董氏奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯改善胃癌術(shù)后患者腸道菌群紊亂的作用機(jī)制研究*

張 靜，高曉杰，富穎超，韓 玫，鄧力威，陳 娟

1 河北省退役軍人總醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054000； 2 邢臺(tái)市中醫(yī)院，河北 邢臺(tái) 054001

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明2018 年內(nèi)結(jié)腸原發(fā)性腫瘤患者中胃癌的死亡率為8.2%，排名所有腫瘤的第二［1］。手術(shù)是胃癌的主要治療方法之一，但是由于腫瘤患者本身存在免疫抑制，并且麻醉、手術(shù)也會(huì)影響患者的免疫情況，這會(huì)嚴(yán)重影響術(shù)后恢復(fù)［2］。研究表明，胃癌術(shù)后患者腸內(nèi)微生物會(huì)異常繁殖，甚至侵入腸外組織，不但影響患者胃腸功能，甚至?xí)?dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)，影響患者預(yù)后［3］。環(huán)芳香烴受體（cyclic aromatic hydrocarbon receptor，AhR）的表達(dá)受到腸道細(xì)菌的激活，可促進(jìn)白細(xì)胞介素22（interleukin-22，IL-22）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腸黏膜組織的修復(fù)，阻止細(xì)菌入侵，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)［4］。近年來(lái)，針?biāo)幝?lián)合的方法在調(diào)節(jié)免疫和輔助治療癌癥中取得了重大進(jìn)展。董氏奇穴針灸手法，來(lái)自《董氏奇穴針灸學(xué)》，其理論基于“穴位空間論”和“奇正接軌論”。研究顯示，以董氏奇穴為基礎(chǔ)的針?biāo)幝?lián)合不但具有調(diào)節(jié)免疫的作用［5］，還可以有效提高胃腸道功能［6］。研究顯示，扶正湯可以提高晚期胃癌患者的免疫能力，并具有緩解化療副作用的功能［7］。但是兩者聯(lián)合是否可以改善胃癌術(shù)后患者的免疫水平尚不清楚。因此，本文主要基于AhR/IL-22/STAT3 途徑探討董氏奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯對(duì)胃癌患者術(shù)后免疫水平及腸道菌群的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2017 年6 月至2019 年6 月在河北省退役軍人總醫(yī)院進(jìn)行胃癌手術(shù)的患者120 例，將以上患者隨機(jī)分為對(duì)照組和針?biāo)幝?lián)合組，每組60 例。對(duì)照組中男35 例，女25 例；平均年齡（53.92±4.94）歲；TNM 分期：Ⅰ期14 例，Ⅱ期31 例，Ⅲ期15 例。針?biāo)幝?lián)合組中男37 例，女23例；平均年齡（55.52±5.10 歲；TNM 分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期33例，Ⅲ期15例。兩組患者性別、年齡等基線(xiàn)資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)納入：1）符合腹腔鏡下胃癌根治術(shù)手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)者［8］；2）病理學(xué)活檢確診為胃癌者；3）年齡40～70 歲者；4）本研究符合赫爾辛基宣言，所有患者均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)：第2017-053號(hào)）。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)排除：1）接受化療、放療者；2）合并其他惡性腫瘤者；3）合并高血壓、糖尿病及血液學(xué)疾病和其他消化道疾病者。

1.4 治療方法兩組患者均行腹腔鏡下胃癌根治術(shù)。1）對(duì)照組給予針刺治療：根據(jù)董氏奇穴原理，取土水穴，四花上、中、下三穴，天皇、人皇、地皇三穴，門(mén)金上、下二穴，靈骨、大白穴，以此為基礎(chǔ)組穴，隨證加減。直刺0.5～1 寸，輕提捻轉(zhuǎn)至患者出現(xiàn)麻脹感，留針30 min，每日1次。2）針?biāo)幝?lián)合組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上給予丁沉扶正湯治療，藥物組成：太子參30 g，沉香30 g，烏藥30 g，丁香30 g，檳榔30 g，陳皮15 g，半夏15 g，茯苓15 g，蘇葉10 g，生姜10 g，大棗10 g，炙甘草10 g。水煎分兩次服用。兩組均連續(xù)治療7天。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 術(shù)中指標(biāo) 比較兩組術(shù)中基本指標(biāo)：手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量及清掃淋巴結(jié)數(shù)目。

1.5.2 腸道菌群 分別收集術(shù)后患者首次排便和干預(yù)后糞便樣本0.5 g，立即使用無(wú)菌水稀釋?zhuān)冒胱詣?dòng)微生物鑒定儀（ATB，梅里埃公司，法國(guó)）分析細(xì)菌含量，單位為l g/g。

1.5.3 T淋巴細(xì)胞亞群水平 在術(shù)后第2天和干預(yù)后收集患者外周血15 mL，其中10 mL 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群水平。通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson 公司）測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的百分比。

1.5.4 血清指標(biāo) 將“1.5.3”項(xiàng)下收集的血液樣本靜置后離心，應(yīng)用ELISA（Abcam 公司，美國(guó)）試劑盒檢測(cè)血清中D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入抗體和顯色劑，然后在450 nm 處檢測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。

1.5.5 RT-qPCR 檢測(cè)AhR、IL-22 和STAT3 mRNA表達(dá)水平 分別在手術(shù)時(shí)和術(shù)后7 天通過(guò)腸鏡收集結(jié)腸黏膜組織，通過(guò)TRIzol（Sigma 公司，USA）從組織中提取總RNA，并檢測(cè)其純度。對(duì)收集的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，試劑盒為PrimeScript-RT 試劑盒（Takara 公司，日本），條件為42 ℃/60 min，70 ℃/5 min，4 ℃下保存，然后利用SYBR Premix Ex Taq?試劑盒（Takara 公司，日本）進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，95 ℃/10 min，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，4 ℃下保存。使用GAPDH 作為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCq分析AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5.6 Western blot 檢測(cè)AhR、IL-22 和STAT3蛋白表達(dá)水平 將“1.5.5”項(xiàng)中的結(jié)腸黏膜組織樣本研磨萃取總蛋白，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)量濃度。分別取總量為40 μg 的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜（Bio-Rad公司，美國(guó)）進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。將1∶500 稀釋的anti-AhR、anti-IL-22 和anti-STAT3（Abcam 公司，美國(guó)）添加到分離的蛋白質(zhì)中，并在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗滌后在室溫下添加HRP 標(biāo)志的二抗孵育1 h。然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。GAPDH 用作內(nèi)參，用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.5.7 患者恢復(fù)情況 統(tǒng)計(jì)每位患者的住院時(shí)間及并發(fā)癥發(fā)生情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究的數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 進(jìn)行，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)指標(biāo)兩組手術(shù)時(shí)間、出血量及清掃淋巴結(jié)數(shù)目比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組手術(shù)指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組手術(shù)指標(biāo)比較（±s）

組別對(duì)照組針?biāo)幝?lián)合組例數(shù)60 60 t P手術(shù)時(shí)間（min）95.25±18.57 97.71±19.34 0.724 0.419出血量（mL）89.75±14.38 87.16±15.42 0.683 0.497清掃淋巴結(jié)數(shù)目（枚）19.76±2.13 19.15±2.26 0.248 0.841

2.2 腸道菌群兩組干預(yù)前腸道各種菌群含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后兩組乳酸桿菌和雙歧桿菌含量均升高（P＜0.05），且針?biāo)幝?lián)合組高于對(duì)照組（P＜0.05）；干預(yù)后兩組大腸桿菌、梭菌、擬桿菌和柔嫩梭菌水平均降低（P＜0.05），且針?biāo)幝?lián)合組低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組干預(yù)前后腸道菌群水平比較

2.3 T 淋巴細(xì)胞亞群水平兩組干預(yù)前外周血T細(xì)胞亞群水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后兩組CD3+和CD4+細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值均較干預(yù)前升高（P＜0.05），且針?biāo)幝?lián)合組高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組干預(yù)前后T細(xì)胞亞群水平比較

2.4 外周血D-LA 和炎性因子水平兩組干預(yù)前血清D-LA 和炎性因子水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)后兩組各項(xiàng)指標(biāo)均較干預(yù)前降低（P＜0.05），且針?biāo)幝?lián)合組各項(xiàng)指標(biāo)均低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩組干預(yù)前后外周血D-LA和炎性因子水平比較

2.5 AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及 蛋 白 表 達(dá)水平兩組干預(yù)前結(jié)腸黏膜組織中AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05）；干預(yù)后兩組各項(xiàng)指標(biāo)均較干預(yù)前升高，其中針?biāo)幝?lián)合組各項(xiàng)指標(biāo)高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表6、圖1。

圖1 兩組腸黏膜AhR/IL-22/STAT3中蛋白表達(dá)水平

表6 兩組術(shù)后及干預(yù)后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表6 兩組術(shù)后及干預(yù)后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：a表示與本組術(shù)后比較，P＜0.05

組別對(duì)照組針?biāo)幝?lián)合組例數(shù)60 60干預(yù)后4.21±0.40 a 5.68±0.53 a 18.647 0.000干預(yù)后4.08±0.38 a 5.54±0.51 a 19.524 0.000 P組別對(duì)照組針?biāo)幝?lián)合組IL-22 mRNA術(shù)后2.69±0.24 2.55±0.23 0.753 0.438 IL-22 蛋白術(shù)后1.41±0.13 1.29±0.12 0.834 0.312 t例數(shù)60 60干預(yù)后4.34±0.41 a 6.04±0.56 a 21.953 0.000干預(yù)后2.46±0.22 a 3.38±0.31 a 14.723 0.000 AhR mRNA術(shù)后2.75±0.24 2.63±0.25 0.612 0.463 AhR蛋白術(shù)后1.32±0.12 1.41±0.15 0.686 0.475 t P干預(yù)后2.06±0.19 a 3.19±0.30a 14.864 0.000干預(yù)后2.27±0.23 a 3.08±0.30 a 11.806 0.000 STAT3 mRNA術(shù)后2.78±0.26 2.92±0.27 0.343 0.662 STAT3蛋白術(shù)后1.56±0.15 1.50±0.14 0.275 0.714

2.6 并發(fā)癥發(fā)生情況及住院時(shí)間針?biāo)幝?lián)合組術(shù)后發(fā)生切口感染1 例，腹腔感染1 例，并發(fā)癥發(fā)病率3.33%（2/60）；對(duì)照組術(shù)后發(fā)生切口感染3例，腹腔感染3 例，肺部感染2 例，并發(fā)癥發(fā)病率13.33%（8/60）。兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.927，P=0.048）。住院時(shí)間針?biāo)幝?lián)合組為（11.28±2.17）天，對(duì)照組為（16.75±2.48）天，針 藥聯(lián)合組短于對(duì)照組（t=50812，P=0.000）。

3 討論

腹腔鏡下行胃癌根治術(shù)是治療非轉(zhuǎn)移性胃癌的重要方法，但是研究顯示麻醉過(guò)程、手術(shù)過(guò)程均會(huì)引起患者的應(yīng)激反應(yīng)，這會(huì)提高炎性水平抑制免疫能力。研究證實(shí)，接受胃癌根治術(shù)的患者在術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腸道功能紊亂和免疫水平降低，這會(huì)引起細(xì)菌過(guò)度繁殖和腸道黏膜損傷，進(jìn)而使腸道內(nèi)的微生物和內(nèi)毒素通過(guò)腸黏膜侵入腸外組織，影響術(shù)后康復(fù)［9］。

大量臨床證據(jù)表明，中醫(yī)中藥可以輔助治療癌癥和提高機(jī)體免疫能力。本研究結(jié)果顯示，針?biāo)幝?lián)合可以明顯促進(jìn)術(shù)后腸道有益菌（乳酸菌和雙歧桿菌）的恢復(fù)，減少大腸桿菌等有害菌的繁殖，提高外周血中CD3+、CD4+及CD4+/CD8+的水平。臨床證實(shí)針刺治療可以促進(jìn)胃癌術(shù)后胃腸蠕動(dòng)、促進(jìn)腸道積氣排出，加快恢復(fù)消化道的正常功能［10］。本研究研究了相關(guān)的科研、文獻(xiàn)材料及書(shū)籍，從中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，根據(jù)中醫(yī)理論，術(shù)后耗氣傷血、正氣虧虛，氣虛則運(yùn)行無(wú)力，滯于胃腸，導(dǎo)致胃癌術(shù)后消化道功能紊亂。據(jù)此，本研究組建中藥組方丁沉扶正湯，配合董氏奇穴益氣健脾，和胃降逆，從根本上縮短胃癌術(shù)后消化道功能紊亂的病程［11］。丁沉扶正湯不但可以抑制腫瘤組織中原癌基因的表達(dá)，還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能提高免疫能力［12］。陸潔等［13］研究顯示，扶正湯可以緩解晚期胃癌患者的免疫抑制情況并延長(zhǎng)患者生存期。針?biāo)幝?lián)合可以協(xié)同作用，激發(fā)中藥藥性，進(jìn)一步提高治療效果。研究表明，在扶正湯的基礎(chǔ)上聯(lián)合針灸可以促進(jìn)中藥的治療效果［14］。

董氏奇穴是一種傳統(tǒng)的針刺手法，其針?biāo)幝?lián)合可以進(jìn)一步調(diào)控免疫［15］。本研究結(jié)果顯示，董氏奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯可以共同提高消化道功能，調(diào)節(jié)腸道菌群，進(jìn)而阻止D-LA 等入侵，緩解炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制腸道有害菌的過(guò)度繁殖，進(jìn)而促進(jìn)胃癌患者術(shù)后恢復(fù)。

腸黏膜是阻止大腸桿菌及其分泌的D-乳酸等入侵的關(guān)鍵屏障。研究顯示，麻醉和胃癌手術(shù)均會(huì)引起腸黏膜受損，從而影響胃癌患者的預(yù)后［16-17］。AhR表達(dá)于腸黏膜上皮組織，腸道菌群的失調(diào)會(huì)影響AhR 的表達(dá)，進(jìn)而抑制IL-22 的水平。IL-22會(huì)激活STAT3并促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，使腸黏膜細(xì)胞增殖促進(jìn)腸黏膜組織的修復(fù)［18］。而腸黏膜組織的修復(fù)會(huì)使機(jī)體的免疫水平恢復(fù)，進(jìn)而反過(guò)來(lái)調(diào)控腸道菌群［19］。本研究結(jié)果顯示，在術(shù)后的恢復(fù)過(guò)程中，AhR/IL-22/STAT3 轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平升高，而針?biāo)幝?lián)合可以進(jìn)一步促進(jìn)腸黏膜組織表達(dá)AhR、IL-22和STAT3 mRNA 和蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腸黏膜屏障恢復(fù)。研究顯示，黃芪中的活性單體黃芪甲苷Ⅳ可通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)緩解敗血癥誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙［20］。體內(nèi)研究顯示，黨參可以促進(jìn)腸黏膜功能的恢復(fù)［21-22］。本研究結(jié)果顯示，董氏奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯可通過(guò)促進(jìn)AhR/IL-22/STAT3 通路轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)，進(jìn)而阻止D-LA 等入侵，緩解炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制腸道有害菌的過(guò)度繁殖，進(jìn)而促進(jìn)胃癌患者術(shù)后恢復(fù)。

綜上所述，董氏奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯可能通過(guò)促進(jìn)AhR/IL-22/STAT3 通路保護(hù)腸黏膜屏障，進(jìn)而促進(jìn)胃癌患者術(shù)后的細(xì)胞免疫緩解腸道菌群失衡，促進(jìn)患者恢復(fù)。但是關(guān)于奇穴聯(lián)合丁沉扶正湯提高胃癌患者術(shù)后恢復(fù)以及調(diào)控AhR/IL-22/STAT3通路的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。