薄層鑒別結合多成分測定方法評價苓桂術甘顆粒質量

馬曉敏，周建新，肖蘇萍*，謝彬，3，李龍妹，3，陳蒙，杜杰，王繼永，盧亞楠

1.中國中藥有限公司，北京 102600；2.北京城市學院，北京 100191；3.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

苓桂術甘湯出自東漢·張仲景《金匱要略》，主治心下痰飲、胸脅支滿、三焦有水氣，溫陽以化飲，使水飲下行，療效確切，是苓桂劑的代表方劑。原方由茯苓、桂枝、白術和甘草4 味藥組成，“以水六升，煮取三升，分溫三服”[1]。苓桂術甘湯是治療痰飲的代表方劑，痰飲疾病癥狀復雜，易累及其他系統。現代臨床研究表明，苓桂術甘湯對于心系疾病、肺系疾病和腎系疾病等均有確切療效[2-3]。桂枝的主要有效成分為桂皮醛、肉桂酸、原兒茶酸和香豆精等，對中樞神經系統具有鎮靜、鎮痛、解熱和抗驚厥作用，桂皮醛、肉桂酸為其中主要有效成分。白術中主要含有多糖、揮發油、內酯類和綠原酸類成分。綠原酸類成分具有抑菌、抗感染、抗腫瘤、調血脂、調血糖、保護心血管、保護神經系統的作用，其在抑菌、抗感染等方面研究較多，并可與其他有效成分共同發揮藥理活性[4-7]。苓桂術甘顆粒中白術內酯類成分含量較低，且采用高效液相色譜法較難分離。結合近年來相關研究[4-7]，選擇肉桂酸、桂皮醛、新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸作為定量指標，肉桂酸、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ作為定性指標評價苓桂術甘顆粒的質量。

依據《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（試行）》[8]的要求，將苓桂術甘湯經現代制備工藝制成使用便攜、劑量準確的顆粒制劑。經典名方研發需“遵古”，即按照古籍記載的工藝確定基準樣品標準后，顆粒制劑需與基準樣品質量保持一致，并建立制劑的相關質量控制方法。目前，對于經典名方苓桂術甘湯質量標準的研究多針對基準樣品進行，尚未有公布的苓桂術甘顆粒質量標準。本研究通過薄層鑒別及含量測定方法對苓桂術甘顆粒的質量進行評價，以期為苓桂術甘顆粒的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Visualizer 型薄層色譜數碼成像系統、Linomat型薄層色譜半自動點樣儀（卡瑪公司）；AE 240 型電子天平[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；XB320M 型電子天平（Presisa 公司）；KQ-500E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；3-16L 型離心機（Sartorius 公司）；e2695 型高效液相色譜儀（Waters公司）。

1.2 試藥

苓桂術甘顆粒（自制，批號分別為LG2220411001、LG220331003、LG220331004）；對照藥材桂枝、白術（批號分別為121191-201906、120925-202013），對照品肉桂酸、桂皮醛、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、綠原酸（批號分別為110786-201604、110710-202223、111976-201501、111978-201501、110753-202119，純度分別為99.8%、99.5%、96.3%、≥98%、≥98%）均購于中國食品藥品檢定研究院；苓桂術甘桂枝、白術陰性顆粒（自制，批號分別為LG220715GZY、LG220715BZY）；對照品新綠原酸、隱綠原酸（成都埃法生物有限公司，批號分別為AF20030804、AF21010310，純度分別均為98%）；水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙酸乙酯、石油醚、甲酸、乙醚均為分析純；乙腈、磷酸為色譜純；硅膠GF254薄層板（青島譜科分離材料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱定桂皮醛17.31 mg、肉桂酸10.69 mg、白術內酯Ⅱ5.88 mg、白術內酯Ⅲ9.32 mg，分別置于10 mL 量瓶中甲醇定容，得桂皮醛、肉桂酸、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ質量濃度分別為1.731、1.069、0.588、0.932 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液制備 桂枝對照藥材：取桂枝對照藥材粉末2 g，加乙醚10 mL，浸泡30 min，時時振搖，濾過，濾液揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。

白術對照藥材：取白術對照藥材粉末0.5 g，加正己烷2 mL，超聲處理15 min（250 W，40 kHz），濾過，取濾液作為對照藥材溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取苓桂術甘顆粒5 g，加水20 mL 使溶解，乙醚萃取2 次，每次20 mL。收集乙醚層，揮干，殘渣加甲醇1 mL 復溶，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 取缺白術的苓桂術甘顆粒和缺桂枝的苓桂術甘顆粒各5 g，加水20 mL 使溶解，乙醚萃取2 次，每次20 mL。收集乙醚層，揮干，殘渣加甲醇1 mL復溶，作為陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜鑒別 照薄層色譜法試驗，吸取桂皮醛對照品溶液、肉桂酸對照品溶液各5 μL，白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ對照品溶液各5 μL，桂枝對照藥材溶液5 μL，白術對照藥材溶液8 L，供試品溶液20 μL，白術、桂枝陰性樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶4∶0.1）為展開劑，預先飽和15 min，展開，取出，晾干，置于紫外254 nm 檢視，在與桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、桂枝對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點。噴以5%二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下烘烤3 min，置于紫外366 nm檢視，在與白術內酯Ⅱ對照品、白術內酯Ⅲ對照品、白術對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色斑點（圖1）。

圖1 苓桂術甘顆粒薄層鑒別

2.1.6 3 批苓桂術甘顆粒薄層色譜鑒別 對3 批實驗室自制苓桂術甘顆粒樣品使用2.1.5 項下方法進行薄層鑒別，見圖2。

圖2 苓桂術甘顆粒薄層鑒別多批驗證

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 X-Bridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相洗脫梯度（0～25 min，7%～13%A；25～30 min，13%～30%A；30～40 min，30%A；40～50 min，30%～32%A）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長分別為290、325 nm；進樣量：10 μL，色譜圖見圖3。

圖3 苓桂術甘顆粒高效液相色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品新綠原酸3.150 mg、綠原酸2.720 mg、隱綠原酸3.185 mg、肉桂酸4.735 mg、桂皮醛5.06.mg，置10 mL量瓶中，吸取該對照品母液1 mL至50 mL量瓶甲醇定容，即得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸、桂皮醛質量濃度分別為6.30、5.44、6.37、9.47、10.12 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取苓桂術甘顆粒約1 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（250 W，45 kHz）30 min，放至室溫，用甲醇補足質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 專屬性考察 按2.2.3 項下方法制備苓桂術甘顆粒樣品溶液、陰性樣品溶液、陽性樣品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣，觀察陰性樣品在目標峰相同位置是否有干擾，結果見圖4。桂枝、白術陰性樣品無干擾，此方法專屬性強。

圖4 苓桂術甘顆粒缺桂枝、白術陰性圖譜

2.2.5 線性關系考察 采用二倍稀釋法對混合對照品母液進行稀釋，新綠原酸質量濃度分別為68.40、34.20、17.10、7.88、3.90、0.95 μg·mL-1；綠原酸質量濃度分別為54.60、27.30、13.65、6.83、3.41、1.71 μg·mL-1；隱綠原酸質量濃度分別 為63.70、31.85、15.93、7.96、3.90、0.98 μg·mL-1；肉桂酸質量濃度分別為10.12、5.06、1.27、0.63、0.32、0.16 μg·mL-1。按2.2.1 項下色譜條件進樣，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，線性關系見表1。

表1 苓桂術甘顆粒中5個成分線性關系

2.2.6 精密度試驗 取供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛的峰面積的RSD 分別為2.87%、0.60%、0.78%、0.44%、0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛峰面積的RSD 分別為1.62%、0.52%、2.03%、0.15%、0.49%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取苓桂術甘顆粒，按2.2.3 項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算含量。結果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸和桂皮醛的平均質量分數分別為0.050 0、0.207 8、0.061 7、0.223 6、1.205 6 mg·g-1，RSD 分別為2.14%、0.87%、1.12%、0.29%、1.00%，表明該測定方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的苓桂術甘顆粒，按1∶1 比例加入混合對照品，平行制備6 份供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，計算回收率及RSD，結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、肉桂酸、桂皮醛的加樣回收率分別為109.46%、93.45%、97.04%、103.70%、102.41%，RSD 均小于3%。

2.2.10 3 批苓桂術甘顆粒5 個成分的含量測定 結果見表2。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件考察

薄層鑒別色譜圖中因顆粒劑中桂皮醛斑點較弱，考慮到桂皮醛成分不穩定，桂枝對照藥材在366 nm下顯示斑點與白術內酯類成分比移值接近；白術對照藥材斑點較多，但主要斑點為白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ。因此，選擇肉桂酸、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ作為薄層鑒別指標鑒別苓桂術甘湯顆粒?？疾炝瞬煌崛》绞剑ɑ亓魈崛?、超聲提取、有機溶劑萃?。?，3 種提取方式對肉桂酸斑點影響較大，采用有機溶劑萃取法獲得的肉桂酸斑點最為清晰。因此，選擇有機溶劑萃取。此外，考察了不同取樣量、不同點樣量，其中取樣量5 g、供試品點樣量15 μL，斑點最為清晰。不同溫度對薄層條件無影響，但是濕度對薄層條件影響較大，濕度越大，薄層色譜分離越差，相對濕度為35%時效果較好。

3.2 含量測定條件考察

對含量測定的色譜條件和提取條件進行考察?？疾炝? 種型號色譜柱CAPCELL PAK、X-Bridge，乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水對色譜圖的影響。結果X-Bridge 色譜柱、乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相效果更佳；又分別考察了超聲提取和回流提取，甲醇提取、乙醇提取和水提取，25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，提取15、30、45 min，加溶劑10、20、30 mL，結果以加25%甲醇20 mL提取30 min最佳。

3.3 方法可行性的探討

《中華人民共和國藥典》2020 年版收載的中藥復方制劑中薄層鑒別或含量測定方法大多是多項鑒別、多項含量測定、制備多種供試品溶液、多塊薄層板、展開多次、鑒別不同藥材、不同色譜條件、測定不同成分的傳統鑒別模式。為排除干擾，樣品前處理復雜、繁瑣、試劑耗材消耗大、檢測時間長，而且對環境造成污染。本研究建立了苓桂術甘顆粒中桂枝、白術2 味中藥同時定性、定量質量控制方法，可縮短檢測時長、節約試劑耗材、減少環境污染等。由于桂枝、白術2 味中藥的成分在苓桂術甘湯中的含量差異較大，顆粒制劑與基準樣品因輔料等略有差異，本研究的含量測定方法從經濟適用性和標準方法可行性上具有一定參考價值，但顆粒質量是否完全與基準樣品一致需多批量樣品驗證。

4 結語

苓桂術甘顆粒為古代經典名方苓桂術甘湯經現代工藝制備而成的復方制劑，成分復雜，質量標準建立和控制難度較大。本研究建立的方法還未見報道。建立不同的質量控制方法對保證經典名方的質量具有一定意義。本研究使用了薄層鑒別和高效液相方法同時對苓桂術甘顆粒中的桂枝、白術相關成分進行測定，在短時間內同時進行2 味中藥的薄層鑒別和含量測定，能夠更好地反映苓桂術甘顆粒的信息，經方法學驗證，方法可行。