經典名方芍藥甘草湯古代與現代煎煮方法的差異性分析△

高永堅，曾杉，林碧珊，陳偉彥，彭丹丹，董家銘，王艷霞

國藥集團廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

經典名方療效確切，傳承至今仍廣泛應用，具有明顯的特色與優勢。為支持經典名方的研究及創新開發，促使其轉化成質量高、療效好的經典產品，國家相關部門相繼出臺了《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定》[1]和《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》[2]（以下簡稱《指導原則》）。經典名方芍藥甘草湯出自東漢張仲景[3]的《傷寒論》，其中記載“傷寒脈浮，自出汗，小便數，心煩，微惡寒，腳攣急……若厥愈足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸”，原處方為“白芍藥、甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服”。張仲景的芍藥甘草湯被歷代醫家推崇，其加減組方一直沿用至今，是國家中醫藥管理局公布的《古代經典名方關鍵信息表（25首方劑）》[4]中的經典名方之一。該方由白芍和炙甘草組成，白芍酸苦微寒，益陰養血；炙甘草甘溫，補中緩急。兩藥合用，有滋陰血、緩攣急的作用，臨床上用芍藥甘草湯治療肌肉痙攣、關節拘急、疼痛均有較好療效。根據《經方本原劑量問題研究》[5]中東漢時期度量衡換算標準，一兩約為現代13.8 g，一升為200 mL，一合為20 mL。若按古代煎煮方法，則取白芍藥、炒甘草各55.2 g，加水600 mL，煮取至300 mL 的藥液，提取過程中飲片利用率低，致使大量飲片被浪費。而現代臨床應用多參照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[6]，加水煎煮2次，可將飲片中有效成分充分提取，節省資源，降低成本。古今2種煎煮方法的制備工藝存在較大差異，因此本研究以干膏率、指紋圖譜及有效成分含量為考察指標，進一步進行對比研究，優化本方的制備工藝。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS105DU 型十萬分之一天平、AL104 型萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-202145，純度：94.6%）、沒食子酸（批號：110831-201605，純度：90.8%）、甘草苷（批號：111610-201607，純度：93.1%）、苯甲酸（批號：100419-201703，純度：99.9%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內酯苷（批號：8619，純度：95.0%）、芹糖甘草苷（批號：6969，純度：98.0%）、異甘草苷（批號：6387，純度：98.0%）、甘草素（批號：4280，純度：98.0%）、苯甲酰芍藥苷（批號：4633，純度：95.0%）均購自成都德思特生物有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。白芍（購自安徽省亳州市，批號分別為BS301、BS302、BS303）、甘草（購自甘肅省定西市，批號分別為GC301、GC302、GC303）按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版[7]檢驗均合格。白芍飲片按《中國藥典》2020 年版[7]炮制而得，炒甘草飲片按《上海市中藥飲片炮制規范》2018 年版[8]炮制而得。

2 方法與結果

2.1 古代方法煎煮

取白芍、炒甘草各55.2 g，加入陶瓷壺中，加水600 mL，使用武火500 W 煮沸后，調至文火200 W煎煮30 min，350目篩趁熱濾過，得煎液。

2.2 現代方法煎煮

按《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[6]方法煎煮，得煎液。

2.3 特征圖譜測定

2.3.1 供試品溶液的制備 取相當于飲片量1 g 的古代煎煮方法制備的芍藥甘草湯煎液，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水至約15 g，再加甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、甘草素、異甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成質量濃度為80 μg·mL-1的混合溶液。

2.3.3 色譜條件 Waters Cortecs T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，5%A；4～15 min，5%～36%A；15～21 min，36%～100%A；21～25 min，100%～5%A），流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進樣體積為1 μL。

2.3.4 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液與空白溶劑各1 μL 注入液相色譜儀測定，結果表明，在空白溶劑色譜相應位置上無對應色譜峰出現，在供試品溶液色譜相應位置上與對照品色譜相應位置上的色譜峰都相對應，說明該方法專屬性較好（圖1）。

2.3.5 精密度考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜條件連續進樣6 次，所得色譜圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.3.3 項下色譜條件測定，所得色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩定性考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h測定，所得色圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.3.8 古代煎煮方法和現代煎煮方法的圖譜分析 按2.3.1 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3項下色譜條件進行測定，對比古代煎煮方法和現代煎煮方法的液相色譜圖（圖2）。在含相同飲片量的情況下，2 種煎煮方法所得煎液色譜圖的色譜峰數目基本一致，無明顯差異。

圖2 芍藥甘草湯古代煎煮方法和現代煎煮方法特征圖譜

2.3.9 特征圖譜的建立與共有峰指認 將2 種煎煮方法的芍藥甘草湯色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），進行多點校正，以古代煎煮方法的特征圖譜為參照圖譜，建立芍藥甘草湯2 種煎煮方法的對照特征圖譜。由于1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖峰的峰分離效果差且峰面積小，故暫不考慮此峰。利用對照品比對法匹配了沒食子酸、芍藥內酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸10 個共有峰。2 種煎煮方法的特征圖譜相似度均為0.996，大于0.99。

2.3.10 相對保留時間、相對峰面積及峰面積分析 以峰3芍藥苷為參照峰（S峰），2種煎煮方法的芍藥甘草湯共有峰的相對保留時間和相對峰面積結果見表1，相對保留時間的RSD 均小于1.0%，表明各共有峰具有較高的相似性；在含相同飲片量的前提下，對比2 種煎煮方法所得煎液的相對峰面積，結果現代煎煮方法與古代煎煮方法的相對峰面積的RSD 均小于1.0%，表明其相對峰面積結果差異較小。但是，綜合分析2 種煎煮方法的色譜峰峰面積（表2），現代煎煮方法的主要色譜峰峰面積均在古代煎煮方法的2 倍以上，表明現代煎煮方法所得煎液中各化合物的含量高于古代煎煮方法，飲片利用率較高，現代煎煮方法明顯優于古代煎煮方法。

表1 芍藥甘草湯古代煎煮方法與現代煎煮方法相對保留時間和相對峰面積

表2 芍藥甘草湯古代煎煮方法與現代煎煮方法共有峰的峰面積

2.4 含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 取相當于飲片量1 g 的芍藥甘草湯煎液，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加水至約15 g，再加甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為100、50、100 μg·mL-1的混合溶液，即得。

2.4.3 色譜條件 芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測定采用2.3.3項下色譜條件。

2.4.4 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液與空白溶劑各1 μL，注入液相色譜儀測定，結果見圖3。結果表明，與空白溶劑相比，在供試品溶液色譜相應位置上無對應色譜峰出現，說明該方法專屬性較好。

圖3 芍藥甘草湯與混合對照品HPLC圖

2.4.5 線性關系考察 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為400 μg·mL-1的對照品儲備液；取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為400 μg·mL-1的對照品儲備液；取甘草苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質量濃度為200 μg·mL-1的對照品儲備液。分別取芍藥苷對照品儲備液和甘草酸銨對照品儲備液稀釋成質量濃度為400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg·mL-1的溶液；取甘草苷對照品儲備液稀釋成質量濃度為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg·mL-1的溶液。按2.4.3項下色譜條件測定，以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得芍藥苷、甘草苷、甘草酸線性回歸方程分別為Y=4 990.9X-2 204.9（r=0.999 9）、Y=7 892.1X+3 833.3（r=1.000 0）、Y=3301X+930.56（r=1.000 0），結果表明芍藥苷、甘草苷、甘草酸在一定質量濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.6 精密度試驗 取2.1 項下制備的煎液適量，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項下色譜條件連續進樣6 次，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD 分別為1.45%、1.70%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性試驗 取2.1 項下制備的煎液適量，按2.4.1項下方法制備供試品溶液，按2.4.3項下色譜條件分別于制備后0、3、6、9、12、24、36、48 h進樣，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為1.63%、1.65%、1.69%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.4.8 重復性試驗 取2.1 項下制備的煎液適量，按2.4.1 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.4.3 項下色譜條件測定，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸質量分數的RSD 分別為0.59%、0.69%、1.75%，表明該方法重復性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的芍藥甘草湯煎液0.60、1.30、2.10 g，各平行處理3 份，分別按1∶1加入低（50%）、中（100%）、高（150%）質量濃度的芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，按2.4.1 項下供試品溶液的制備方法處理后按2.4.3項下色譜條件進行測定，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸的加樣回收率分別為102.35%、97.84%、100.76%，RSD分別為1.34%、1.38%、1.38%，表明該方法準確度良好，結果見表3。

表3 芍藥甘草湯中3個成分加樣回收率試驗結果 mg

2.4.10 樣品測定 取2 種方法制備的煎液適量，按2.4.1項下方法制備供試品溶液，參照2.4.3項下色譜條件測定，測得古代和現代煎煮方法煎液的芍藥苷、甘草苷、甘草酸處方量見表4，處方中芍藥苷、甘草苷、甘草酸處方量現代煎煮方法約為古代煎煮方法的2 倍。結果表明，現代煎煮方法的飲片利用率明顯高于古代煎煮方法。

表4 芍藥甘草湯古代和現代煎煮3個成分處方量

2.5 干膏率

分別取2 種煎煮方法制得的煎液約10 g，精密稱定，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，冷卻0.5 h后，精密稱定質量，按公式（1）計算固含率，按公式（2）計算干膏率。

結果表明，芍藥甘草湯現代煎煮方法的干膏率明顯高于古代煎煮方法，且現代煎煮方法干膏率約為古代煎煮方法的2倍（表5）。

表5 芍藥甘草湯古代和現代煎煮方法的干膏量和干膏率

3 討論

經典名方芍藥甘草湯由白芍和炒甘草2 味中藥組成，雖然藥味較少，但其化學成分復雜，不同煎煮方法可能導致復方中有效成分含量發生變化，進而影響復方功效及臨床療效，因此考察煎煮方法尤為重要。芍藥甘草湯含芍藥苷、甘草苷、甘草酸和多糖等成分，芍藥苷為常用中藥白芍的主要有效成分，是一種單萜類糖苷化合物，具有抗自由基損傷、抑制細胞內鈣超載、保護腦血管系統、抑制腫瘤細胞、調節免疫作用等功效[9]；甘草苷和甘草酸是甘草的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和調節免疫作用[10]。本研究以干膏率、有效成分含量及指紋圖譜對芍藥甘草湯的2 種煎煮方法進行差異性分析，推測產生差異的原因包括：1）白芍和甘草在處方中的劑量都比較大，按古代煎煮方法，煎煮水量較少、時間較短，不能將有效成分充分提取出來。2）按現代方法進行煎煮所得處方的干膏率、有效成分含量是古代煎煮方法的2 倍。芍藥甘草湯的現代煎煮方法能較好地提取芍藥苷、甘草苷、甘草酸成分，其飲片的利用率高于古代煎煮方法，可以避免藥材的大量浪費。

芍藥甘草湯原文記載為“以水三升，煮取一升五合，去滓”。結合《指導原則》[2]、《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[6]及具體情況，有必要合理確定制備工藝。芍藥甘草湯的現代煎煮方法能較好地提取芍藥苷和甘草苷等有效成分，且現代煎煮方法更易貼合工業生產實際情況，更適于制劑的工業轉化。綜合考慮，現代煎煮方法可能更適用于芍藥甘草湯的制劑開發。

綜上所述，本研究結合《指導原則》[2]，以制劑與基準樣品的質量基本一致為目標，從干膏率、有效成分含量、指紋圖譜角度對經典名方芍藥甘草湯的2 種煎煮方法差異進行探討分析，以期為煎煮工藝不明確的經典名方物質基準制備及制劑生產研究提供參考。