基于生物信息學篩選鐵死亡參與潰瘍性結腸炎的核心基因及中藥治療預測*

黃曉燕，鄒孟龍，陳雅璐，寧 芯，陳柏輝，梁巧俐

1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023； 2 廣西中醫藥大學研究生學院，廣西 南寧 530001

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性復發性直腸及結腸炎癥性疾病，臨床表現為腹痛、腹瀉、便血等［1］。UC的發病機制尚不明確，通常被認為與腸道菌群失調、免疫反應紊亂等密切相關［2］。在臨床實踐中，常規治療UC 多使用氨基水楊酸、皮質類固醇、免疫調節劑等藥物［1］。然而，長期的西藥治療不僅給患者帶來了巨大的經濟負擔，而且治療后患者仍有較高的復發［3-4］。因此，探索UC新治療策略十分有必要。

鐵死亡是近年來被新發現的一種細胞程序性死亡，主要病理是脂質活性氧（reactive oxygen species，ROS）和鐵離子的積聚導致線粒體體積變小、雙層膜更致密、嵴減少及外膜破裂［5-6］。同樣地，研究表明鐵死亡誘導劑作用于谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），會使細胞抗氧化能力降低、ROS 堆積，最終引起細胞氧化性死亡［7］。這表明ROS堆積是鐵死亡的基本特征。值得提出的是，胃腸道是ROS 產物的主要來源，而腸道黏膜抗氧化劑的含量較少，腸道更容易受到氧化應激的損害［8-9］。與此同時，隨著UC的發展，腸道免疫細胞浸潤明顯增加，誘導了促氧化分子的產生，進而加快ROS堆積［10-11］。總而言之，細胞鐵死亡參與了UC的發生發展。

近年來，中醫藥文化在傳承創新中蓬勃發展，同時，生物信息學、網絡藥理學等工具的出現，為中藥的臨床運用提供了更有力的證據。因此，不少學者開始探索中藥治療UC 的新策略。WANG等［12］發現莪術苷能下調GPX4 的表達、抑制細胞鐵死亡，從而發揮治療UC 的效用。與西藥相比，中藥不僅能降低患者的經濟負擔，而且能從整體上有效治療UC［13］。基于此，本研究利用生物信息學工具，對UC 患者和健康受試者的結腸組織進行基因表達分析，初步篩選得到與鐵死亡相關的UC 差異表達基因，并對相關中藥進行預測，旨在為探索治療UC新策略提供參考。

1 數據庫與軟件

1.1 數據庫GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；STRING 數 據 庫（http：//string-db.org/，Version 11.0）；Coremine 數據庫（http：//www.coremine.com/）。

1.2 軟件Cytoscape 軟件（Version 3.8.0）；R語言（x64 4.0.3）；Perl語言（Strawberry 5.32）。

2 方法

2.1 研究方案利用GEO 數據庫篩選UC 差異表達基因；通過常用的中文及英文數據庫檢索鐵死亡相關基因，然后繪制UC 差異基因與鐵死亡相關基因的Venn圖，取得交集基因。通過STRING數據庫對交集基因進行蛋白相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）；借助Coremine 數據庫預測潛在治療中藥，篩選出具有調控細胞鐵死亡防治UC 效用的中藥，最后對得到的中藥進行歸納。方案流程見圖1。

圖1 研究方案流程

2.2 UC 差異表達基因的篩選以“潰瘍性結腸炎”的英文“ulcerative colitis”為關鍵詞在GEO 數據中檢索，經閱讀后篩選并下載編號GSE38713 的芯片數據。該芯片數據包含28 例患者基因表達信息，見表1。

表1 UC樣本信息

2.3 鐵死亡相關基因以“鐵死亡”為關鍵詞，在中國知網數據庫、重慶維普數據庫及萬方數據庫中檢索，同時以“鐵死亡”的英文“ferroptosis”為關鍵詞，在PubMed、Embase 及Cochrane library數據庫中檢索，綜合得到鐵死亡相關基因。

2.4 UC 與鐵死亡的交集基因將“2.2”項得到的UC 差異表達基因與“2.3”項得到的鐵死亡相關基因進行映射取交集，繪制Venn圖。

2.5 PPI 網絡構建將“2.4”項得到的交集基因導入STRING 數據庫，構建PPI 網絡，初步預測與UC相關的核心鐵死亡基因。

2.6 中藥治療預測將交集基因導入Coremine數據庫，映射出相關中藥，設置P＜0.01 為閾值，篩選出具有調控細胞鐵死亡、防治UC 效用的中藥，并對預測中藥進行歸經、功效歸納。

3 結果

3.1 鐵死亡相關基因經檢索，共得到60 個與鐵死亡相關基因［6，14-16］，見表2。

表2 鐵死亡相關基因

3.2 UC 差異表達基因的篩選利用R 語言對GSE38713 芯片數據進行整理，將篩選條件設置為|log FC|≥1 且P＜0.05，對健康受試者和UC 患者的結腸組織基因表達進行分析，共獲得差異表達基因1355 個。其中在UC 患者結腸組織中上調基因796 個，下調基因559 個，繪制火山圖對數據進行可視化，見圖2，橫坐標表示log FC，縱坐標表示-log10（PValue），圓點表示基因，綠色圓點表示在UC患者結腸組織中下調的基因，紅色表示在UC患者結腸組織中上調的基因，黑色表示無明顯差異的基因；并對差異倍數最大的前10 個基因繪制熱圖，見圖3（其中每1 列表示1 個樣本，下方為樣本名稱，上方藍色表示健康受試者，粉色表示UC患者；每1行表示1個基因在不同樣本的差異，紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黑色表示無明顯差異基因；左側連線表示差異基因的聚類模式）。

圖2 差異表達基因火山圖

圖3 差異倍數排名前10的基因熱圖

3.3 UC 與鐵死亡的交集基因將篩選得到的1355 個UC 差異表達基因與60 個鐵死亡相關基因進行映射，得到8個交集基因，見圖4及表3。

表3 UC與鐵死亡的交集基因

圖4 Venn圖

3.4 PPI 網絡的構建及可視化分析將交集基因導入STRING 數據庫，物種選擇人類，最低置信度設為0.04，構建PPI 網絡。由圖5 可知，CD44 可能是細胞鐵死亡干預UC進展的核心基因。

圖5 PPI圖

3.5 中藥治療預測設置P＜0.01 為篩選標準，通過Coremine 數據庫預測具有潛在調控細胞鐵死亡防治UC 效用的中藥，除ACSF2 映射不出相關中藥外，其余7 個基因均可映射出相關中藥，共得到69 味中藥。將結果導入Cytoscape軟件進行可視化分析，見圖6。該網絡中黃芩、三百草、牡丹皮、人參、生姜、干姜、五味子、丹參、木香、三七的度值較高，提示與調控細胞鐵死亡防治UC 的關系最密切。將預測得到的中藥進行歸經、功效歸納，如圖7—8 所示。與UC 鐵死亡相關中藥多歸脾經、胃經，且多屬于清熱、補虛、活血類。

圖6 預測中藥可視化

圖7 中藥歸經

圖8 中藥功效

4 討論

鐵死亡是在研究小分子愛拉斯汀（erastin）殺死含有致癌基因RAS 突變的腫瘤細胞的作用機制時被發現的［14-17］。盡管鐵死亡最早是在癌細胞中被發現，但其已被證明對多種系統疾病具有重要意義，例如神經系統疾病［18］、泌尿系統疾病［19］、心血管疾病［20］等。值得提出的是，在鐵死亡尚未被發現時，已有許多研究表明，鐵離子和ROS 可以通過腸道黏膜影響UC 的發生發展［21-22］。然而，鐵離子和ROS損傷機制尚未十分明確。XU等［23］研究發現，在人類UC和UC模型小鼠中均可以觀察到結腸黏膜中線粒體萎縮、細胞死亡增加、鐵及ROS 被上調，與鐵離子轉運相關的基因轉錄也明顯增加；表明鐵死亡通過內質網應激介導腸上皮細胞死亡，從而促進UC的發展。

本研究通過對健康受試者和UC患者的結腸組織基因表達進行差異分析，共獲得差異表達基因1355個，其中上調基因796個，下調基因559個。經過檢索常用的中文和英文數據庫，獲得60個鐵死亡相關基因；與鐵死亡相關的UC 差異表達基因共8個，分別是CD44、DPP4、LPCAT3、PTGS2、SLC7A11、ABCC1、HMOX1、ACSF2，其中CD44 在PPI 網絡中度值最高，表明其可能是鐵死亡參與UC 的核心基因。CD44又稱人類白細胞黏附分子，是一種跨膜受體糖蛋白，介導細胞-細胞、細胞-基質間的相互作用，參與了細胞增殖、遷移、血管生成等［24］。在UC的進展中，CD44作為潛在的協調刺激分子，招募免疫細胞的聚集、參與T細胞的活化介導慢性炎癥的持續發生［25］。對于鐵死亡而言，GPX4是介導的關鍵蛋白。值得思考的是，GPX4活性的抑制不僅是由于ROS來源增多而導致，細胞不能正常催化ROS也可能是導致代謝障礙的原因［5］。亞單元SLC7A11的表達下調導致胞內胱氨酸水平的降低，谷胱甘肽生物合成的缺失，間接導致GPX4的活性被抑制，進而激活鐵死亡［26］。LIU 等［27］研究表明，CD44 通過干預亞單元SLC7A11的穩定性，從而調控細胞鐵死亡。

UC屬于中醫學“痢疾”等范疇。根據中醫診療專家共識［28］，UC多因虛實夾雜導致，系由脾胃虛弱，運化失司，水濕內停，瘀血阻滯，日久化而為熱、為火，濕熱內生而成痢疾。本研究預測的中藥多歸脾經、胃經，藥物功效多屬于清熱類、補虛類、活血類，這進一步說明了此次研究結果符合UC的中醫病機。通過軟件對預測得到的中藥進行拓撲分析，發現黃芩、三百草、牡丹皮、人參、生姜、干姜、五味子、丹參、木香、三七等中藥在調控細胞鐵死亡防治UC的過程中處于核心地位。黃芩歸心、肺、膽、大腸經，具有清熱、瀉火、祛濕、解毒等功效，常被用于治療濕熱瀉痢。徐薇涵等［29］研究表明，黃芩素通過調控熱休克蛋白70參與結腸黏膜上皮細胞的修復、機體免疫功能的調節，在治療UC中發揮抗炎作用。人參、生姜、干姜均具有健脾功效，用四君子湯治療UC亦收獲良效［30］。牡丹皮、丹參、三七均具有活血功效。便血是活動性UC患者的常見并發癥。別彩娟［31］以芪仙湯治療UC，有效率高達96.77%。本研究預測的中藥多屬于清熱類、補虛類、活血類，這不僅與UC的中醫病機高度符合，而且不少研究也表明以清熱法、補虛法、活血法治療UC可收獲良效。

綜上所述，本研究通過生物信息學篩選鐵死亡參與UC的核心基因，為探索UC新治療策略提供方向。本研究通過Coremine 數據庫篩選具有調控細胞鐵死亡防治UC效用的中藥，為探索UC新治療策略提供選擇。但本研究存在一定的局限性：1）樣本量有限，可能存在基因表達偏倚；2）可能將生理性差異基因納入病理性差異基因；3）鐵死亡相關基因是課題組檢索獲得，可能存在遺漏，且目前關于鐵死亡基因的研究較少，這同樣可能存在偏倚；4）通過Coremine 數據庫預測潛在的治療中藥，但部分中藥在UC中缺乏實驗研究證實。