天山雪蓮總酚酸對脂多糖刺激的RAW264.7細胞炎癥因子釋放的影響及其機制研究△

顏麗珊，邱新宇a，康建英，顧春宇，張碩峰，張超，王亦巍，孔靜，羅贛*，張翼*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.北京遠大九和藥業有限公司，北京 102433

炎癥反應是機體免疫應答中的重要部分，可被外源性病原體相關分子模式或內源性的損傷相關分子模式激活，促進免疫細胞的募集，進而啟動高效的組織修復[1]。同時，炎癥反應參與疾病發生發展。在疾病急性發作期間，組織常駐細胞感知炎性刺激物，釋放大量細胞因子、趨化因子、自由基等炎癥介質，募集中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核巨噬細胞等到達病灶，釋放更多炎癥因子，導致免疫失衡[2]。在類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病中，巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞等的長期浸潤可導致組織損傷、纖維化甚至失去功能[3]。可見，改善炎癥反應是治療炎性疾病的關鍵策略之一。

天山雪蓮（Saussureae Involucratae Herba）是維吾爾族常用藥，具有溫腎助陽、祛風勝濕、通經活血的功效，臨床上用于治療關節炎[4]、類風濕性關節炎[5]、腱鞘炎[6]、胰腺炎[7]等疾病。現代研究顯示天山雪蓮含有黃酮、酚酸、木脂素、苯丙素類化合物等多種活性成分[8]，具有抗炎[9-10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12-13]、改善脂代謝[14]等藥理作用。《中華人民共和國藥典》2020 年版中規定蘆丁、綠原酸為天山雪蓮的質量控制成分[15]。本課題組前期研究結果表明天山雪蓮富含蘆丁的黃酮有效部位具有良好的抗炎活性[16]，而天山雪蓮富含綠原酸的總酚酸類成分抗炎作用尚不明確。因此，本研究運用脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型，在體外探討天山雪蓮總酚酸（PSI）抗炎的作用及其機制，有利于開發利用天山雪蓮資源。

1 材料

1.1 細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞株由北京中醫藥大學朱枝祥副教授惠贈。

1.2 樣品

天山雪蓮購自新疆當地市場，經北京中醫藥大學羅贛副教授鑒定為Saussurea involucrata（Kar.et Kir.）Sch.-Bip的干燥地上部分。

1.3 試藥

綠原酸對照品（批號：A22GB158496，純度≥98%）購于上海源葉生物技術科技有限公司；蘆丁對照品（批號：100080-201811，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；分析級乙醇、甲醇、甲酸、氫氧化鈉和鹽酸購于北京化工廠；Griess 試劑（批號：SLBZ0827）、LPS（批號：0000110441）、二甲基亞砜（DMSO，批號：WXBD4591V）購于美國Sigma 公司；噻唑藍（MTT，批號：0793）、牛血清白蛋白（BSA，批號：0332060311）、制膠溶液（批號分別為4680083111、4880070211、3291040121）和脫脂奶粉（批號：7861012421）購于北京蘭博利德商貿有限公司；DMEM 高糖培養基（批號：2233206）、青霉素-鏈霉素雙抗試劑（批號：2149393）、胎牛血清（FBS，批號：2233207）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：2233203）、0.25%胰蛋白酶（批號：2231188）購于以色列Biological Industries 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗猝滅封片劑（批號：D4911830）購于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批號：092120201120）購于上海碧云天生物技術有限公司；前列腺素E2（PGE2）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號：011071907B）購于英國Enzo Life Sciences公司；白細胞介素-6（IL-6，批號：219273-001）、IL-10（批號：178229001）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號：20499005）、趨化因子單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1，批號：214571002）、巨噬細胞炎癥蛋白-1α（MIP-1α，批號：221767-001）、色譜級乙腈（批號：212213）、調節激活正常T 細胞表達分泌因子（Rantes，批號：189155002）ELISA 試劑盒購于美國Thermo Fisher 公司；核蛋白提取試劑盒（批號：20211217）購于北京索萊寶科技有限公司；化學發光底物（ECL）溶液（批號：180-5001）購于上海天能科技有限公司；一抗β-肌動蛋白（βactin）、核轉錄因子（NF）-κB/p65、磷酸化（p）-NF-κB/p65、κB 抑制因子（IκB）α、p-IκBα、p-IκB激酶（IKK）α/β、TANK 結合激酶1（TBK1）、p-TBK1、c-Jun、p-c-Jun、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38、p-p38、胞外信號調節激酶（ERK）1/2、p-ERK1/2、c-jun N-末端激酶（JNK）、p-JNK抗體、Alexa 488 山羊抗兔二抗和辣根過氧化氫酶（HRP）山羊抗兔二抗均購于美國CST 公司；一抗IKKα（批號：#D0717）、特異性蛋白-1（Sp1，批號：#B1317）購于美國Santa Cruz 公司；一抗干擾素調節因子3（IRF3）抗體（批號：GR3257922-1）、山羊抗小鼠二抗（批號：GR3395730-9）購于英國Abcam公司；P-IRF3抗體（批號：04866#220）購于亞諾法生技股份有限公司。

1.4 儀器

AB-8 型大孔樹脂（南開大學化工廠）；ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard? Pre-Column（1.8 μm）均購于美國沃特世公司；FD-1D-80 型真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Milli-Q?Reference 超純水系統（美國Millipore 公司）；Heracell 150I 型二氧化碳恒溫細胞培養箱（美國Thermo Fisher 公司）；BJ-2CD 型超凈工作臺（上海博迅公司）；Spectrostar Nano 型酶標儀（德國BMG LABTECH 公司）；5810R 型臺式高速冷凍離心機（德國艾本德公司）；UltraVIEW VOX 型轉盤式激光共聚焦顯微鏡（美國PerkinElmer 公司）；SIMF140BDL 型制冰機（日本松下公司）；5200 型多道化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）；PowerPac HC型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 PSI的富集

稱取天山雪蓮70 g并粉碎，加入70%乙醇700 mL回流提取，重復3 次，每次1 h。用紗布濾過后，采用旋轉蒸發儀回收溶劑，并于60 ℃真空干燥，得到天山雪蓮乙醇提取物（17.82 g，出膏率25.46%）。AB-8 型大孔樹脂使用前用乙醇浸泡過夜，再用水洗至無醇味。依次用5%氫氧化鈉溶液和5%鹽酸浸泡5 h，然后水洗至中性，于60 ℃過夜干燥。預處理后的樹脂濕法裝柱（100 cm×3.5 cm），徑高比為1∶8，柱體積（BV）為270 mL。將天山雪蓮乙醇提取物16 g 與水50 mL混合并超聲30 min，然后注入樹脂柱中，流速為2 BV·h-1。4 BV 水洗滌后，依次用15%乙醇和40%乙醇各6 BV在室溫下洗脫，收集第4 BV的水洗脫液和15%乙醇洗脫液，在60 ℃真空干燥，得到PSI凍干粉（949.9 mg）。

2.2 天山雪蓮乙醇提取物、PSI 中綠原酸和蘆丁的含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 分別精密稱取天山雪蓮乙醇提取物0.023 9 g 及PSI 0.005 4 g，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即分別得天山雪蓮乙醇提取物供試品溶液和總酚酸供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品4.41 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為0.441 mg·mL-1的綠原酸母液。精密稱取蘆丁對照品3.26 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為0.326 mg·mL-1的蘆丁母液。精密移取綠原酸母液290 μL、蘆丁母液770 μL至同一個2 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得綠原酸質量濃度為63.945 μg·mL-1、蘆丁質量濃度為125.51 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard?Pre-Column（1.8 μm）進行乙醇提取物、總酚酸中蘆丁和綠原酸的含量測定。流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，5%～9%A；6～12 min，9%～13%A；12～19 min，13%～16%A；19～28 min，16%～17%A；28～40 min，17%～28%A），流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣體積為5 μL，檢測波長為340 nm。

2.3 細胞培養及分組

RAW264.7 細胞用含10% 血清和1% 雙抗的DMEM 完全培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待培養皿中的細胞覆蓋率達到70%～80%時進行傳代或分盤。PSI凍干粉用PBS溶解，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到PSI 母液，存儲于-20 ℃備用。將細胞分為對照組、LPS 組和PSI 不同質量濃度給藥組。

2.4 MTT法檢測細胞活性

將RAW264.7 細胞接種于96 孔板，每孔6×103個細胞，實驗組分別加入不同質量濃度（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、300.00、400.00 μg·mL-1）的PSI孵育1 h。除對照組外，各組加入LPS（終質量濃度為1 μg·mL-1）孵育24 h 后，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 溶液（終質量濃度為0.5 mg·mL-1）10 μL，在37 ℃孵育3 h。棄上清液，用100 μL/孔DMSO 溶解結晶。在酶標儀570 nm 測量每孔的吸光度。

2.5 Griess法檢測一氧化氮（NO）釋放水平

將RAW264.7 細胞接種于24 孔培養板上，每孔2.5×105個細胞，實驗組分別加入不同質量濃度PSI孵育1 h。除對照組外，每孔加入LPS（終質量濃度為1 μg·mL-1）培養24 h后收集細胞培養液，-20 ℃儲存。96 孔板每孔加入培養液100 μL，再加入Griess 試劑100 μL，在室溫孵育10 min 后，在酶標儀540 nm 測定吸光度，利用NaNO2標準曲線計算NO的生成量。

2.6 ELISA檢測炎癥因子釋放水平

按照各ELISA 試劑盒說明書進行操作。反應板經過封閉，加入對照品溶液或細胞培養液樣品孵育，洗板后加入生物素標記抗體孵育，洗板后加辣根過氧化物酶標記親和素工作液，洗板后加底物溶液，避光顯色5～15 min。每孔加入終止溶液，終止反應。在酶標儀450 nm 測定各孔吸光度，根據標準曲線折算出每孔光密度對應的炎癥因子濃度。

2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測蛋白表達水平

將RAW264.7細胞接種于60 mm培養皿中，實驗組分別加入不同質量濃度的PSI，孵育1 h。除對照組外，各組加入LPS 刺激30 min 后，收集細胞。加入RIPA 裂解液，冰浴裂解，在12 000 r·min-1離 心10 min（離心半徑為9.5 cm），上清液為細胞總蛋白；或按照核蛋白提取試劑盒說明書操作，分離提取細胞漿蛋白與核蛋白。Bradford 法測定蛋白濃度，98 ℃變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠電泳、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜電轉，5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育1 h，加入相應的一抗，4 °C 孵育過夜后，洗滌3 次，二抗孵育1 h，洗滌3 次。條帶于ECL 顯色液中孵育，使用多道化學發光成像系統曝光顯影并拍照。條帶圖像用ImageJ 1.52r 軟件進行灰度分析，并除以內參蛋白β-actin或Sp1灰度值，得到待測蛋白的相對表達水平。

2.8 免疫熒光檢測蛋白定位

將RAW264.7 細胞種于4 孔腔室載玻片中，每孔1×104個細胞，實驗組分別加入不同質量濃度PSI，孵育1 h。除對照組外，各組加入LPS 刺激30 min后，進行固定透膜，2% BSA 溶液封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜。洗滌3 次，用Alexa Fluor488 標記的二抗室溫避光孵育1 h。使用DAPI 抗猝滅封片劑染色封片之后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析和作圖，實驗數據采用（）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett后續多重比較檢驗組間差異，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 基于超高效液相色譜法（UPLC）的PSI 中綠原酸與蘆丁的含量測定

采用UPLC 對天山雪蓮乙醇提取物、PSI 中的綠原酸和蘆丁含量進行測定[16]。如圖1所示，天山雪蓮乙醇提取物含有綠原酸和蘆丁，質量分數分別為1.99%和2.67%。PSI中綠原酸質量分數為23.60%，相較乙醇提取物，綠原酸含量大幅度提升，但未檢測到蘆丁，說明大孔吸附樹脂可以有效富集天山雪蓮中的酚酸類成分。

圖1 天山雪蓮乙醇提取物、PSI中綠原酸和蘆丁的UPLC圖

3.2 PSI 對LPS 刺激的RAW264.7 細胞炎癥因子釋放的影響

如圖2A所示，PSI質量濃度為6.25～400 μg·mL-1時對RAW264.7 細胞活力無顯著影響，故選用12.50、25.00、50.00、100.00 μg·mL-1作為PSI 給藥質量濃度。在LPS刺激下，RAW264.7細胞釋放的NO 水平顯著升高（P<0.01），PSI 質量濃度為12.5～100 μg·mL-1時能顯著降低細胞培養基中的NO 含量（P<0.05，P<0.01）。PSI 同時能劑量依賴性地抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞釋放PGE2（圖2B）。LPS 能促進RAW264.7 細胞細胞因子（TNF-α、IL-10 和IL-6）和趨化因子（MCP-1、MIP-1α和Rantes）的產生，PSI 能顯著抑制上述細胞因子和趨化因子生成（圖2C）。結果表明，PSI 能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子的釋放。

3.3 PSI 對Toll 樣受體4（TLR4）信號通路關鍵蛋白表達的影響

TLR4在包括巨噬細胞在內的大多數細胞表面表達，能夠識別LPS，介導其所引起的一系列信號級聯反應，促進下游轉錄因子的活化，進而釋放出大量的炎癥因子，促進炎癥反應的發生發展[17]。進一步采用Western-blot 法檢測PSI 對TLR4 信號通路關鍵蛋白的影響。如圖3 所示，LPS 刺激后，RAW264.7 細 胞 IκBα、IKKα/β、p65、TBK1、ERK1/2、JNK、p38、及c-Jun的磷酸化水平明顯提高（P<0.05，P<0.01），PSI 質量濃度為50、100 μg·mL-1時能劑量依賴性地降低除JNK 以外上述蛋白的磷酸化表達水平。此外，在LPS 刺激下，RAW264.7 細胞IRF3 磷酸化水平與對照組相比升高，但差異無統計學意義，而PSI 能顯著降低IRF3的磷酸化（P<0.05，P<0.01）。上述結果說明PSI能抑制LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4信號通路的激活。

圖3 PSI對LPS刺激的RAW264.7細胞TLR4信號通路關鍵蛋白表達的影響

3.4 PSI對p65、IRF3和c-Jun入核的影響

在LPS的刺激下，TLR4信號通路下游轉錄因子p65、IRF3 和c-Jun 能從胞漿轉位至細胞核中，與DNA 結合，從而促進炎癥因子的表達[18]，因此，分別采用Western blot 和免疫熒光技術檢測p65、IRF3和c-Jun 在RAW264.7 細胞中核轉位情況。如圖4A～4C 示，LPS 刺激后，p65、IRF3 和c-Jun 在細胞質分布減少，核內分布增多。而PSI 質量濃度為50.00、100.00 μg·mL-1時能夠劑量依賴性地抑制p65、IRF3和c-Jun 的入核。此外，如圖4D、圖4E 所示，發現LPS 顯著促進p65、IRF3 和c-Jun 在細胞核內的表達水平（P<0.01），而PSI劑量依賴性地降低其在核內的表達（P<0.05，P<0.01）。PSI 對p65 和c-Jun 在胞漿中的表達水平無顯著影響。上述結果提示PSI能夠抑制LPS 刺激下NF-κB、IRF3 和c-Jun 的入核，從而下調相關炎癥因子的釋放。

圖4 PSI對LPS刺激的RAW264.7細胞p65、IRF3和c-Jun核轉位的影響

4 討論

本研究采用大孔樹脂富集天山雪蓮的總酚酸成分，通過UPLC檢測發現PSI富含綠原酸，而不含蘆丁。綠原酸等酚酸類化合物是植物次生代謝產物，被認為是第七類營養素[19]，具有抗氧化等多種藥理活性。綠原酸廣泛分布于藥用植物中，近年來多項研究表明，綠原酸具有抗炎、調節免疫和改善代謝等作用[20]，是天山雪蓮發揮抗炎作用的主要有效成分之一。后續實驗將測定PSI 中其他酚酸類成分，并檢測其抗炎作用及相關機制，進一步明確其抗炎作用的物質基礎，為開發天山雪蓮的酚酸類有效成分作為抗炎藥物提供藥理學依據。

巨噬細胞是體內重要的免疫防御細胞，參與清除機體內微生物病原體和組織碎片，募集中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等其他免疫細胞進入炎性組織，共同協助恢復機體免疫平衡。在病理狀態下，過度活化的巨噬細胞能夠放大炎癥反應，引起組織損傷[21]，在肺炎、關節炎[22]、胰腺炎[23]等炎性疾病的發生和發展中起到了重要的作用。在本研究中，筆者采用經典的LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型，來探討PSI 的抗炎作用及作用機制。研究結果表明PSI能有效的抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子的過度釋放，提示PSI 能夠改善LPS 誘導的炎癥反應。因此，結果表明總酚酸類成分是天山雪蓮發揮抗炎作用、防治炎性疾病的潛在有效部位之一。

TLR4是免疫應答重要的一員，也是各種急慢性疾病的藥物靶點[24-26]。TLR4 含有24 個重復的富含亮氨酸序列，以便促進蛋白與蛋白的相互結合，通過此結構來識別病原體及其產物[27]。激活巨噬細胞中的TLR4 信號能夠募集細胞內多種接頭蛋白，從而磷酸化激活下游的IKKα/β復合物，后者促進IκBα磷酸化，引起其泛素化降解，釋放NF-κB/p65，使得游離在胞漿中的NF-κB/p65 磷酸化活化，從而進入細胞核中，與DNA 結合，促進炎癥因子的基因轉錄[28]。本研究發現，PSI 能顯著抑制IKKα/β、IκBα和p65 的磷酸化，并降低p65 的入核，提示PSI 可能通過TLR4/p65 信號通路從而抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥因子的釋放。同時，TLR4 信號活化激酶TBK1，使IRF3 磷酸化二聚化并移位到核內，啟動趨化因子、Ⅰ型干擾素基因的表達[29]。此外，TLR4信號還可以激活包括ERK1/2、p38和JNK在內MAPKs 蛋白激酶，最終導致激活子蛋白1（AP-1）亞基如c-Fos、c-Jun 等的激活和入核，與DNA 應答元件結合，啟動炎癥因子相關基因的轉錄，促進炎癥因子的合成及釋放[30]。本研究結果顯示，PSI 能降低LPS 誘導的TBK1、IRF3、MAPKs和c-Jun 的磷酸化活化，并抑制IRF3 和c-Jun 的入核，表明PSI 也能通過TLR4/IRF3 和TLR4/c-Jun 信號通路抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥因子的產生。

綜上所述，本研究在體外水平研究了PSI對LPS誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型炎癥因子釋放的影響，揭示了PSI 對TLR4 信號通路的抑制作用可能是其發揮抗炎作用的重要機制。本研究為天山雪蓮及其相關制劑防治炎癥性疾病的臨床應用提供藥理學依據，本課題組后續將在動物水平進一步驗證PSI治療炎性疾病的藥效，并驗證其作用機制。