正源方抗肝纖維化的網絡藥理學預測分析及實驗驗證△

龐夏云，任美，蘇潔，周瑞*，劉妍如，宋忠興，唐志書，2*

1.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心 陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083；2.中國中醫科學院，北京 100700

肝纖維化是存在于病毒性肝炎、酒精性肝炎等各種慢性肝臟疾病發展中的過程中，同時也是發展為肝硬化甚至肝癌的必經環節[1]。研究表明，肝臟慢性損傷后，處于靜息狀態的肝星狀細胞活化為肌成纖維細胞，導致細胞外基質（ECM）過度積累形成肝纖維化[2-3]。肝纖維化為多數慢性肝病的共有病理特征，研發治療肝纖維化的藥物具有重要的意義。臨床上治療肝纖維化的藥物有免疫抑制劑、糖皮質激素和非特異性抗炎藥等，但此類藥物不良反應明顯，不宜長期服用[4]；傳統中醫藥治療疾病具有多層次、多靶點、多途徑、不良反應較小等特點，在肝纖維化防治方面具有獨特優勢[5]。

正源方是臨床經驗方，由西洋參、當歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓組成，臨床上已應用多年，具有扶正解毒、生血止血、益氣養陰等功效。本課題組前期完成了正源方提取工藝的研究及高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的建立[6]，同時證實了正源方可以改善過氧化氫（H2O2）誘導的血管內皮細胞損傷，緩解放化療引起的白細胞減少及相關的氣血虧虛證[7-9]。中醫認為濕熱瘀毒和肝郁氣滯是肝纖維化的病因病機，治療肝纖維化需以肝論治，遵循“方從法立，以法統方”的基本原則[10]。基于正源方扶正解毒、生血止血、益氣養陰的功效，推測其可能通過促進肝細胞增殖和改善肝的氧化損傷，調暢氣機、化瘀通絡，多方面發揮養肝護肝的作用。本研究探討正源方是否具有抗肝纖維化的作用，采用網絡藥理學和分子對接方法預測正源方抗肝纖維化的有效成分、作用靶點和相關通路，并利用細胞實驗進行驗證，探究正源方抗肝纖維化的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 細胞

人肝星狀細胞LX2 購于上海冠導生物工程有限公司。

1.2 試藥

西洋參（批號：20200701，產地：吉林）、南沙參（批號：20210301，產地：江蘇）、桔梗（批號：20210501，產地：陜西）、重樓（批號：20210102，產地：云南）、仙鶴草（批號：20200501，產地：陜西）、當歸（批號：20201201，產地：甘肅）均購于陜西興盛德藥業有限責任公司，經陜西中醫藥大學劉世軍教授鑒定，分別為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根、桔梗科植物沙參Adenophora strictaMiq.的干燥根、桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根、百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.的干燥根莖、薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosaLedeb.的干燥地上部分、傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。青霉素和鏈霉素（批號：J1600077，美國Hyclone 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：02B09A21）、胎牛血清（FBS，批號：2001003）、胰蛋白酶（批號：0055019）、DMEM 高糖培養基（批號：2030099）均購于以色列Biological Industries 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號：D-5879，美國Sigma 公司）；重組人轉化生長因子-β1（TGF-β1，批號：rcyc-htgfb1，美國InvivoGen 公司）；噻唑藍（MTT，批號：C0009S）、RIPA 裂解液（批號：P0013B）、蛋白酶磷酸酶抑制劑（批號：P1046）均購于上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號：PA115-01，天根生化科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號：TA-09）、PI3K（批號：60225-1-Ig）、兔二抗（批號：20000258）、鼠二抗（批號：20000144）均購于武漢三鷹生物技術有限公司；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K，批號：AF3241，江蘇親科生物研究中心有限公司）；蛋白激酶B（Akt，批號：4691S）、磷酸化Akt（p-Akt，批號：4060S）均購于美國Cell Signaling Technology；ECL 化學發光底物（批號：180-5001，上海天能科技有限公司）。

1.3 儀器

CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；LD5-2A 型低速離心機（北京雷博爾有限公司）；IX73 型倒置顯微鏡（奧林巴斯顯微光學技術公司）；Multiskan GO 型全波長酶標儀、I50i/240i型CO2細胞培養箱、Micro17R 型微量冷凍離心機均購于賽默飛世爾科技公司；164-5050 型電泳分析儀、ChemiDocXRS+型蛋白免疫印跡法（WB）曝光儀均購于美國Bio-Rad有限公司。

2 方法

2.1 網絡藥理學

2.1.1 正源方活性成分及作用靶點篩選 運用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（https://tcmsp-e.com/），以類藥性（DL）≥0.18 和口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，檢索正源方中當歸、仙鶴草、西洋參、桔梗、南沙參、重樓的活性成分，并查閱文獻進行補充[11]。利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）和Similarity Ensemble Approach（http://sea.bkslab.org/）數據庫搜索Canonical SMILES 號，并通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）對所收集的靶點進行規范化處理。

2.1.2 肝纖維化疾病靶點獲取 以“hepatic fibrosis”和“liver fibrosis”為關鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）數據庫中搜集肝纖維化疾病靶點，整合篩選得到肝纖維化疾病靶點，并運用UniProt數據庫對肝纖維化疾病靶點進行校正。

2.1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建利 用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺獲得藥正源方與肝纖維化共有靶點，導入String 數據庫（https://String-db.org/）進行分析，導出與靶點信息相關的.tsv 文件，構建網絡數據文件，將network 文件導入Cytoscape 3.9.1，使用插件CytoNCA 計算節點的連接度（degree）、介度（betweenness）和緊密度（closeness），篩選出大于二倍中位數值的靶點，構建PPI 網絡并對其進行拓撲分析。

2.1.4 基因本體（GO）生物學和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析 利用String 數據庫中對關鍵靶點進行GO 生物學分析和KEGG 代謝通路富集分析，并通過在線作圖平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO生物學功能氣泡圖（按P值從小到大排序的前5個條目）和KEGG 代謝通路富集分析氣泡圖（按P值從小到大排序的前20條通路）。

2.1.5 藥物-成分-靶點-通路網格的構建 將KEGG代謝通路結果與藥物、成分及靶點導入Cytoscape 3.9.1 軟件中，構建正源方抗肝纖維化的藥物-成分-靶點-通路網絡。

2.1.6 分子對接 選取藥物-成分-靶點-通路網絡中較高度值的4 個活性成分木犀草素、槲皮素、熊果酸、擬人參皂苷RT5，6 個關鍵靶點信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）、成纖維細胞生長因子2（FGF2）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（Akt1）、Jun 原癌基因（JUN）、血管內皮生長因子A（VEGFA）和白細胞介素-2（IL-2），在PubChem 中獲取成分的3D 結構，保存為.sdf格式。并在UniProt數據庫或PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）獲取靶點的3D 結構，保存為.mol2 格式。將成分和靶點導入UCSF Chimera 1.16 進行分子對接，利用AutoDock Vina 插件驗證成分與靶點的結合能，將結合能較高位點可視化處理。

2.2 細胞實驗驗證

2.2.1 正源方樣品處理 精密稱取正源方粉末80 mg 于5 mL 離心管中，加入基礎培養基高糖DMEM 4 mL溶解，用0.22 μm的濾膜濾過，制成質量濃度為20 mg·mL-1的母液，并稀釋至合適的質量濃度備用。

2.2.2 細胞培養 將LX2 細胞置于含有10% FBS和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI 1640培養基中培養，待細胞相對密度至80%～90%時，進行傳代，3代后進行后續實驗。

2.2.3 細胞毒性實驗 將LX2 細胞以5×104個/mL密度培養于96 孔板，將其放入培養箱中過夜培養，接著加入20、50、100、200、500 μg·mL-1的正源方培養24 h，將0.5 mg·mL-1MTT 加入到96 孔板中，在培養箱培養4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL，10 min 后，在酶標儀檢測490 nm 處各樣本吸光度（A），通過檢測不同質量濃度正源方的細胞毒性，進一步選擇正源方最適的質量濃度進行后續實驗。

2.2.4 細胞分組 將LX2細胞分為對照組，模型組（TGF-β110 ng·mL-1），正源方低、中、高質量濃度組（20、50、100 μg·mL-1）。

2.2.5 MTT 檢測正源方對TGF-β1誘導的LX2 細胞活力的影響 將LX2 細胞按照5×104個/mL 密度培養于96 孔板，將其放入培養箱中過夜培養，隨后加入用完全培養基配制的10 ng·mL-1TGF-β1活化24 h，再分別加入不同質量濃度正源方培養24 h 后，加入MTT，4 h 后棄上清液，加入DMSO 150 μL，酶標儀檢測490 nm處各樣本A。

2.2.6 WB 分析檢測相關蛋白表達 利用WB 檢測細胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達。收集6孔板中細胞，加入RIPA 裂解混合液（RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑）適量進行細胞裂解提取總蛋白，使用BCA 試劑盒進行蛋白定量。5%的濃縮膠和10%的分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，一抗稀釋比例按照說明書進行稀釋，4 ℃過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜，曝光，置凝膠成像系統顯影。利用Image J 1.53k 軟件檢測蛋白條帶，以GAPDH 作為蛋白載量對照，平行實驗3次。

2.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 9.0 軟件對數據進行統計分析。數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 正源方活性成分及其靶點的篩選

通過TCMSP數據庫檢索及結合文獻查詢的相關結果[12-13]，收集得到正源方中西洋參、當歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓6 味藥物的活性成分145個，活性成分靶點1109個，活性成分其中30個來自當歸、34個來自西洋參、24個來自南沙參、26個來自桔梗、22 個來自仙鶴草、9 個來自重樓，部分活性成分基本信息見表1。

表1 正源方各藥味部分活性成分

3.2 肝纖維化疾病靶點的篩選

通過OMIM 及GeneCards 疾病數據庫進行檢索，篩選得到1573個肝纖維化相關靶點。

3.3 核心靶點篩選及PPI的構建

將正源方及肝纖維化靶點導入Venny 2.1.0進行處理，得到共同靶點415 個。將共同靶點導入Cytoscape 3.9.1，使用插件CytoNCA 計算各靶點的度中心性（degree centrality）、介數中心性（betweenness centrality）及接近中心性（closeness centrality），通過設定度中心性>89、接近中心性>0.553、介數中心性>0.002 441 51，篩選得到的61個關鍵靶點，見圖1。將其導入STRING數據庫，物種為“智人（Homo sapiens）”，Clusters選擇“kmeans clustering”選項，設置3 個聚類集群，獲取PPI 圖，見圖2。網絡中61 個節點、1538 條邊，平均度值50.4，可見節點大小與其度值呈正相關，PPI 富集P<0.01。通過網格分析，可得出核心靶點有Akt1、VEGFA、腫瘤壞死因子（TNF）、細胞外信號調節激酶3（MAPK3）、IL-1β、信號傳導和STAT3、表皮細胞生長因子（EGF）、腫瘤蛋白P53（TP53）等。

圖1 正源方作用于肝纖維化關鍵靶點

圖2 正源方抗纖維化靶點的PPI網絡

3.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

采用STRING 數據庫對篩選的61 個靶點進行GO 生物學功能富集分析，得到GO 條目共1753 個（P<0.05），其中生物過程（BP）條目1595 個，細胞成分（CC）條目53 個，分子功能（MF）條目105 個，分別占比91%、3%、6%。分別對3 個類別GO 分析中P值較小的前5 個條目以氣泡圖形式展現，見圖3。由GO 分析結果可知，正源方抗肝纖維化關鍵靶點中CC 主要分布在膜筏（membrane raft）、小窩（caveola）、囊泡腔（vesicle lumen）及細胞外間隙（extracellular space）等部位，MF 主要涉及信號受體結合（signaling receptor binding）、蛋白質結合（protein binding）及酶結合（enzyme binding）等，BP 主要有細胞死亡的調節（regulation of cell death）和細胞群增殖的調節（regulation of cell population proliferation）等。

圖3 正源方抗纖維化靶點GO富集分析

對61 個靶點進行KEGG 代謝通路富集分析后得到174條信號通路（P<0.05），其中主要涉及癌癥信號通路（hsa05200）、乙型肝炎（hsa05161）、HIF-1信號通路（hsa04066）、PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、TNF 信號通路（hsa04668）等相關通路，由富集結果可知，這些通路可能為正源方抗肝纖維化的關鍵通路，前20 條相關KEGG 代謝通路的氣泡富集可視化結果，見圖4。

圖4 正源方抗纖維化靶點KEGG通路富集分析

3.5 藥物-成分-靶點-通路網絡構建

借助Cytoscape 3.9.1 軟件構建藥物-成分-靶點-通路網絡，見圖5。拓撲網絡中的度值表示節點間連接數，度值越高，則表示節點在網絡中重要性越大[14]。從圖5中可知，西洋參、仙鶴草度值最高，說明方中西洋參、仙鶴草可能為本方抗肝纖維化的主藥。導出數據后對度值進行分析，得出度值靠前靶點 有STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA 和IL-2等，說明正源方可能通過這些作用靶點調控肝纖維化；此外度值靠前的藥物成分有木犀草素、槲皮素、熊果酸、擬人參皂苷RT5等，提示正源方可能通過這些成分作用于STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA 和IL-2 等靶點；PI3K-Akt、TNF 等信號通路在通路中度值靠前，說明PI3K-Akt、TNF 等信號通路在正源方調控肝纖維化過程中發揮重要作用。

圖5 正源方抗纖維化靶點藥物-成分-靶點-通路網絡

3.6 分子對接

對藥物-成分-靶點-通路網格中所篩選出的活性成分和關鍵蛋白靶點進行分子對接，獲得主要活性成分與關鍵蛋白靶點結合能，見表2，將分子對接結果進行可視化處理，見圖6。當結合能<-5.0 kcal·mol-1（1 cal≈4.186 J）時，主要活性成分與關鍵蛋白靶點具有較強的結合能力；當結合能≤-7.0 kcal·mol-1時，主要活性成分與關鍵蛋白靶點具有很強的結合能力，結合能越低，主要活性成分與關鍵靶點的結合能力越強[15]。分析圖表可知，木犀草素、槲皮素、擬人參皂苷RT5、熊果酸和木犀草素與STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA和IL-2均有較強的結合能力，初步驗證了正源方具有潛在治療肝纖維化的作用。

圖6 正源方抗纖維化靶點關鍵成分對關鍵靶點分子對接可視化分析

表2 正源方抗纖維化靶點主要活性成分與關鍵蛋白靶點結合能 kcal·mol-1

3.7 正源方對LX2細胞活力的影響

不同濃度的正源方對LX2 細胞活力的影響，見圖7A。當正源方質量濃度為20～100 μg·mL-1時，無明顯細胞毒性；當正源方質量濃度超過200 μg·mL-1時，細胞活力降低，具有顯著差異（P<0.05，P<0.001）。根據實驗結果選擇正源方質量濃度為20、50、100 μg·mL-1進行后續實驗。

圖7 正源方對TGF-β1活化的LX2細胞活力影響（,n=3）

3.8 正源方對TGF-β1活化的LX2細胞活力的影響

如圖7B 所示，10 ng·mL-1TGF-β1活化LX-2 后細胞活力明顯上升（P<0.001），不同質量濃度的正源方顯著抑制TGF-β1激活的LX2 細胞活力，且具有差異具有統計學意義（P<0.001）。此結果表明正源方可抑制TGF-β1激活的LX2細胞活力。

3.9 正源方對p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著升高（P<0.001）。與模型組相比，不同劑量的正源方給藥后，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 顯著降低（P<0.01，P<0.001），具有質量濃度依賴性（圖8）。表明正源方可能通過抑制PI3K-Akt 信號通路降低活化的LX2細胞活力，發揮治療肝纖維化的作用。

圖8 正源方對p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達的影響（,n=3）

4 討論

肝纖維化是各種致病因子（病毒、乙醇、自身免疫等）作用肝臟細胞，造成細胞外基質合成與降解失衡的病理過程，在損傷因素持久刺激下，有可能進一步進展成肝硬化，甚至引發多種嚴重并發癥，包括靜脈曲張出血、腹水、肝性腦病甚至死亡[16-17]。因此，尋找有效延緩或逆轉肝纖維化的治療策略是重大的臨床需求，研究表明中藥可通過減少細胞外基質的生成與沉積，抑制肝星狀細胞的活化等方面發揮抗肝纖維化作用，涉及PI3K-Akt 信號通路，Janus 激酶2（JAK2）-STAT3 的調控等[18-19]。正源方是由西洋參、當歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓組成的臨床經驗方，方中西洋參、當歸、南沙參的多糖類化合物可保護肝臟[20-22]，仙鶴草、重樓、桔梗抗炎和抗氧化功效顯著，且仙鶴草不同部位提取物具有抗肝纖維化作用[23-25]，全方共奏益氣養陰、清熱祛濕、解毒活血之功，緩解肝積癥狀。因此，推測正源方在抗肝纖維化方面有較大潛力。

通過網絡藥理學方法篩選出正源方的活性成分作用靶點1109個，肝纖維化疾病靶點1573個，取得正源方活性成分作用靶點和肝纖維化疾病靶點共同靶點415 個，同時篩選出正源方中的多種有效成分如槲皮素、木犀草素、熊果酸和擬人參皂苷RT5等。大量研究表明，槲皮素具有多種藥理作用，可用于治療肝腎疾病、減緩肝纖維化的發展、抑制肝星狀細胞增殖[26-27]；木犀草素可抑制肝細胞的上皮間質轉化、抑制肝星狀細胞活化[28]；熊果酸可能通過調控煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）/ROS/Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）活化，減少促炎因子IL-1β的釋放，保護肝細胞以減少肝內膠原沉積[29]。綜上所述，上述成分可能是正源方抗肝纖維化的主要活性成分。此外，通過PPI 蛋白互作網絡分析，篩選核心靶點包括Akt1、IL-1B、TNF等，說明正源方可能通過以上核心靶點對肝纖維化發揮直接或者間接的治療作用。其中Akt1是PI3K-Akt通路中的重要靶點，且Akt1和Akt2異構體在調節與酒精性肝病相關的炎癥和纖維化的發展中都能發揮作用[30-31]。PI3K-Akt 信號通路被激活后，Akt 可發生轉移并且與底物結合后可發揮作用，Akt 磷酸化活化后可影響靶蛋白活性，調節下游通路，促進IL-1β、TNF-α炎癥因子的表達，誘發并加劇炎癥反應，進一步導致肝內膠原過度分泌，加重肝纖維化病理進程[32]。

KEGG和GO富集分析結果提示，正源方抗肝纖維化與多個靶點和多條生物途徑有關，其中顯示HIF-1 和PI3K-Akt 信號通路起著重要作用。文獻報道HIF-1 信號通路主要是缺氧癌細胞發生代謝重編程的關鍵調節劑，HIF-1通過減少氧氣消耗來抑制線粒體氧化代謝，確保缺氧時的氧穩態[33]，在TGF-β1活化的LX2 細胞中，HIF-1 信號通路報道較少。研究發現PI3K-Akt 信號通路是肝星狀細胞活化與增殖導致肝纖維化發生的主要信號通路，可以調控細胞的增殖、凋亡、代謝等多個環節，并在乙肝病毒基因的轉錄中發揮作用[34-35]。本課題組前期研究發現，正源方可能通過抑制PI3K-Akt 信號通路的激活，提高H2O2誘導的人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）的活力，并抑制其細胞凋亡[9]，證實了正源方發揮血管內皮的保護作用與PI3K-Akt 信號通路有關，并且有文獻指出PI3K-Akt信號通路在TGF-β1誘導的LX2 細胞活化中發揮著重要的調節作用[36-38]。因此，本研究驗證了正源方對PI3K-Akt信號通路的調控作用。

肝星狀細胞在肝纖維化的形成中起著核心作用，在正常情況下肝星狀細胞為靜止狀態，當出現炎癥或機械刺激損傷時，靜止的肝星狀細胞被激活轉化為肌成纖維細胞，并進一步分泌細胞外基質，影響肝臟實質細胞的重建，最終形成瘢痕組織，進而演變為肝纖維化[39]。TGF-β1是肝星狀細胞的一種有效的促纖維化細胞因子，能誘導肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞[40]。在網絡藥理學預測分析基礎上，本研究構建TGF-β1誘導的LX2 細胞活化模型，進行細胞水平實驗驗證，結果顯示正源方可顯著抑制TGFβ1激活的LX2 細胞活力，并降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平，說明正源方抗肝纖維化作用機制與抑制PI3K-Akt 信號通路的激活，影響肝星狀細胞的活化有關，具體表現為下調p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平，抑制活化后的LX2 細胞活力。然而，本研究僅采用正源方提取物在細胞水平進行實驗驗證，具有一定的局限性，本課題組后續將進一步分析正源方的入血成分，并進行正源方動物水平抗肝纖維化的作用研究。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法建立正源方抗肝纖維化的藥物-成分-靶點-通路網絡，接著運用分子對接技術對部分作用靶點進行初步驗證，最后采用體外細胞實驗對PI3K-Akt 信號通路進行驗證。結果發現，正源方抗肝纖維化機制可能與抑制肝星狀細胞活化，調控PI3K-Akt信號通路有關。