鈣鈦礦量子點-分子印跡熒光探針制備及在恩諾沙星檢測的應用

摘 要： 恩諾沙星是一種喹諾酮類抗生素，長期食用恩諾沙星超標的食品會對人體健康造成危害。采用熱注入法合成鈣鈦礦量子點（PQDs），以恩諾沙星為模板分子，結合分子印跡技術，制備了基于鈣鈦礦量子點-分子印跡復合材料（Perovskite quantum dots-molecularly imprinted polymer， PQDs@MIP）熒光探針。運用透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜和氮氣吸附-脫附實驗對材料形貌、官能團和孔徑特性進行考察。探究了孵育時間、恩諾沙星濃度以及類似物對兩者熒光響應行為的影響。結果表明：恩諾沙星可顯著猝滅PQDs@MIP在514 nm處的熒光，具有較快的猝滅動力學（15 min）和較高的飽和濃度（150 mg·L?1），且恩諾沙星濃度為0.05～40.0 mg·L?1時，猝滅程度和濃度之間呈現良好的線性關系，基于此構建了恩諾沙星熒光傳感檢測方法，該方法的檢出限為0.02 mg·L?1。對三種水產品的添加回收率為93.6%～106.5%，相對標準偏差為1.9%～4.9%，證明其良好的實際應用潛力。

關鍵詞： 恩諾沙星；熒光探針；鈣鈦礦量子點；分子印跡

中圖法分類號： TS201.6 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）06-0895-07

恩諾沙星（Enrofloxacin， ENR）是第三代喹諾酮抗生素［1］，對革蘭氏陰性和某些革蘭氏陽性微生物具有良好的殺菌活性。然而，濫用和過度使用這些抗生素可能會使其通過食物鏈進入人體導致嚴重的健康問題［2，3］，如腹瀉、肝損傷、中樞神經系統(tǒng)損傷［4］以及導致細菌產生耐藥性［5］。因此，開發(fā)一種食品中恩諾沙星簡單、快速、高靈敏檢測方法至關重要。

目前，毛細管電泳、表面增強拉曼光譜、高效液相色譜等方法被用于檢測恩諾沙星［6-8］。這些方法通常需要大型儀器設備且對操作人員的技能要求相對較高等，不適合快速定量分析。熒光檢測法具有高效、高靈敏、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于有害物質的分析檢測［9］。

鈣鈦礦量子點（PQDs）光致發(fā)光量子產率高、發(fā)射光譜光譜半峰寬窄，熒光波長可調［10，11］，被視為理想的熒光信號物質［12］。然而，通常情況下，PQDs穩(wěn)定性差，對溫度、濕度、金屬離子和溶劑等環(huán)境因素敏感，限制了它在實際檢測中的應用［13］。分子印跡聚合物（MIP）具有高的熱穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性和抗干擾能力［14］，因此，用MIP包封量子點是構建高穩(wěn)定性熒光探針的有效策略，同時MIP 能解決單獨使用PQDs 時選擇性不足的問題。

本研究擬以鈣鈦礦量子點為熒光信號物質，以分子印跡聚合物為識別單元，構建了集信號識別和傳導為一體的鈣鈦礦量子點分子印跡（PQDs@MIP）熒光探針，測試了復合材料的熒光穩(wěn)定性，研究了PQDs@MIP 對恩諾沙星的熒光響應行為，探究熒光猝滅的機理，實現對恩諾沙星的定量檢測，并將該方法應用到了水產品中恩諾沙星的檢測，為食品中恩諾沙星檢測提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星（98%，上海麥克林生化科技有限公司）；碳酸銫、溴化鉛、四甲氧基硅烷、油酸（分析純，阿拉丁試劑上海有限公司）；APTES（98%，阿拉丁試劑上海有限公司）；十八烯（gt;90%，阿拉丁試劑上海有限公司）；無水乙醇、二氯甲烷（分析純，天津凱通化學試劑有限公司）。

1.2 實驗設備

LUMINA LF-1701009 熒光分光光度計、NICOLET iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo 公司）；TALOS F200S 透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；ZNCL-TS 500 智能磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；TG16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PQDs@MIP探針制備和表征

1.3.1.1 PQDs@MIP 探針合成 根據文獻報道［15］，采用熱注入法合成PQDs 并進行包硅處理。以合成的PQDs 為熒光信號物質，以分子印跡聚合物為識別單元，結合分子印跡溶膠-凝膠過程，構建復合探針，具體方法如下：將0.1 mmol恩諾沙星溶解在10.0 mL 二氯甲烷中。繼續(xù)加入10.0 mg PQDs，0.4 mmol APTES，25 ℃下攪拌30 min進行預聚合，接著加入1.6 mmol四甲氧基硅烷，在25 ℃下攪拌15 h，8 000 r/min 離心8 min收集得到聚合物。聚合物用無水乙醇洗滌5 次，60 ℃下進行真空干燥得到PQDs@MIP。按照上述步驟，不加模板分子恩諾沙星，得到非印跡聚合物PQDs@NIP。

1.3.1.2 PQDs@MIP 探針表征 運用TEM、FTIR和氮氣吸附-脫附法表征納米復合材料的形貌，官能團、比表面積及孔徑。

1.3.2 熒光穩(wěn)定性研究 將PQDs@MIP置于自然光下一周，每天測試熒光發(fā)射光譜，記錄其在514 nm 處的熒光強度，通過材料在自然光條件下一周的熒光強度變化分析其穩(wěn)定性。

1.3.3 PQDs@MIP 對恩諾沙星熒光響應行為研究

1.3.3.1 PQDs@MIP 對恩諾沙星動態(tài)和靜態(tài)熒光響應實驗 測試復合材料在加入5.0 mg·L?1恩諾沙星不同時間后的熒光光譜，計算F0/F-1（F0為PQDs@MIP 的熒光峰值，F 為PQDs@MIP 添加恩諾沙星后的熒光峰值）。以時間為橫坐標，F0/F-1 為縱坐標繪制動態(tài)響應曲線。測試其達到飽和吸附的時間。測試PQDs@MIP在不同濃度恩諾沙星溶液中的熒光光譜，以恩諾沙星濃度為橫坐標，F0/F-1為縱坐標繪制靜態(tài)響應曲線。測試其對恩諾沙星的飽和濃度。

1.3.3.2 選擇性實驗 測試PQDs@MIP 和PQDs@NIP對恩諾沙星及類似物氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星（濃度均為20 mg·L?1）的熒光響應情況，驗證PQDs@MIP對恩諾沙星的選擇性。

1.3.3.3 熒光響應機理探討 測試添加恩諾沙星前后PQDsMIP 的熒光壽命；判斷熒光響應類型，使用紫外可見分光光度計對PQDs@MIP 及恩諾沙星的吸收峰進行表征。分析猝滅機制。

1.3.4 PQDs@MIP 對恩諾沙星傳感方法建立取2.0 mg PQDs@MIP 放置于5.0 mL離心管中，分別向其中加入2.0 mL 不同濃度的恩諾沙星標準溶液。測試其熒光發(fā)射光譜，并計算F0/F-1。以恩諾沙星濃度為橫坐標，F0/F-1 為縱坐標繪制標準曲線，并根據3 倍信噪比計算得出檢出限。

熒光檢測條件為：Ex=365 nm，Em=514 nm，狹縫寬度為5 nm，光電倍增管電壓為550 V。

1.3.5 實際樣品中恩諾沙星的檢測 選取海蝦、鯧魚、鱸魚三種樣品，參考國家標準《GB31656.3-2021》對樣品進行前處理并測試樣品本底值。分別在50.0 μg·kg?1、250.0 μg·kg?1、500.0 μg·kg?1三個水平下進行添加回收實驗，經提取和凈化后，使用無水乙醇復溶，按照1.3.4 方法進行熒光檢測。

2 結果與分析

2.1 PQDs@MIP表征

由圖1（A）可知，PQDs 呈現出分布均勻、尺寸均勻的顆粒狀態(tài)。由于在合成PQDs 過程中加入了APTES，經APTES 水解后的PQDs 聚集并嵌入到SiO2材料中。由圖1（B）可知，溶膠凝膠過程為PQDs@MIP 表面包裹了一層印跡層，PQDs成功嵌入到分子印跡聚合物當中。

從圖2（A）可以看出，復合材料有著許多與PQDs 相同的特征峰，證實了PQDs 的嵌入。Si-O-Si 的伸縮振動峰位于1 056 cm?1處，這意味著APTES 及TMOS成功水解包覆硅層，1 700 cm?1顯示了N-H的拉伸振動，這主要來源于APTES。

氮氣吸附-脫附法表征的結果如圖2（B）所示，PQDs@MIP 和PQDs@NIP 顯示出相似的吸附類型。PQDs@MIP的比表面積為77.5 m2·g，明顯高于PQDs@NIP 的比表面積（21.3 m2·g）。這是因為在PQDs@MIP 合成過程中，模板分子恩諾沙星經過洗脫之后，在材料表面形成了生成孔穴。

2.2 熒光穩(wěn)定性實驗

結果如圖2（C）所示，PQDs@MIP 的熒光強度仍保持初始熒光強度的90.7%。證明復合材料的熒光穩(wěn)定性良好。這得益于在PQDs 合成的過程中使用APTES 作為封端劑，有效地鈍化PQDs 表面缺陷，并通過APTES 水解對PQDs 表面包覆硅層，提高PQDs 的穩(wěn)定性。進一步通過溶膠-凝膠法將PQDs 封裝到聚合物中，借助其優(yōu)秀的穩(wěn)定性進一步實現了對PQDs 的保護作用。

2.3 PQDs@MIP 對恩諾沙星熒光響應行為研究

2.3.1 動態(tài)熒光響應和靜態(tài)熒光響應 當恩諾沙星與PQDs@MIP 混合時，恩諾沙星進入聚合物的孔隙需要一定的時間來平衡。研究了PQDs@MIP達到飽和吸附所需要的時間。結果如圖3（A）所示，在前15 min 內，熒光猝滅程度F0/F-1 的值迅速升高并于15 min 達到最大值并保持穩(wěn)定，表明在15 min時該復合材料對恩諾沙星的吸附達到飽和，因此確定最佳孵育時間為15 min。

探究了PQDs@MIP和PQDs@NIP對恩諾沙星的飽和吸附能力。如圖3（B）所示，隨著恩諾沙星濃度的增加，熒光猝滅程度逐漸增大，到150 mg·L?1時，達到最大值并保持穩(wěn)定。表明在150 mg·L?1 時大多數特異性位點與恩諾沙星結合，達到了吸附平衡。PQDs@MIP 對恩諾沙星的最大響應濃度為150 mg·L?1。

在實驗達到吸附平衡時，PQDs@MIP 響應值均明顯大于PQDs@NIP，并且MIP的吸附能力明顯高于NIP，這一現象是因為在MIP制備過程中模板分子恩諾沙星經乙醇洗脫后，使得PQDs@MIP較PQDs@NIP有著更大比表面積和孔體積。

2.3.2 選擇性實驗 如圖3（C）所示，恩諾沙星對PQDs@MIP 的猝滅程度F0/F-1 值為0.59 大于對PQDs@NIP 的0.33，并且結構類似物中對PQDs@MIP的猝滅較強的氧氟沙星和左氧氟沙星的猝滅程度分別為0.33 和0.34 均遠小于0.59。這是因為在PQDs@MIP 的合成以及洗脫過程中，恩諾沙星作為模板分子在PQDs@MIP 的印跡層中留下了特定的印跡位點，其他結構類似物因與恩諾沙星的分子結構存在差異而不能進入印記位點，只能通過非特異性吸附產生較微弱的熒光響應。非印跡材料的制備過程中沒有恩諾沙星的加入，而沒有形成特定的孔穴結構，因此對恩諾沙星沒有特異性識別的作用。

2.3.3 熒光響應機理分析 熒光的猝滅機理包括動態(tài)猝滅效應和靜態(tài)猝滅效應［16］。由圖4（A）所示，加入恩諾沙星后，PQDs@MIP位于514 nm熒光壽命明顯降低，這證明恩諾沙星對PQDs@MIP猝滅行為是動態(tài)熒光猝滅。

考慮到本方法合成的PQDs@MIP表面有著許多氨基，能與恩諾沙星表面豐富的基團之間存在氫鍵相互作用，導致二者間的電子轉移然后發(fā)生熒光猝滅。如圖4（B）所示，恩諾沙星與PQDs@MIP的紫外吸收峰發(fā)生重疊。這滿足電子轉移的條件。因此推測電子轉移是導致PQDs@MIP熒光猝滅的主要原因。

2.4 PQDs@MIP 熒光傳感檢測恩諾沙星方法建立

將PQDs@MIP 用于恩諾沙星的檢測，如圖5（A）所示恩諾沙星可以有效猝滅PQDs@MIP位于514 nm 處的熒光強度。如圖5（B）所示，F0/F-1 和恩諾沙星濃度在0.05～40.0 mg·L?1 濃度范圍有著良好的線性關系。PQDs@MIP 的線性方程為：y=0.022 4x+0.111 8（R2=0.9954）、PQDs@NIP 的線性方程為：y=0.011 3x+0.035 7（R2=0.991 9）。該方法的LOD 為0.02 mg·L?1。并基于此建立了恩諾沙星的檢測方法。

2.5 實際樣品中恩諾沙星的檢測

選取海蝦、鯧魚、鱸魚三種實際樣品，通過添加回收實驗驗證PQDs@MIP熒光探針用于檢測水產中的恩諾沙星的可行性。結果如表1 所示，樣品添加回收率在93.6%～106.5%之間，且相對標準偏差（RSD）在1.9%～4.9%之間。說明該方法具有較高的準確性。可用于水產品中恩諾沙星的檢測。

3 討論

恩諾沙星殘留檢測對于保障食品安全至關重要。熒光檢測法因其高靈敏度、低檢測限、簡便操作和微量檢測能力備受青睞，但熒光探針存在選擇性不足的缺點，將PQDs 封裝在分子印跡聚合物網絡中，提高PQDs 了探針的穩(wěn)定性和選擇性。將本研究建立的方法與其他報道的方法進行比較（表2），本方法有著較低的檢出限和較寬的線性范圍。

4 結論

采用熱注入法制備PQDs，結合分子印跡溶膠-凝膠技術，構建了集信號識別和傳導為一體的PQDs@MIP熒光探針。對恩諾沙星的飽和吸附時間為15 min，飽和吸附量為150 mg·L?1。基于電子轉移動態(tài)猝滅機制，實現了對恩諾沙星定量熒光檢測。該檢測方法線性范圍為0.05～40.0 mg·L?1，檢出限為0.02 mg·L?1。將方法應用在了實際樣品中，對三種水產品的添加回收率為93.6%～106.5%，相對標準偏差在1.9%～4.9% 之間。為食品中恩諾沙星的快速檢測提供了新方法，進一步助推了鈣鈦礦量子點在安全檢測中的應用研究。

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