基于HPLC指紋圖譜的沙棘葉黃酮類功效成分研究△

王寧寧，高巖，張梅，溫秀鳳，盧順光，楊志剛*

1.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730030；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.水利部沙棘開發管理中心，北京 100058

沙棘為胡頹子科沙棘屬植物，近年來研究發現，其葉具有藥用價值及大健康產品開發潛力[1]。目前，沙棘葉已被批準為新資源食品[2]。沙棘葉中蛋白質類、氨基酸類、多糖類、有機酸類、黃酮類、萜類及微量元素等活性物質含量豐富[3]，尤其是具有抗炎、肝臟保護、抗氧化等活性的黃酮類功效成分含量顯著高于果實[4]。但大部分沙棘葉在收獲果實后被歸為農業廢料，未得到合理利用[5]。沙棘葉富含黃酮醇苷，主要是異鼠李素和槲皮素衍生物[6]。張小民等[7]按照食品安全性毒理學評價程序和方法，對沙棘茶葉進行了急性毒性實驗，結果表明以沙棘茶葉提取物對小鼠經口灌胃，半數致死量（LD50）>10 g·kg-1（以體質量計），屬無毒級物質，可作為安全的食品開發原料。沙棘有“天然營養庫”的美稱，其枝葉、果渣是優良的畜禽補充飼料[8-9]。以沙棘葉為原料開發的沙棘葉茶產品相關研究也較多[10]。本課題組前期研究發現，沙棘葉和沙棘葉茶中總黃酮含量豐富，主要包含以異鼠李素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷類和可水解鞣質等成分，并且具有較強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性[11]。建立沙棘葉中黃酮類功效成分高效液相色譜法（HPLC）定性、定量分析方法，對沙棘葉及沙棘葉茶等相關產品的質量評價和質量控制具有積極意義。HPLC 等色譜指紋圖譜技術在藥品、食品質量評價和質量控制領域應用廣泛[12]。本研究建立了不同產地沙棘葉HPLC 指紋圖譜，采用聚類分析和主成分分析對不同產地沙棘葉質量進行評價，并測定了其中異鼠李素、槲皮素、山柰酚3 種黃酮類功效成分含量，以期為沙棘葉質量控制及其黃酮類功效成分產品開發提供參考。

1 材料

1.1 樣品

2018 年9 月采集15 批沙棘葉樣品，經蘭州大學藥學院楊志剛教授鑒定為胡頹子科沙棘屬沙棘Hippophae rhamnoidesL.的葉，測試樣品標本保存于蘭州大學藥學院。樣品信息見表1。

表1 不同產地沙棘葉樣品信息

1.2 儀器

EasySep-3030型液相色譜儀（包括EasySep-3030型紫外檢測器、AS-2000 型自動進樣器、EasySep-3030 型二元泵，上海通微公司）；BSM220.4 型電子分析天平（上海卓精科技有限公司）；SB25-12D型超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 試藥

對照品異槲皮苷、水仙苷（純度≥98%，成都麥德生科技有限公司）；蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（純度均≥98%，成都普菲德生物技術有限公司）；表沒食子兒茶素、表兒茶素、槲皮素、異鼠李素、山柰酚、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯（純度均≥98%，上海詩丹德生物科技有限公司）；沙棘寧B、英國櫟鞣花酸、木麻黃鞣寧為本課題組從沙棘葉中提取分離得到，純度均≥98%；色譜級乙腈、甲醇（德國默克公司）；其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 指紋圖譜

供試品溶液的制備：稱取沙棘葉粉末約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～40.0 min，10%～20%A；40.1～50.0 min，20%～40%A；50.1～60.0 min，40%～80%A；60.1～73.0 min，100%～10%A）；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm。

2.2 含量測定

對照品溶液的制備：精密稱取槲皮素、山柰酚、異鼠李素對照品3.14、1.60、1.85 mg，分別加入甲醇配制成質量濃度為1.046 7、0.533 3、0.616 7 mg·mL-1的母液，之后用甲醇稀釋成梯度質量濃度的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取沙棘葉樣品粉末約0.50 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，加熱回流30 min。精密量取續濾液25 mL，置具塞比色管中，加鹽酸3.5 mL，75 °C 水浴中加熱水解1 h，加甲醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為GS-120-5-C18-AP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（58∶42）；流速為1.0 mL·min-1；柱 溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為370 nm。

3 結果

3.1 指紋圖譜

3.1.1 方法學考察

3.1.1.1 精密度試驗 樣品S1按2.1項下色譜條件連續進樣5 次，峰1 相對保留時間的RSD 為0.48%，相對峰面積的RSD為0.96%，表明儀器精密度良好。

3.1.1.2 穩定性試驗 樣品S1 在貯存0、2、4、6、12、24 h 后按2.1 項下色譜條件進行分析，峰1 相對保留時間的RSD 為0.96%，相對峰面積的RSD 為4.68%，表明樣品溶液在24 h內較穩定。

3.1.1.3 重復性試驗 樣品S1按2.1項下方法平行制備5 份，測定，峰1 相對保留時間RSD 為0.86%，相對峰面積的RSD 為0.40%，表明該方法重復性良好。

3.1.2 指紋圖譜 不同產地沙棘葉和對照品色譜圖見圖1。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件對15 批不同產地沙棘葉指紋圖譜進行相似度分析（表2），以樣品S1為參比樣品，不同產地沙棘葉相似度為0.647～0.910，13批樣品相似度均大于0.80，表明這些產地沙棘葉化學成分組成較為相似，產地因素對沙棘葉化學成分有一定影響；指紋圖譜共有26 個共有峰，以4 號峰為參比峰，以各共有峰對4 號峰的峰面積之比為相對峰面積，得到15 批樣品26 個色譜峰的標準化數據（表3）。通過和對照品tR比對共指認出9 個共有峰，其中4 號峰為英國櫟鞣花酸、13 號峰為沙棘寧B、14 號峰為木麻黃鞣寧、15 號峰為表兒茶素、17 號峰為表沒食子兒茶素、19 號峰為蘆丁、20號峰為異槲皮苷、21號峰為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、22號峰為水仙苷。

圖1 沙棘葉和對照品HPLC圖

表2 不同產地沙棘葉樣品HPLC指紋圖譜相似度

表3 沙棘葉共有峰相對峰面積

3.2 聚類分析

聚類分析將15 批不同產地沙棘葉樣品聚為3 類（圖2）。其中，產地為新疆的樣品S5、S9、S11聚為一類；除S8 外，剩余樣品聚為一類，說明這些產地的沙棘葉質量較為接近，而新疆產地的沙棘葉與其他產地的沙棘葉化學成分差異較大。

圖2 不同產地沙棘葉聚類分析

3.3 主成分分析

將26 個共有峰峰面積導入SIMCA-P 14.1 軟件，對所有樣品進行主成分分析，除樣品S8 外，沙棘葉樣品被分為2 類（圖3），新疆產地樣品S15、S11 和S9 距離其他產地的樣品較遠，說明新疆產地的沙棘葉和其他產地沙棘葉成分差異較大，這與聚類分析結果一致。

圖3 不同產地沙棘葉主成分分析

3.4 含量測定

3.4.1 方法學考察

3.4.1.1 線性關系考察 按2.2 項下色譜條件進樣分析，以混合對照品不同質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程，見表4。

表4 槲皮素、山柰酚、異鼠李素的回歸方程、線性范圍和r

3.4.1.2 精密度試驗 樣品S1按2.2項下色譜條件連續進樣6次，記錄相對保留時間和相對峰面積，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為0.93%、1.68%、1.89%，相對峰面積的RSD分別為2.60%、2.82%、3.36%，表明儀器的精密度良好。

3.4.1.3 穩定性試驗 按2.2項下條件制備樣品S1供試品溶液，在0、2、4、6、12、24 h后進行分析，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD 分別為1.21%、1.80、0.33%，相對峰面積的RSD分別為2.04%、4.13%、3.22%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

3.4.1.4 重復性試驗 將樣品S1按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，測定，槲皮素、山柰酚、異鼠李素相對保留時間的RSD分別為1.74%、1.30%、1.35%，相對峰面積的RSD 分別為1.39%、3.32%、2.03%，表明該方法的重復性較好。

3.4.1.5 加樣回收率試驗 稱取已知含量的沙棘葉粉末6份，每份約0.25 g，分別精密加入已知含量的異鼠李素、槲皮素、山柰酚對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2 項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算平均加樣回收率，結果顯示，槲皮素、山柰酚、異鼠李素的平均加樣回收率分別為106.40%、103.65%、106.37%，RSD分別為2.23%、2.21%、2.79%。

3.4.2 樣品測定 對不同產地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的含量進行測定，結果見表5。不同產地沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數分別為0.12%～0.33%、0.07%～0.32%、0.10%～0.49%。甘肅產地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數分別為0.18%～0.30%、0.13%～0.21%、0.16%～0.30%；山西產地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數分別為0.12%～0.33%、0.09%～0.17%、0.10%～0.26%；新疆產地槲皮素、山柰酚、異鼠李素的質量分數分別為0.19%～0.27%、0.10%～0.15%、0.17%～0.49%。由此可知，產地對沙棘葉中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量影響較大，新疆生長的沙棘葉中異鼠李素含量較其他產地高，可能和其生長環境、采收時間等因素相關。

表5 不同產地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數（,n=6） %

表5 不同產地沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素質量分數（,n=6） %

4 討論

本研究建立了不同產地沙棘葉的指紋圖譜，相似度及聚類分析結果表明，不同產地沙棘葉化學成分有一定差異。英國櫟鞣花酸、沙棘寧B 和木麻黃鞣寧3 種共有鞣質類成分具有較強的抗炎活性和抗肥胖活性[13]。表兒茶素、表沒食子兒茶素、水仙苷、蘆丁、異槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有體外降血糖活性[14]。對15批不同產地沙棘葉樣品中槲皮素、山柰酚、異鼠李素含量進行測定，結果表明，在不同產地樣品中這3 個黃酮類成分含量差異較大。山西忻州的樣品中槲皮素質量分數最高，為0.33%；內蒙古鄂爾多斯的山柰酚質量分數最高，為0.32%；新疆塔城樣品中異鼠李素質量分數最高，為0.49%。這可能和沙棘生長環境、采收時間等因素相關。建議將槲皮素、山柰酚和異鼠李素作為沙棘葉及其相關產品質量控制的指標成分。