健胃消食口服液的免疫調節作用及網絡藥理學機制研究△

張艷，趙海譽，侯紅平，王琳娜，姜珊，周嚴嚴，司南，王宏潔，王坤，王麗芳，倪理琪*，魏曉露*

1.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；2.濟川藥業集團有限公司，江蘇 泰興 225441

健胃消食口服液由太子參、陳皮、山藥、炒麥芽及山楂5 味中藥組成，主要用于脾胃虛弱所致的食積，臨床見多種原因引起的消化不良、小兒厭食癥、胃炎等，是國內目前治療消化不良的常用藥物[1]。目前對健胃消食口服液的研究主要集中在質量標準[2-3]，以及單獨或聯合用藥治療小兒脾胃氣虛證引發的厭食、兒童或老年人功能性消化不良、慢性胃炎的臨床效果觀察研究方面[4-9]。本方中太子參、山藥、山楂、陳皮和炒麥芽均具有健脾益氣的功效。脾虛證的主要特點是脾胃機能不足、升降出入功能失衡，臨床表現有消化系統、免疫系統等功能的減退。已有研究報道，與健胃消食口服液相同成分的健胃消食片具有抗應激、提高免疫功能和助消化作用，可增強胃動力、改善胃分泌功能、提高胃蛋白酶活性、提高免疫力等[10-11]。但是健胃消食口服液相關的治療機制鮮有報道。本研究制備免疫抑制小鼠模型，探討健胃消食口服液對免疫功能的調節作用，同時結合網絡藥理學方法探討健胃消食口服液健胃消食的作用機制，以期為健胃消食口服液的臨床應用和后續研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

無特定病原體（SPF）級雄性BALB/c 小鼠，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0006，飼養于中國中醫科學院中藥研究所實驗動物中心，室溫保持21～25 ℃，相對濕度45%～55%，自然晝夜節律光照，自由飲水進食。本實驗操作過程嚴格遵守實驗動物倫理標準，SPF 級動物實驗倫理審查表編號：2022B073。

1.2 試藥

健胃消食口服液（濟川藥業集團有限公司，批號：2112225）；注射用胸腺五肽（北京雙鷺藥業股份有限公司，批號：20211205）；注射用環磷酰胺（山西普德藥業有限公司，批號：04210703）。

刀豆蛋白A（ConA，美國Sigma 公司，批號：SLCF6611）；CCK-8試劑 [北仁化學科技（北京）有限公司，批號：TR688]；含雙抗的RPMI 1640 細胞培養液（批號：20220410）、紅細胞裂解液（批號：20211227）均購自Solarbio 生物科技有限公司；胎牛血清（ExCell Bio 公司，批號：12J040）；5%綿羊紅細胞（SRBC，北京源葉生物科技有限公司，批號：J10HH1184419）；豚鼠血清（北京博奧拓達科技有限公司，批號：2022/06）；多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復合物（PerCP）熒光-花菁染料（Cy）5.5 偶聯抗小鼠抗原CD3e抗體、藻藍蛋白（APC）偶聯抗小鼠CD4 抗體、熒光素5-異硫氰酸酯（FITC）偶聯抗小鼠CD8a 抗體（BD Biosciences Pharmingen 公司，批號分別為1141679、1113645、1327295）；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，純度≥98%，批號：CCHM701184）、檸檬酸（純度≥99%，批號：BW1746）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，純度≥98%，批號：SH-N201487）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP，純度≥98%，批號：GC35420-100）、順烏頭酸（純度≥98%，批號：CCFD200673）、琥珀酸（純度≥98%，批號：BW1754）、α-酮戊二酸（純度≥98%，批號：BW2515）、乳酸（純度≥90%，批號：BW1772a）、無水葡萄糖（純度≥98%，批號：CCHM700477）、二磷酸腺苷（ADP，純度≥98%，批號：CCAD301420）、單磷酸腺苷（AMP，純度≥98%，批號：CCFD200371）均購于北京萬佳標準物質研發中心。

1.3 儀器

MCO-5AC 型CO2細胞培養箱（日本Sanyo 公司）；VT-840K 型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；16-K 型高速臺式低溫離心機（美國Sigma公司）；SB-1100 型恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；H1 型全自動酶標檢測儀（美國博伯騰儀器有限公司）；CytoFLEX 型流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；Triple Quad? 6500+LC-MS/MS 系統（美國AB Sciex 公司），包括Exion LC-20AC 型高效液相色譜儀、Ion Drive? TurboV 型離子源、Sciex 6500 型三重四極桿檢測器、Analyst 1.7 數據采集系統和MutiQuant 3.0.3 數據處理系統；JA503-DuaIRange 型十萬分之一電子天平（上海舜字恒平科學儀器有限公司）；Heraeus MuLtifuge X1R 型高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；MS3 digital 型渦旋儀（德國IKA 公司）；Scientz-48L 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 動物分組、模型制備與給藥 將60 只SPF級BALB/c 雄性小鼠于環境適應性飼養4 d 后，按照體質量隨機分為對照組，模型組，陽性藥物（胸腺五肽，1.5 mg·kg-1）組，健胃消食口服液低、中、高劑量（0.620、1.240、2.480 g·kg-1）組，每組10只。對照組小鼠連續3 d 腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他6組小鼠連續3 d腹腔注射環磷酰胺（10 mg·kg-1），制備免疫抑制模型。于第4 天開始給藥，給藥劑量按照動物與人體每千克體質量劑量折算系數計算所得，對照組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天1 次。連續給藥15 d，期間每隔2 d 記錄體質量，于第15 天稱質量，給藥后1 h 對小鼠進行托頸處死，于無菌條件下取出小鼠胸腺、脾臟稱定質量，計算脾體比（脾臟質量/體質量）和胸腺體比（胸腺質量/體質量）。

2.1.2 藥物對脾淋巴細胞增殖作用的研究 將無菌條件下取出的小鼠脾臟制備成脾細胞懸液。取部分用含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養基混懸調整細胞濃度為5×106個/mL，分2 孔加入96 孔培養板，每孔90 μL，其中1 孔加入ConA 液（使終質量濃度為5 μg·mL-1）10 μL，另一孔加入RPMI 1640培養基10 μL 作為對照，使每孔總體積為100 μL。每個樣品設置3 個復孔。每個培養板設置1 個只加RPMI 1640完全培養液的空白對照孔。置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養48 h。培養結束前4 h，每孔加入CCK-8 10 μL。用酶標儀測定450 nm 波長下的吸光度（A），按照公式（1）計算增殖刺激指數（SI）。

2.1.3 藥物對T 淋巴細胞亞群的作用研究 取適量小鼠脾細胞懸液加入磷酸鹽緩沖液（PBS）10 mL混懸洗滌2 次。調整細胞濃度為1×106個/mL，取1 mL加入離心管中，避光依次加入CD3e、CD4 和CD8a抗體，于4 ℃避光冰浴30 min 封閉。1500 r·min-1離心5 min（離心半徑為9.8 cm）棄上清液后加入PBS 5 mL 洗滌1 次，離心棄上清液，加入PBS 1 mL混懸后用流式細胞儀進行檢測。

2.1.4 藥物對B 細胞抗體生成作用的研究 在免疫抑制模型小鼠連續給藥的第7 天末次給藥后，尾靜脈注射5% SRBC 懸液0.2 mL 進行致敏，連續給藥7 d后停藥，于停藥次日，脫頸處死小鼠，解剖小鼠取脾，制備脾細胞懸液，用冷PBS 調節脾細胞濃度為1×107個/mL 的細胞懸液。取脾細胞懸液1 mL、0.2% SRBC 1 mL、1∶10 稀釋補體1 mL 充分混勻，同時加設不加補體的空白對照管，每組設置3 個復孔，置 于37 ℃水 浴60 min 后，3000 r·min-1離 心5 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液，用酶標儀測定每個孔A，即為各組藥物的B細胞抗體生成量。

2.1.5 統計學方法 所有結果以（）表示，采用SPSS 13.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），比較各實驗組與對照組的差異。對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，滿足正態性或方差齊性要求后，用轉換后的數據進行統計。若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1 化合物作用靶點獲取 利用中醫藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/）[12]中藥材數據庫、中藥方劑數據庫，搜集收載的太子參、陳皮、山藥、山楂、麥芽中相關化學成分靶點，成分以“ADMET Absorption Level”水平在中等及以上，或“Druglikeness Grading”在moderate 及以上進行篩選。同時結合文獻，對報道有生物活性和藥理作用的，雖然不符合篩選標準的成分依然納入研究。靶點以Tanimoto Score≥0.8進行篩選。

2.2.2 疾病靶點獲取 在疾病數據庫中以健胃消食口服液相應的臨床癥狀“Gastritis”“Anorexia”為關鍵詞進行疾病靶點的搜索。考慮TCMIP 平臺疾病靶點主要來自HPO、DisGeNET 及OMIM 數據庫。為防止靶點的遺漏，以相同關鍵詞在GeneCards 數據庫（http://www.genecards.org/）篩選疾病對應的靶點信息，合并刪除重復項作為健胃消食的作用靶點。

2.2.3 交集基因的獲取 利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）將健胃消食口服液與疾病相關的作用靶點取交集，獲取不同成分的交集基因，并根據各個藥物作用靶點的差異性進行分析。

2.2.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）分析 將交集靶基因輸入String 數據庫（https://string-db.org/）構建PPI 網絡，限定物種為“Homo sanpiens”，隱藏游離節點，medium confidence（0.07）處理后，得到PPI網絡圖，下載.tsv格式文件導入Cytoscape 3.8.2中，利用CytoNCA 插件篩選核心靶點，并進行差異性分析。

2.2.5 靶點作用通路京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）分析 利用歐易生物云平臺（https://www.majorbio.com/）核心靶點進行GO及KEGG富集分析，選擇“homo sapiens”，設置P為0.01，其中GO 功能分析包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）。

2.3 基于三羧酸（TCA）循環通路的機制探討

取各對照品適量進行精密稱定，加入50%甲醇超聲溶解并定容至刻度線，待用。

精確稱量各組小鼠脾臟組織，加入等量0.9%氯化鈉溶液，適量鋼珠，使用高通量組織研磨器研磨1 min 后加入等量乙腈（0.2%甲酸）勻漿2 min，4000 r·min-1離心5 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液100 μL，加入乙腈200 μL，渦旋混勻3 min，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液，待檢。色譜、質譜分析條件參見文獻[13]。

3 結果

3.1 動物實驗結果

3.1.1 藥物對小鼠表觀指標及體質量的影響 連續給小鼠注射環磷酰胺3 d后，對照組小鼠精神狀態良好，皮毛順滑、活動敏捷、動作協調、飲食飲水及活動表現均正常，對外界刺激反應敏捷。模型組小鼠出現進食、飲水減少，體質量減輕，活動減少，反應遲鈍，蜷縮弓背，毛松等免疫低下體征，表明小鼠免疫抑制模型制備成功。小鼠體質量變化見圖1，模型組小鼠體質量持續下降，而給藥組小鼠從給藥后第4 天開始體質量相繼出現不同程度的恢復，其中健胃消食口服液中、高劑量組小鼠體質量與對照組水平接近，給藥組小鼠的飲食減少、反應遲鈍、蜷縮弓背情況也均有不同程度的改善。

圖1 健胃消食口服液對小鼠體質量的影響（,n=10）

3.1.2 藥物對小鼠脾指數和胸腺指數的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠脾體比和胸腺體比的影響見表1。模型組小鼠脾體比和胸腺體比較對照組顯著降低，證明免疫抑制模型制備成功。與模型組比較，胸腺五肽組小鼠脾體比和胸腺體比顯著升高，健胃消食口服液各給藥組小鼠脾臟體比和胸腺臟體比均有不同程度升高，提示健胃消食口服液可提高動物免疫器官功能水平。

表1 健胃消食口服液對小鼠脾體比和胸腺體比的影響（,n=10）

表1 健胃消食口服液對小鼠脾體比和胸腺體比的影響（,n=10）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；表2同。

3.1.3 藥物對小鼠免疫功能的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠的脾淋巴細胞轉化能力和B細胞抗體生成能力的影響見表2。與對照組比較，模型組小鼠脾淋巴細胞的轉化能力和B 細胞抗體生成能力均顯著降低，證明免疫抑制模型制備成功。與模型組比較，胸腺五肽組和健胃消食口服液低、中、高劑量組小鼠脾淋巴細胞的轉化能力和B 細胞抗體生成能力均不同程度地升高，證明健胃消食口服液可提高小鼠細胞免疫和體液免疫能力。

表2 健胃消食口服液對小鼠免疫功能調節的影響（,n=10）

表2 健胃消食口服液對小鼠免疫功能調節的影響（,n=10）

3.1.4 藥物對T 淋巴細胞亞群的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠脾淋巴細胞中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影響結果見表3。設CD3+作為門類檢測基數，通過熒光比值獲得CD4+和CD8+的相對數值，結果發現模型組的CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的值均低于對照組（P<0.01）。與模型組比較，胸腺五肽陽性藥和健胃消食口服液低、中、高劑量組均有不用程度的提高（P<0.05，P<0.01），其中健胃消食口服液低、中劑量組的CD4+值顯著提高（P<0.01），中劑量組CD8+值顯著提高（P<0.01），高低劑量組CD4+/CD8+值顯著提高（P<0.01）。

表3 健胃消食口服液對T淋巴細胞亞群的作用（,n=10）

表3 健胃消食口服液對T淋巴細胞亞群的作用（,n=10）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 網絡藥理學實驗結果

3.2.1 成分靶點信息整合 通過數據庫搜索與文獻補充[14]，收集太子參化學成分9 個、陳皮化學成分50 個、山藥化學成分34 個、麥芽化學成分9 個、山楂化學成分27 個，經篩選共收集成分靶點2552 個，最終刪除重復值得到靶點650 個，提示各成分之間共性靶點較多，各成分之間可能存在潛在的疊加作用。化合物見表4。

表4 健胃消食口服液中各中藥成分

3.2.2 疾病相關靶點的獲取 飲食積滯臨床常見厭食、胃炎等病癥。以“Gastritis”與“Anorexia”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫分別獲得靶點3739、2470 個，根據Relevance score 參數進行篩選，最終得到1490個靶點，結合TCMIP疾病數據庫結果，去除重復值，最終得到1512個疾病靶點。

3.2.3 健胃消食口服液、疾病作用靶點差異分析 將成分靶點信息與疾病靶點基因在微生信平臺取交集，繪制韋恩圖，見圖2。通過取交集靶點，共獲得了健胃消食口服液與疾病相關作用靶點149個，與消食相關作用靶點94個，與胃炎作用靶點78個，三者共同靶點23 個。將交集基因導入String 11.0 平臺，隱藏游離節點，以.tsv 格式導入Cytoscape 3.8.2軟件，構建PPI網絡圖，見圖3。

圖2 健胃消食口服液-疾病作用靶點韋恩圖

圖3 健胃消食口服液-疾病作用靶點PPI網絡

3.2.4 核心靶點的功能與通路的分析 為確定健胃消食口服液的核心作用靶點，結合CytoNCA 插件以度（degree）值進行排序篩選了56 個核心靶點。對核心靶點進行KEGG 及GO 功能分析（P<0.01），結果見圖4、圖5。

圖4 健胃消食口服液-疾病KEGG富集分析

圖5 健胃消食口服液-疾病靶點GO功能富集

根據KEGG 分析結果顯示，健胃消食口服液主要作用于生物體系統分類下的免疫系統 [C 型凝集素受體信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、輔助性T 細胞17（Th17）細胞分化、Toll 樣受體信號轉導]、環境信息處理分類下的信號傳導（腫瘤壞死因子信號通路、環腺苷3',5'-單磷酸信號通路、核轉錄因子-κB 信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路、血管內皮生長因子信號通路）及新陳代謝分類下的糖代謝（TCA 循環）。同時，TCA 循環也是前20的KEGG 條目中唯一顯著富集在metabolism 的代謝通路，這為后續的機制研究帶來新的提示。

BP 富集分析提示，健胃消食口服液主要通過干預發熱的正調控、細胞因子介導的信號通路、一氧化氮生物合成過程的正調控及凋亡過程的負調控等過程發揮相應作用。CC 及MF 富集分析表明，健胃消食口服液靶點的產物主要在線粒體、膜筏及突觸等部位通過影響淀粉樣蛋白β結合、N-甲基-D-天冬氨酸受體NMDA 谷氨酸受體活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性等發揮作用，見圖5。

3.3 藥物對TCA循環的影響

健胃消食口服液對免疫低下小鼠TCA 循環影響見表5。在造模的過程中琥珀酸、ADP、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸的含量均呈現了上升趨勢，而在灌胃給予健胃消食口服液后，琥珀酸、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸含量降低，其中ADP 只在低劑量給藥后呈現下降趨勢。

表5 健胃消食口服液對TCA循環代謝的影響（,n=4）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，###P<0.001。

4 討論

健胃消食口服液具有益氣健脾、消食導滯的功效。研究表明，太子參能促進淋巴細胞增殖、提高免疫功能，明顯改善大黃所致脾虛型小鼠小腸功能紊亂的癥狀[15]。陳皮所含揮發油有利于分泌消化液，促進腸道積氣消散，增強食欲；橙皮苷能抑制潰瘍，可利膽和調節腸胃[16]。山藥作為我國傳統藥食同源食物之一，主要含有多糖、氨基酸、脂肪酸、山藥素類化合物、微量元素、淀粉、蛋白質等化學成分。研究表明，山藥多糖可有效抑制小鼠體內腫瘤生長，具有顯著免疫調節效用[17]，對環磷酰胺所致小鼠肝脾損傷有良好保護作用[18]。山藥蛋白肽還可以通過激活和保護免疫系統中的免疫器官、細胞和活性物質發揮免疫調節作用，進而增強機體的免疫防御能力[19]。麥芽主要含有多糖類、生物堿類等化學成分。對麥芽的研究熱點集中在其助消化、回乳、抗結腸炎及抗氧化的活性[20]。山楂是原衛生部批準的藥食兩用藥材之一，主要含有總黃酮、有機酸、三萜酸和原花青素等化學成分。研究表明山楂黃酮對小鼠脾淋巴細胞具有顯著的免疫調節作用[21]。山楂提取物對小鼠胃平滑肌具有雙向調節作用，可調節腸道功能紊亂，起到健胃消食的作用[22]。因此結合上述5味中藥，可起到補而不滯、通而不峻、不熱不燥的功效[23]。

脾臟和胸腺的發育狀況與機體免疫功能密切相關，脾臟指數和胸腺指數能客觀反映免疫器官的功能狀況，是機體非特異性免疫的一個方面[24]。本研究結果顯示，健胃消食口服液與模型組相比可增加免疫低下小鼠的脾體比和胸腺體比，其中中劑量組的作用效果最明顯，說明健胃消食口服液可提高動物免疫器官的功能水平。結合網絡藥理學研究，對成分-疾病核心靶點進行KEGG 富集分析，發現前10位的條目中有4 條屬于免疫系統，進一步提示健胃消食口服液可能是通過影響免疫系統來發揮相應作用。

研究表明，機體在參與免疫應答過程中會釋放出多種TCA 循環代謝中間產物[25]。根據文獻報道，每個階段的T 細胞，甚至是不同的T 細胞相似階段的亞群均可表現出獨特的代謝特征，如幼稚 T 細胞以靜止狀態避免非特異性或過度免疫反應[26]。因此，細胞內代謝在很大程度上依賴于TCA 循環，見圖6。激活后，T細胞迅速增殖，進一步分化成輔助T淋巴細胞即CD4+T 細胞和細胞毒性T 淋巴細胞即CD8+T細胞，兩者比值（CD4+/CD8+）反映T淋巴細胞的生物活性，比值上升，說明免疫功能增強，相反則說明免疫功能低下。本研究通過流式細胞儀檢測健胃消食口服液對T 淋巴細胞亞群增殖的影響，結果顯示，與模型組相比，健胃消食口服液可提高免疫抑制小鼠的CD4+、CD8+T 淋巴細胞數量及兩者比值（CD4+/CD8+），但不存在劑量依賴關系，且低于對照組小鼠，說明健胃消食口服液發揮免疫活性的方式并不完全是直接激活T 淋巴細胞。B 細胞在抗原刺激及Th 細胞輔助下被激活，經過細胞增殖、抗原選擇、免疫球蛋白類型轉換和細胞表面某些標志的改變、細胞體突變，最終分化為能產生抗體的漿細胞。因此B 細胞抗體形成細胞數量的多少反映機體體液免疫的狀態。與模型組相比，給予健胃消食口服液后抗體釋放量均有不同程度升高，中劑量組的效果較為明顯，說明健胃消食口服液可一定程度提高小鼠體液免疫能力。

圖6 三羧酸循環代謝與細胞免疫關聯網絡

網絡藥理學富集結果也發現，琥珀酸脫氫酶復合體B 亞基（SDHB）、檸檬酸合酶（CS）、琥珀酸脫氫酶復合體C 亞基（SDHC）、異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）等靶點在TCA 循環通路顯著富集。TCA 循環是前20的KEGG條目中唯一顯著富集在metabolism的代謝通路，提示TCA 通路的改變與健胃消食口服液的免疫作用機制息息相關。在造模的過程中琥珀酸、ADP、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸的含量均呈現了上升趨勢。琥珀酸被認為是一種先天免疫信號代謝物，可作為代謝紊亂的生物標志物。造模過程中過量的琥珀酸會增加線粒體膜電位，促進IL-1β的生成，造成機體炎癥反應。順烏頭酸可促進檸檬酸轉化成異檸檬酸，檸檬酸作為TCA 循環的中間代謝產物之一，含量累積，代謝加快。因此，推測健胃消食口服液可能通過降低代謝產物的積累，緩解異常能量代謝從而影響細胞免疫代謝功能。

綜上所述，本研究通過注射環磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，結合網絡藥理學及體外實驗，評估健胃消食口服液對T 淋巴細胞亞群的變化提示其免疫調節作用的多元性，并結合代謝組學的方法，研究TCA 循環相關代謝產物與免疫功能的相關性，為后續健胃消食口服液的作用機制研究提供借鑒。