組Occludin的OD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Con 組比較，LPS 組支氣管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin 的OD 值降低（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS + Nic 組緊密連接蛋白Occludin 的 OD 值升高（P＜0.05）。 見表 3和圖3。

圖3 各組小鼠肺組織Occludin表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

2.5 Niclosamide可能下調(diào)STAT3和MAPK3緩解肺部炎癥

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，各組Occludin、STAT3、MAKP3蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Con 組比較，LPS 組Occludin 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），STAT3 和MAKP3蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表4和圖4。

圖4 各組小鼠肺組織Occludin蛋白表達(dá)

表4 各組小鼠肺組織Occlduin、STAT3、MAPK3蛋白相對表達(dá)量比較（n=3，±s）

表4 各組小鼠肺組織Occlduin、STAT3、MAPK3蛋白相對表達(dá)量比較（n=3，±s）

注：?與Con組比較，P＜0.05。

組別Con組LPS組Nic組LPS + Nic組F 值P 值MAPK3蛋白1.00±0.36 2.15±0.70?1.10±0.28 1.55±0.21 4.515 0.039 Occludin蛋白1.00±0.21 0.56±0.15?1.06±0.06 0.91±0.22 4.908 0.030 STAT3蛋白1.00±0.36 1.62±0.29?0.81±0.12 1.19±0.23 5.051 0.030

3 討論

膿毒血癥是目前ICU 最常見的死亡原因[1]，且膿毒血癥的早期診斷和患者管理仍是ICU 面臨的巨大挑戰(zhàn)[10]。膿毒血癥發(fā)病急且機(jī)制復(fù)雜，常伴隨多器官損傷，在損傷器官中，肺是最先衰竭也是最常衰竭的器官，使得急性肺損傷成為膿毒癥患者死亡的最關(guān)鍵預(yù)后因素之一[3]，因此進(jìn)一步了解膿毒血癥相關(guān)肺損傷機(jī)制，可能為疾病診斷和患者管理提供新的方向和思路。

S100A4 屬于鈣結(jié)合蛋白S100 家族，已被證實(shí)參與腫瘤侵襲、血管生成和炎癥調(diào)節(jié)等病理生理現(xiàn)象[4]。一些研究曾使用S100A4 或S100 家族蛋白作為炎癥指標(biāo)[8，11-12]，初步說明S100A4 或S100 家族蛋白對炎癥過程具有一定意義。已有研究發(fā)現(xiàn)，S100A4 在小鼠膿毒血癥模型的多種器官中表達(dá)升高[11，13-14]，但缺乏具體的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究結(jié)果表明，抑制S100A4 表達(dá)可一定程度上緩解肺部炎癥，提示S100A4 在膿毒血癥肺損傷的潛在的調(diào)節(jié)作用。另外，研究觀察到炎癥細(xì)胞主要浸潤于支氣管周圍，Niclosamide 預(yù)處理后炎癥細(xì)胞浸潤減少，筆者推測支氣管上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)可能存在變化。為進(jìn)一步研究S100A4 在肺部炎癥中的表達(dá)模式，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)肺支氣管上皮細(xì)胞高表達(dá)S100A4，而肺泡上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)稍低。這可能解釋ELISA 結(jié)果顯示S100A4 水平輕微升高，而免疫組織化學(xué)染色半定量結(jié)果顯示肺支氣管S100A4 明顯升高。此外，已有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，S100A4 參與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15-16]，提示S100A4 可能通過調(diào)節(jié)肺支氣管上皮細(xì)胞功能影響炎癥進(jìn)展。

肺支氣管上皮細(xì)胞功能對肺組織炎癥有重要意義。肺支氣管上皮細(xì)胞通過分泌黏液阻止異物入侵，分泌蛋白酶、趨化因子、細(xì)胞因子等物質(zhì)調(diào)節(jié)炎癥過程，且依賴多種緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin、Claudin 等）維持支氣管屏障完整性，以防止組織受異物侵入和維持組織微環(huán)境[17]。緊密連接蛋白丟失可能導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和蛋白滲出。已有大量研究表明，Occludin 在肺組織炎癥中表達(dá)降低，恢復(fù)其表達(dá)水平可一定程度上緩解組織炎癥[18]。本研究結(jié)果顯示，炎癥細(xì)胞主要浸潤在支氣管周圍，且支氣管上皮細(xì)胞高表達(dá)S100A4，Niclosamide可一定程度上抑制支氣管上皮細(xì)胞S100A4 表達(dá)和緩解肺部炎癥。由此筆者推測，支氣管上皮細(xì)胞S100A4 可能參與肺支氣管上皮細(xì)胞損傷。通過免疫組織化學(xué)染色和Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)Occludin 在LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷中表達(dá)顯著降低，而Niclosamide 預(yù)處理可一定程度上恢復(fù)其表達(dá)。但2 種檢測方法均顯示單獨(dú)給予Niclosamide 似乎輕微上調(diào)Occludin 表達(dá)，提示Niclosamide 可能促進(jìn)Occludin 表達(dá)阻止炎癥細(xì)胞浸潤。但目前尚無文獻(xiàn)報道Niclosamide 對Occludin 的調(diào)控作用，是否經(jīng)S100A4 參與也仍待研究。

S100A4 抑制劑Niclosamide 可緩解膿毒血癥相關(guān)肺損傷，減輕肺部炎癥，但涉及的信號分子或通路未知。已有研究表明，Niclosamide 可通過多種信號途徑調(diào)節(jié)炎癥，如JAK/STAT3、PI3K/Akt、MAPK 或NF-κB 信號通路[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷中STAT3 和MAPK3 表達(dá)顯著上調(diào)，Niclosamide 預(yù)處理可一定程度降低STAT3 和MAPK3表達(dá)水平。提示Niclosamide 可能通過STAT3 和MAPK3 調(diào)節(jié)S100A4 表達(dá)，進(jìn)而影響炎癥發(fā)生。但Niclosamide 是否直接或經(jīng)S100A4 調(diào)控Occludin 表達(dá)，仍需深入研究。

綜上所述，本研究初步證明S100A4 抑制劑Niclosamide 可能通過STAT3 或MAPK3 信號下調(diào)S100A4 和恢復(fù)Occludin 表達(dá)，進(jìn)而抑制膿毒血癥相關(guān)肺損傷發(fā)生，但完整調(diào)控過程仍需深入研究。S100A4 在膿毒血癥相關(guān)肺損傷中可能存在一定作用，或可為臨床提供新的研究思路和方向。