飛龍掌血對膠原誘發關節炎大鼠心血管損害的干預作用及機制Δ

李月興，陳波洋，李 倩，陳 帥，陳云志 （貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴陽 550025）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，除累及關節外，還涉及血管炎、心臟病、類風濕結節等眾多關節外表現[1]。臨床數據顯示，多數RA 患者兼有包括動脈粥樣硬化、心肌梗死等在內的心血管并發癥，故死亡風險較高[2]。中性粒細胞是RA患者關節滑液中含量較高的免疫細胞，在受炎癥因子、活性氧等異物刺激后，可活化為中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs作為一種被瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等顆粒蛋白修飾的DNA網狀物，有助于機體炎癥的控制；但當體內NETs含量過高時，跟隨其釋放到細胞外的組蛋白和蛋白酶等會加劇RA患者的免疫紊亂，并破壞內皮細胞，從而造成循環系統損害[3]。

維生素D（vitamin D，VD）是體內磷鈣代謝的關鍵信號分子，可在RA 等多種自身免疫性疾病中發揮免疫調節作用。25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]是VD的血清標志物，可在25-羥基維生素D-1α羥化酶（25-hydroxyvitamin D-1α-hydroxylase，CYP27B1）的催化下轉化成VD的主要活性形式--1α，25-二羥基維生素D3[1α，25-dihydroxy-cholecalciferol，1α，25（OH）2D3]，與維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）結合，參與炎癥控制、心血管保護等生物學過程[4]。研究顯示，血清VD 水平與RA、心血管疾病的發病風險呈負相關[5-6]；補充VD 可延緩RA 的進展，并可通過抑制NETs 關鍵酶--還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的形成而起到保護血管內皮的作用[5-7]。

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血Toddaliaasiatica（L.）Lam.的干燥根皮，是我國貴州、云南等地的常用民族藥材。該藥性溫，味辛、微苦，可散瘀止血、祛風除濕、消腫解毒，常用于治療風濕痹癥[8]。研究表明，飛龍掌血能通過平衡調節性T 細胞和輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）的表達來調控白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等炎癥及氧化應激指標的分泌/表達，從而發揮對關節炎及相關心血管疾病的改善作用[9-11]。有研究指出，Th17、IL-17、MCP-1、SOD 等炎癥、氧化應激指標編碼基因的表達與VD、NETs存在一定的關聯[12-14]，但飛龍掌血能否通過VD 和NETs 來調控RA 患者相關炎癥、氧化應激指標的分泌/表達，進而影響其心血管損害的作用過程尚不明晰?；诖耍狙芯繑M從VD和NETs的角度出發，初步探討飛龍掌血對膠原誘發關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠心血管損害的干預效果及潛在機制，以期為飛龍掌血在RA 并發癥中的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Multiskan MK3 型酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-7C 型電泳儀電源、DYCZ-24DN 型垂直電泳槽均購自北京六一儀器廠；RM2016 型輪轉式切片機購自德國Leica公司；JB-P5型包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；BX53 型生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要藥品與試劑

飛龍掌血藥材（批號210301）購自貴陽市德昌祥藥房，由貴州中醫藥大學藥學院蔣志濱副教授鑒定為蕓香科植物飛龍掌血T.asiatica（L.）Lam.的干燥根皮。甲氨蝶呤片（陽性對照藥，批號036210906，規格2.5 mg）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；牛Ⅱ型膠原（貨號L22S11C125306）購自上海源葉生物科技有限公司；弗氏不完全佐劑（貨號SLCH4885）購自美國Sigma-Aldrich公司；VD 滴劑（通路驗證試劑，批號129214211，規格為每粒含VD3400 單位）購自國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司；MPO、IL-6、25（OH）D3酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ML-E-20221022710、MLE-20221023761、ML-E-20221022898）均購自上海酶聯生物科技有限公司；兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號AB-P-R001）購自杭州賢至生物科技有限公司；兔CYP27B1、MPO 多克隆抗體（批號分別為PB0577、BA0544）均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔CitH3多克隆抗體、兔VDR單克隆抗體（批號分別為NB100-57135、NBP2-66778）均購自美國Novus Biologicals 公司；兔IL-6 多克隆抗體（批號DF6087）購自美國Affinity公司；兔肽?；彼崦搧啺泵?（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）單克隆抗體（批號ab214810）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG 二抗（批號A0208）購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用實驗動物為8 周齡的SPF 級雌性SD 大鼠（70只），體重為（200±10）g。所有動物均購自并飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所，動物生產許可證號為SCXK（黔）2021-0003。本實驗方案經貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會批準，編號為20210100。

2 方法

2.1 飛龍掌血藥液的制備

取飛龍掌血藥材，共3 份，分別以8 倍水浸泡0.5 h后，煎煮30 min×2 次；合并提取液，過濾，濃縮，得質量濃度分別為0.054、0.108、0.216 g/mL（以生藥量計）的藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為正常組（9只）和造模組（61只）。取造模組大鼠，按如下方法[15]造模：將牛Ⅱ型膠原用乙酸溶解制成膠原溶液（2 mg/mL）后，與弗氏不完全佐劑等體積混合，制得膠原乳液。于實驗第0天在大鼠背部、尾根部和雙足進行多點注射（每處0.1 mL），即初次免疫；于第7 天在其背部、尾根部不同部位再次注射（每處0.1 mL），即二次免疫。于造模后（第8 天）隨機選擇數只大鼠進行關節炎指數評分--無皮膚發紅和關節腫脹癥狀，記0 分；腳踝或足部輕微發紅、腫脹，記1 分；腳踝和足部均輕微發紅、腫脹，記2分；腳踝和跖骨關節中度發紅、腫脹，記3分；全足嚴重發紅、腫脹，記4分；尾部紅斑和前肢腫脹各記0.5 分；總分為5 分，評分大于4 分則判定為CIA模型復制成功[16]。

將造模成功的54只大鼠隨機分為模型組，甲氨蝶呤組（陽性對照，1.5 mg/kg，每周2次，劑量參考相關文獻[17]設置），VD組[通路驗證，1 000單位/（kg·d），每天1次，劑量參考相關文獻[18]設置]，飛龍掌血低、中、高劑量組[0.54、1.08、2.16 g/（kg·d），以生藥量計，每天1 次，劑量參考成人臨床常用劑量并根據大鼠體表面積折算而得，中劑量為臨床等效劑量]，每組9只。各藥物組大鼠灌胃相應藥液，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水（每天1次），連續4周。

2.3 大鼠足跖腫脹情況觀察及取材

造模后，于給藥前對各組大鼠進行關節炎指數評分，并分別于給藥前和末次給藥后用游標卡尺測量大鼠右后肢足跖厚度。測量結束后，以1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取其腹主動脈血，靜置后以3 000 r/min 離心15 min，收集上層血清，于-80 ℃下保存，備測。取血后，處死各組大鼠，快速收集其左后肢踝關節組織，以4%多聚甲醛固定，右后肢踝關節于-80 ℃下保存，備測；取大鼠心臟組織，橫切一分為二，上部于-80 ℃下保存，下部以4%多聚甲醛固定，備測；取大鼠腹主動脈組織，以4%多聚甲醛固定，備測。

2.4 大鼠踝關節、心臟及腹主動脈組織的病理學觀察

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察。取“2.3”項下每組5只大鼠以4%多聚甲醛固定的踝關節組織適量，脫鈣后依次以75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，經石蠟包埋后切片，再依次用蘇木精、伊紅染色，經二甲苯透明后，以中性樹膠封片，使用顯微鏡對其踝關節進行組織形態學觀察及圖像采集。

取“2.3”項下每組5只大鼠以4%多聚甲醛固定的心臟和腹主動脈組織各適量，按前述方法脫水、包埋、切片、染色、透明后封片，使用顯微鏡對其心臟及腹主動脈進行組織形態學觀察及圖像采集。

2.5 大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量檢測

采用ELISA 法檢測。隨機選取每組5 只大鼠凍存的血清樣本，按照相應試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀檢測其血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量。

2.6 大鼠心臟組織中PAD4、VDR蛋白表達水平檢測

采用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測。取“2.4”項下每組3只大鼠的心臟組織切片，經枸櫞酸抗原修復溶液孵育15 min 后，以山羊血清封閉，滴加PAD4、VDR 一抗（稀釋比例均為1∶100），于4 ℃下孵育過夜；用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入相應二抗，室溫孵育30 min；再次清洗后，以DAB 顯色液顯色，再以Mayer’s 蘇木精復染，經乙醇梯度脫水后，以二甲苯透明，風干后封片，使用顯微鏡進行觀察。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對IHC 圖進行光密度分析，計算陽性區域（即黃褐色或棕褐色區域）的平均光密度用以表示PAD4、VDR蛋白的表達水平。

2.7 大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1 蛋白表達水平檢測

采用Western blot 法檢測。取“2.3”項下每組3 只大鼠的凍存心臟組織，解凍后剪取適量，用含PMSF 的裂解液勻漿后，于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液，使用BCA法測定蛋白濃度并作變性處理。取變性蛋白適量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓依次為80、120 V）分離并轉膜（電流為200 mA），用脫脂奶粉封閉；洗膜后，加入CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶600），室溫孵育2 h；洗膜后，加入化學發光試劑進行顯影并成像。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析。所有數據均以±s表示，符合正態分布數據的多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布數據的多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 飛龍掌血對CIA模型大鼠足跖腫脹度的影響

正常組大鼠四肢未見明顯紅腫。與正常組比較，大鼠在造模完成后足跖腫脹明顯，關節炎指數評分和足趾厚度均顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，經藥物干預后，甲氨蝶呤組、飛龍掌血中劑量組大鼠的足跖厚度均顯著減少（P＜0.01）；VD組大鼠的足趾厚度雖有所減少，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1、圖1。

圖1 各組大鼠的足部照片

表1 各組大鼠關節炎指數評分和足跖厚度比較（±s，n＝9）

表1 各組大鼠關節炎指數評分和足跖厚度比較（±s，n＝9）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組關節炎指數評分0 4.44±0.30a 4.50±0.25a 4.39±0.33a 4.56±0.30a 4.50±0.25a 4.33±0.25a給藥前足跖厚度/mm 3.05±0.36 5.94±0.61a 5.98±0.23a 5.00±0.46a 5.64±0.62a 5.75±0.80a 5.34±0.41a末次給藥后足跖厚度/mm 3.45±0.21 4.89±0.36a 4.11±0.37b 4.64±0.25 4.89±0.48 4.33±0.31b 4.58±0.32

3.2 飛龍掌血對CIA模型大鼠踝關節、心臟、腹主動脈組織病理形態的影響

3.2.1 踝關節組織

正常組大鼠踝關節滑膜組織結構清晰完整；模型組大鼠踝關節組織襯里下層可見明顯的炎癥細胞（以淋巴細胞為主）浸潤和纖維組織增生（以成纖維細胞、纖維細胞增多為主）；甲氨蝶呤組和VD組大鼠襯里下層的炎癥細胞浸潤較模型組明顯減少，飛龍掌血各劑量組大鼠的上述癥狀較模型組有不同程度好轉，且以中劑量組效果最佳（僅在襯里下層觀察到極少量炎癥細胞浸潤和纖維組織增生）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠踝關節組織病理學觀察的顯微圖（HE染色）

3.2.2 心臟組織

正常組大鼠的心肌纖維走向明確，排列整齊；模型組大鼠有極少的心肌纖維排列紊亂，可見明顯的組織空泡和部分周圍血管壁增厚；各藥物組大鼠心臟組織的上述損傷有不同程度減輕，且以甲氨蝶呤組和飛龍掌血中劑量組效果較佳。結果見圖3。

圖3 各組大鼠心臟組織病理學觀察的顯微圖（HE染色）

3.2.3 腹主動脈組織

正常組大鼠腹主動脈內皮完整，結構清晰；模型組大鼠腹主動脈組織可見內皮脫落；甲氨蝶呤組、飛龍掌血各劑量組大鼠腹主動脈組織可見不同程度的內皮脫落、中膜增厚、彈性纖維斷裂，而VD 組大鼠則未見上述改變。結果見圖4。

圖4 各組大鼠腹主動脈組織病理學觀察的顯微圖（HE染色）

3.3 飛龍掌血對CIA 模型大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中MPO、IL-6 含量顯著升高，25（OH）D3含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，VD 組、飛龍掌血中劑量組大鼠血清中MPO 含量，以及各藥物組大鼠血清中IL-6 含量（飛龍掌血低劑量組除外）均顯著降低，各藥物組大鼠血清中25（OH）D3含量（飛龍掌血低劑量組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量比較（±s，n＝5）

表2 各組大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量比較（±s，n＝5）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較；P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組MPO/（ng/mL）128.48±8.45 177.88±11.88a 126.39±25.19 112.94±22.87c 159.10±28.57 119.07±20.37c 137.55±24.09 IL-6/（pg/mL）121.84±21.70 174.63±21.19a 115.80±29.06b 121.99±21.79b 152.42±22.92 125.68±21.43b 113.19±18.82b 25（OH）D3/（ng/mL）37.75±2.79 17.96±3.70a 30.54±5.13c 31.80±5.99b 22.74±3.22 30.51±6.36c 28.78±4.19c

3.4 飛龍掌血對CIA模型大鼠心臟組織中PAD4、VDR蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中PAD4 蛋白的表達顯著增強（P＜0.01），而VDR 蛋白的表達略有上調，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血高劑量組大鼠心臟組織中PAD4 蛋白的表達均顯著減弱，而甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中VDR 的表達均顯著增強（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖5～圖7。

圖5 各組大鼠心臟組織中PAD4蛋白表達的顯微圖（IHC法）

圖6 各組大鼠心臟組織中VDR蛋白表達的顯微圖（IHC法）

圖7 各組大鼠心臟組織中PAD4、VDR 蛋白表達水平比較（±s，n＝3）

3.5 飛龍掌血對CIA 模型大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01），CYP27B1 的表達水平雖有降低但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，VD組、飛龍掌血高劑量組大鼠心臟組織中CitH3蛋白的表達水平，以及甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中MPO、IL-6 蛋白的表達水平均顯著降低，而VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中CYP27B1 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖8、表3。

表3 各組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達水平比較（±s，n＝3）

表3 各組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達水平比較（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較；P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組CitH3/GAPDH 0.102±0.009 0.748±0.050a 0.273±0.022 0.205±0.009b 0.664±0.048 0.504±0.096 0.259±0.024c MPO/GAPDH 0.135±0.058 0.742±0.015a 0.314±0.089b 0.297±0.158b 0.579±0.059 0.492±0.107b 0.283±0.115b IL-6/GAPDH 0.082±0.011 0.758±0.070a 0.217±0.041b 0.291±0.073b 0.634±0.074 0.483±0.058b 0.264±0.060b CYP27B1/GAPDH 0.258±0.013 0.109±0.024 0.429±0.021 0.769±0.022b 0.247±0.026 0.745±0.048b 0.584±0.109c

4 討論

心血管系統作為血液信號的直接接收者，對RA 患者慢性炎癥和自身免疫性抗體顯著上調的血液環境極其敏感并能最先作出反饋，故心血管系統是RA 患者主要的關節外受累系統，心血管疾病也是RA 患者主要的關節外表現之一[19]。飛龍掌血作為經典苗藥，是治療RA的常用藥?，F代藥理研究表明，其能通過抗炎、抗氧化、調節血脂和改善心臟舒縮功能等多個途徑來保護心血管[10-11]。本研究通過足跖厚度和HE 染色觀察發現，與正常組比較，大鼠在造模完成后足跖腫脹明顯，關節炎指數評分和足趾厚度均顯著增加，關節組織襯里下層可見明顯的炎癥細胞浸潤和纖維組織增生，心臟組織中有明顯的組織空泡和部分周圍血管壁增厚，腹主動脈組織可見內皮脫落，提示CIA 模型復制成功，且大鼠存在一定的心臟損害；經飛龍掌血干預后，大鼠踝關節組織、心臟組織的上述病理改變均有不同程度減輕，且以中劑量組干預效果最佳，但腹主動脈內皮脫落等現象依然存在，提示飛龍掌血能改善RA及相關心臟損害，但同樣能誘使腹主動脈產生一定的應激反應；此外，由于中劑量為臨床等效劑量，處于最佳療效窗口，故干預效果較其他劑量更好。

RA患者心血管并發癥的發生風險較普通人群高了2 倍，而NETs 介導慢性低度炎癥可能是RA 患者心血管并發癥風險增加的主要原因之一[2]。研究指出，PAD4蛋白可瓜氨酸化中性粒細胞的核內組蛋白，是RA 患者NETs 形成的主要途徑之一；同時，PAD4 蛋白介導的瓜氨酸化可在RA 患者的心肌間質內進行，并誘發進行性心肌功能障礙[20]。當NETs釋放后，CitH3蛋白可成為抗環瓜氨酸肽抗體（RA 特異性抗體）的靶標，從而加強機體自身免疫反應；此外，CitH3、MPO等NETs相關蛋白可破壞細胞膜完整性和細胞間連接，從而直接損傷血管內皮；MPO蛋白還可成為自身抗原而引發抗中性粒細胞胞質抗體相關性血管炎；NETs 還可出現在血栓部位而加重血栓形成，造成機體局部缺血[3，21-22]。IL-6作為一種經典的促炎因子，在心肌梗死部位呈高表達，是心臟損害的常見炎癥因子[23]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中MPO、IL-6 含量明顯增高，心臟組織中PAD4、CitH3、MPO、IL-6 蛋白的表達水平亦顯著升高；經各劑量飛龍掌血干預后，上述指標得到不同程度的改善，提示飛龍掌血可減少NETs 形成及炎癥反應，具有改善CIA 模型大鼠心臟損傷的作用。

VD 信號存在于NETs 形成途徑的上游，但RA 患者的VD 水平普遍較低[6]。研究發現，心肌細胞可表達CYP27B1蛋白，后者可催化1α，25（OH）2D3的局部轉化；而在正常生理條件下，1α，25（OH）2D3信號被VDR 蛋白接收后可形成VDR-1α，25（OH）2D3復合物，參與受體細胞基因轉錄的調控[24]，故心臟組織中VDR的缺乏是導致心臟肥大的原因之一。低水平25（OH）D3是血管內皮功能異常、動脈粥樣硬化等心血管疾病發生的獨立危險因素[25]，VD缺乏者易發生左心房纖維化，且具有較高的心房顫動發生風險[26]。本研究通過檢測VD 相關指標發現，與正常組比較，模型組大鼠血清中25（OH）D3含量顯著降低，心臟組織中CYP27B1、VDR蛋白的表達水平雖略有變化但差異均無統計學意義；經不同劑量的飛龍掌血干預后，上述指標均有不同程度的改善，提示飛龍掌血能通過調控VD 代謝途徑來改善RA 相關心臟損害。同時，本研究設置了VD 組，意在驗證VD 與NETs 的上下游關系，結果顯示，補充VD 后，大鼠體內PAD4、CitH3、MPO、IL-6蛋白的表達均受到抑制，提示VD處于NETs上游，可調控NETs的形成。

綜上所述，飛龍掌血可通過抑制NETs 的形成及炎癥反應的發生來改善RA 癥狀及相關心臟損害，其機制可能與調節VD 水平有關。但VD 和NETs 兩者間的具體調控機制尚未闡明，本課題組將進行相關實驗設計以進一步探討其中關系。