水蘇糖抗衰老活性及機制研究△

陳旭，梁佳政a，李志恒，丁克林，高雅婷，柳志誠，劉永剛*，張園園*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.安徽萬花草生物科技有限公司，安徽 亳州 236000

衰老是一種常見的、自發性的生理過程，機體代謝率減慢及器官功能下降導致機體的老化[1-2]。現代醫學研究證明，隨著年齡的增長，體內會產生過多的活性氧（ROS）自由基，當ROS 含量高于正常值時，會誘導機體發生氧化應激，從而對機體造成損害，最終導致壽命的縮短[3]。目前研究表明，植物多糖大多數都具有抗衰老的功效[4]。利用植物多糖研發抗氧化功能性食品和保健食品具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）是一種以多種細菌為食的無害的真核生物，具有壽命短、易操作、易觀察、與人類基因高度同源的優點[5-7]。線蟲老齡化標志顯著，如體長明顯縮短、脂褐素濃度升高、運動能力（吞咽速率、頭部擺動頻率）減弱和神經系統退化等[8]，這些性質給實驗提供了大量的可觀測指標。因此，線蟲能夠作為一種模式生物，對藥物篩選及藥物抗衰老機制研究起到很大的作用。

本研究通過線蟲模型探究水蘇糖的抗衰老機制，以期為其在衰老及其他疾病治療方面的應用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

水蘇糖（合肥千盛生物科技有限公司，批號：221205，純度≥98%）；3%過氧化氫試劑（南京建成生物工程研究所）；1-苯氧基-2-丙醇（上海麥克林生化科技有限公司）；M9 緩沖液、NGM 培養基、LB培養基、線蟲裂解液按照常規方法配制[16]。

1.2 菌株及線蟲

菌株和線蟲均由中國科學院遺傳與發育生物學研究所惠贈；缺陷型大腸埃希菌Escherichia coliOP50；野生型線蟲株N2；線蟲株TJ356，基因型：zls356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6 (su1006)]，綠色熒光蛋白（GFP）融合衰變加速因子-16（DAF-16）蛋白；線蟲株CF1553，基因型：muls84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6 (su1006)]，GFP 融合超氧化物歧化酶-3（SOD-3）蛋白；線蟲株VC475，基因型：hsp-16.2 (gk249) V，hsp-16.2缺陷型。

1.3 儀器

Revco PLUS 型-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2FD標準型雙人單面凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司）；SPX-250 型生化培養箱（北京科偉永興儀器有限公司）；SMZ745 型體式顯微鏡、D-LH/LC 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 線蟲培養及同期化

線蟲在已接種E.coliOP50 300 μL 的培養板中，于22 ℃恒溫生化培養箱中進行培養。為防止線蟲生長時間過長，導致數量過多或者進入饑餓狀態甚至dauer 時期，2～4 d 需要進行轉板。同時為了避免細菌、螨蟲等污染，要定期對線蟲環境進行消毒。

為了確保實驗期間所有線蟲都在相同的生長時期，采用次氯酸鈉漂白法對線蟲進行同期化處理。用移液槍吸取M9 緩沖溶液1 mL 將成蟲轉移至無菌離心管中，待線蟲靜置沉降后，吸取上清液后再加入裂解液1 mL 對線蟲進行裂解，振蕩8～10 min 后，用低速離心機離心1.5 min（3000 r·min-1，離心半徑為1 cm），吸取上清液。然后用M9緩沖液沖洗2～3 遍，離心棄去上清液后，用移液槍將離心管底部線蟲吸出，滴在NGM無菌區內，放入培養箱中培養48 h左右，使線蟲生長至L4期，用作后續給藥處理。

2.2 水蘇糖抗衰老活性研究

2.2.1 體長測定 實驗分為4 組，分別為對照組和水蘇糖低、中、高劑量組（100、150、200 μmol·L-1）。將同期化后生長至L4期的N2線蟲分別轉移至對照組和水蘇糖組培養基中，在培養箱中生長1 d后，將線蟲用M9 緩沖液沖洗轉移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后，在倒置顯微鏡下觀察載玻片，用倒置顯微鏡自帶的軟件對線蟲的體長進行測量。每組不少于30條。

Seminar教學的核心環節就是匯報工作，宣講自己對于課題的研究成果、某種學術觀點的認識見解，然后師生在此基礎上展開討論，這都需要研究生具有較強的綜合表達能力。Seminar教學過程需要學生邏輯清晰地闡明學術觀點，簡明扼要、重點突出地回答師生提問，并能夠圍繞一個主題進行有理有據的辯論，科學理性地說服他人。通過上述過程，研究生可以在邏輯思維、口頭交流、PPT展示、著裝儀表等綜合能力方面得到明顯提高，有助于其完成研究生階段的中期開題和畢業答辯。

2.2.2 頭部擺動能力測定 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養箱中生長48 h 后，將線蟲放入空NGM板上。線蟲頭尾來回擺動至初始位置則為1 次。用體視顯微鏡觀察并記錄20 s 內每只線蟲的頭部擺動次數。每組線蟲不少于30條。

2.2.3 脂褐素含量測定 線蟲分組及處理同2.2.1項下，N2 線蟲在培養箱中生長5 d 后，將線蟲轉移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后，用熒光顯微鏡進行觀察，采用380 nm 激發波長、420 nm 發射波長，拍下不同組別的熒光照片。每組不少于60 條線蟲。

2.2.4 吞咽次數測定 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養箱中生長5 d 后，使用顯微鏡觀察每條線蟲咽部的活動，記錄其末端球狀物在20 s內的吞咽次數。每組至少統計30條線蟲。

2.2.5 氧化應激實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養箱中生長3 d 后，將其轉移到含有0.4% H2O2的培養皿中，并使用體式顯微鏡觀察，記錄每小時線蟲的死亡情況，直到線蟲完全死亡。每組實驗最少統計30條線蟲。

2.2.6 熱應激實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養箱中生長3 d 后，轉移至空NGM板上，置于37 ℃條件下，用顯微鏡觀察并記錄每小時線蟲死亡數量，直至線蟲全部死亡。每組不少于30條線蟲。

2.3 水蘇糖抗衰老作用機制研究

2.3.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉位實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，TJ356 線蟲給藥3 d 后，線蟲發育到成蟲階段，每組線蟲用麻醉劑（0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液）處理，待線蟲麻醉后，通過倒置熒光顯微鏡統計各組線蟲總數及處于細胞質、中間、細胞核狀態線蟲的占比。其中當線蟲體內無如圖1 所示的綠色熒光斑點狀的細胞核時可以判定其為細胞質狀態；當線蟲體內只有細胞核而無如圖1 所示的細胞質時可以判定為其為細胞核狀態；當線蟲體內既有細胞核又有細胞質時可以判定其為中間狀態。每組不少于60條。

圖1 線蟲細胞質和細胞核圈定示意圖

2.3.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達實驗 CF1553線蟲是一種GFP 標記SOD-3 蛋白的線蟲，用熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光強度，可以直觀反映出SOD-3 蛋白的表達情況[16]。線蟲分組及處理同2.2.1項下，卵期的CF1553 線蟲給藥處理3 d 后，將成年線蟲轉移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后置于熒光顯微鏡下進行觀察，拍攝圖片測定熒光強度。每組至少統計30條線蟲。

2.4 統計學處理

應用SPSS 25 軟件和單因素方差分析對結果進行定量分析，以P<0.05為差異有統計學意義。應用GraphPad Prism 6.02軟件分析生存曲線的可靠度。

3 結果與分析

3.1 水蘇糖抗衰老活性研究

3.1.1 體長測定 線蟲體長代表性圖見圖2。給藥1 d 后，對照組線蟲體長為（461.74±38.35）μm。與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1組均可使線蟲的體長增加，分別為（476.73±28.82）、（473.97±22.51）、（480.09±25.38）μm，其中高濃度組差異有統計學意義（P<0.05）。實驗結果表明，水蘇糖對線蟲的體長有一定的促進作用。

圖2 測量線蟲體長代表性圖（×40）

3.1.2 頭部擺動能力測定 對照組線蟲20 s頭部擺動次數為26.1±5.6。與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1處理可增加線蟲頭部擺動次數，分別為31.3±3.4、31.9±3.3、30.3±2.2，差異均有統計學意義（P<0.001）。

3.1.3 線蟲脂褐素含量的測定 線蟲隨著衰老會出現體內藍色熒光增加的現象。與對照組比較，水蘇糖處理后線蟲體內熒光強度降低且差異有統計學意義（P<0.01，圖3、圖4）。

圖3 水蘇糖各濃度組線蟲體內脂褐素熒光圖（×40）

圖4 水蘇糖對線蟲脂褐素的影響（,n=60）

3.1.4 吞咽次數測定 結果表明，對照組線蟲20 s內吞咽次數為46.6±6.4。與對照組比較，水蘇糖100 μmol·L-1組線蟲20 s 內抽咽次數有所增加，為46.8±5.8，水蘇糖150、200 μmol·L-1組線蟲20 s內吞咽次數有所減少，分別為44.9±5.1、44.1±5.6，但差異均無統計學意義。

3.1.5 氧化應激實驗 線蟲生存曲線如圖5 所示，與對照組比較，在氧化應激條件下，水蘇糖各濃度組線蟲生存率升高，但差異無統計學意義。

圖5 氧化應激下水蘇糖對線蟲壽命的影響

3.1.6 熱應激實驗 如圖6 所示，與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1組處理后線蟲生存曲線均明顯右移，100、150 μmol·L-1組線蟲存活時間延長40%，200 μmol·L-1濃度組存活時間延長50%，差異均有統計學意義（P<0.001）。

圖6 熱應激條件下水蘇糖對線蟲壽命的影響

3.2 水蘇糖抗衰老作用機制研究

3.2.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉位實驗 在對照組中觀察到的熒光點較少，DAF-16::GFP 的熒光細胞質定位占比為（61.20±0.04）%，中間定位的占比為（38.25±0.01）%，細胞核定位的占比為（0.55±0.01）%。用不同濃度水蘇糖處理后觀察到的熒光點明顯增多，其中在100 μmol·L-1組中，DAF-16::GFP 的熒光細胞質定位占比為（14.49±0.05）%，中間定位占比為（71.74±0.11）%，細胞核定位占比為（13.77±0.02）%；150 μmol·L-1組中DAF-16::GFP 熒光細胞質定位占比為（2.03±0）%，中間定位占比為（82.43±0.12）%，細胞核定位占比為（15.54±0.03）%；200 μmol·L-1組中DAF-16::GFP 熒光細胞質定位占比為（3.15±0）%，中間定位占比為（66.93±0.07）%，細胞核定位占比為（29.92±0.10）%。水蘇糖可明顯促進線蟲DAF-16從細胞質向細胞核遷移。

3.2.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達 各組CF1553線蟲體內GFP 熒光圖見圖7。對照組相對熒光強度為1.00±0.29，與對照組比較，給藥3 d后，水蘇糖能夠顯著提高線蟲的相對熒光強度，分別為1.27±0.41、1.28±0.45和1.26±0.39，且差異有統計學意義（P<0.01）。說明水蘇糖可以有效地激活DAF-16 的核轉錄，使SOD-3蛋白的活性顯著提升。

圖7 水蘇糖各濃度組CF1553線蟲體內GFP熒光圖（×40）

4 討論

本研究探究了水蘇糖抗衰老的活性作用和分子機制。隨著年齡的增長、線蟲衰老程度的加深，其肌肉功能不斷減退，對外界刺激越來越不敏感，因此通過測定線蟲頭部擺動頻率和應激能力可以在一定程度上了解線蟲的衰老進程。脂褐素常作為衰老的檢驗指標之一[17]。本研究對以上指標進行測定，實驗結果表明，水蘇糖能夠顯著增加線蟲頭部擺動頻率，提高線蟲熱應激能力并且降低線蟲體內脂褐素的含量。以上結果證明了水蘇糖能夠改善線蟲身體狀況，延緩線蟲的衰老進程，進而對其機制進行了探究。

線蟲的吞咽速率與線蟲的健康狀況有關，也與線蟲的衰老程度有關，本研究結果發現給藥4 d后與對照組相比，水蘇糖組線蟲吞咽速率無明顯變化。說明水蘇糖不影響線蟲對食物的攝取能力，因此水蘇糖的抗衰老機制并不依賴于熱量限制[18-19]。

胰島素/胰島素樣生長因子1 信號通路（IIS）信號通路參與調節線蟲機體的抗應激能力、衰老等一系列生理過程。當IIS 的上游活性因子受到抑制時，DAF-16轉錄因子就會被激活，從而引起核轉位，這將有助于提高機體的抗逆性，從而延長線蟲的壽命[20]，同時也可以誘導下游的抗逆因子，如SOD-3，從而達到更好的效果。因此對DAF-16 核轉位和SOD-3 結合GFP 熒光強度進行了測定，以探究水蘇糖的抗衰老能力與其中的IIS信號傳導途徑之間的關系。實驗結果表明，水蘇糖能夠激活DAF-16轉錄因子，從而促進TJ356 株線蟲的核轉位，并且可以顯著提高CF1553 線蟲熒光強度，增加SOD-3 蛋白表達量。

綜上所述，水蘇糖顯示出較強的抗衰老活性，可能是通過IIS 通道刺激DAF-16 轉錄因子，引起細胞核轉位，提高SOD-3 蛋白質表達水平，進而提升細胞對外界環境因素的抵御，從而實現延長線蟲壽命的作用。本研究對水蘇糖抗衰老的作用機制進行了初步的探索，為下一步研究DAF-16上游作用靶點提供了一定的理論基礎，同時也為含有水蘇糖的中藥，如黃精、地黃等抗衰老作用機制研究提供參考。