可再分散甲殼素納米纖維的制備及其在穩定Pickering乳液中的應用

董同珺，魏孔菊，雙 媛，丁貝貝，王學東，丁文平

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

由固體顆粒穩定的乳液被稱為Pickering乳液[1]。與由表面活性劑或聚合物穩定的傳統乳液相比，Pickering乳液表現出優異的抗聚結穩定性、高內相比例、刺激響應性和調節脂質消化等優勢，將其引入食品中可大大提高乳液體系的安全性和穩定性，因此，吸引了越來越多科研工作者的關注[2-3]。常見無機顆粒如二氧化硅或改性二氧化硅粒子是優良的Pickering乳液穩定劑，但它們難以被生物降解，在食品領域的應用受到很大限制[2,4]。目前，開發一種能夠有效穩定乳液且安全可食用的穩定劑仍然是一個挑戰。

甲殼素是自然界中含量僅次于纖維素的可再生天然多糖，廣泛存在于蝦、蟹及其他甲殼類動物的外骨骼中，具有良好的生物相容性和生物可降解性[5]。近年來，蝦、蟹作為經濟價值較高的甲殼類動物，產業發展迅速，與之同時產生的廢棄蝦、蟹殼數量也逐年增加。蝦、蟹殼的浪費既給環境帶來負擔，又造成生物質資源的浪費[6-7]。目前，甲殼素因具有良好的生物相容性、生物可降解性及獨特的生物活性，在食品領域引起越來越多的關注[8]。已有研究表明，甲殼素及其衍生物具有抑菌和抗菌作用且易于成膜，在果蔬、冷凍肉保鮮和食品包裝膜等方面有廣泛的應用前景[9-10]，同時，甲殼素還具有降血壓、降血脂、改善腸胃功能、調節機體免疫等功效，能在保健食品領域發揮重要作用[11]。此外，甲殼素分子鏈上含有大量的—OH和—NHCOCH3，具有良好的雙親性，易于改性。甲殼素納米纖維（chitin nanofibers，ChNFs）是由甲殼素制備得到的一維納米材料，不僅有甲殼素的優良性質，還具有高的比表面積、結晶度和模量，是一種極具發展前景的食品級Pickering乳化劑[12-14]。

已有研究表明，ChNFs和甲殼素納米晶能有效穩定O/W型Pickering乳液。Tzoumaki[15]和Zhou Hualu[16]等已經分別證明ChNFs可吸附到油水界面并形成O/W型Pickering乳液。同時ChNFs可以產生強靜電和空間排斥力，這使其可以有效穩定Pickering乳液并防止液滴聚結[17]。Torlopov等[18]以甲殼素納米晶為水相，橄欖油為油相，制備O/W型Pickering乳液用于保護遞送VD3，發現其乳液穩定性、流變學特性均有改善并能在消化系統上部保存微滴。還有研究者比較了ChNFs和甲殼素納米晶對葵花籽油乳液的穩定性，發現在相同濃度下，ChNFs表現出更好的穩定O/W乳液能力，而且這些納米材料均沒有細胞毒性[19]。此外，研究者們更多地選擇將表面存在陽離子基團的ChNFs與其他納米粒子如纖維素、玉米醇溶蛋白等聯合，形成復合物一起作為乳化劑用于穩定Pickering乳液[20-21]。

基于此，本研究將甲殼素進行純化、部分脫乙酰化及羧甲基化處理后得到同時帶有氨基和羧基的ChNFs，表征其結構并將其作為乳化劑應用于穩定Pickering乳液，結合流變學特性、激光共聚焦顯微鏡等對乳液穩定性進行評估，觀察其貯藏穩定性及對pH值的適應能力。以期在食品和生物技術領域用于保護和遞送生物活性物質，尤其是對pH值敏感的物質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲殼素購自浙江金殼藥業股份有限公司。實驗過程中所用試劑由國藥控股股份有限公司提供，均為分析純。實驗過程中所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Dimension ICON原子力顯微鏡 德國Bruker公司；JEM-2200 FS透射電子顯微鏡 日本JOEL公司；Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，FT-IR）儀 美國Thermo Nicolet公司；Empyrean型X射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；Zetasizer Nano ZS90型納米粒度儀 英國Malvern公司；DHR-2型多功能流變儀 美國TA公司；FV1200型激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 ChNFs的制備

參考文獻[22]的方法對甲殼素原料進行純化，干燥并置于干燥器中以便進行后續實驗。甲殼素部分脫乙酰化的方法參考文獻[23-24]并稍作修改。將純化好的甲殼素粉末加入到質量分數33%氫氧化鈉溶液中，然后加入質量分數0.3%硼氫化鈉，在90 ℃條件下水浴加熱2 h實現甲殼素的部分脫乙酰化。隨后將部分脫乙酰化甲殼素（deacetylated chitin，DE-chitin）粉末加入到體積比為1∶4的水和異丙醇混合溶液中，之后加入質量分數13%氫氧化鈉溶液，50 ℃水浴加熱1 h，將15 g氯乙酸溶解于20 mL異丙醇溶液中，緩慢滴加至上述反應體系中，保持反應溫度不變繼續反應4 h，隨后加入乙醇停止反應同時除去粗產物中的鹽和水。利用細胞破碎儀在50%功率下冰浴處理5 min，6 000 r/min離心15 min后所得離心管上層淡藍色懸浮液即為ChNFs懸浮液。將制得的ChNFs干燥后再次加入到超純水中，經超聲處理后即得再分散甲殼素納米纖維（redispersible ChNFs，RE-ChNFs）懸浮液。

1.3.2 Pickering乳液的制備

分別將0.1%～2.0%新制備的ChNFs懸浮液與液體石蠟按體積比9∶1混合，利用高速剪切機在10 000 r/min條件下剪切2 min，再利用高壓微射流儀對混合溶液處理2 次，即得由不同質量分數ChNFs穩定的Pickering乳液。

1.3.3 理化特性表征

1.3.3.1 原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）觀察

利用AFM在掃描模式下對ChNFs和RE-ChNFs的形貌進行表征。分別在新切割的云母片上旋涂1 滴稀釋的ChNFs和RE-ChNFs水分散液，并在室溫干燥過夜，ChNFs的長度和寬度是利用Nano Measurer 1.2軟件通過計數至少100 個納米纖維測量。

1.3.3.2 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察

利用TEM對ChNFs和RE-ChNFs的形貌進行表征。分別將稀釋好的ChNFs和RE-ChNFs水分散液滴在銅網上，用濾紙除去多余液體，然后用質量分數1%磷鎢酸鈉染色，最后通過蒸發自然干燥，將得到的樣品放置在透射儀器內進行觀察并成像，設置加速電壓為200 kV。

1.3.3.3 FT-IR和X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）測定

甲殼素原料、純化甲殼素（purified chitin，PUchitin）、DE-chitin干燥后剪成粉末，粉末狀樣品與KBr以1∶100的質量比混合，充分研磨并壓制成薄片，用FT-IR測定。測試范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32 次。此外，為了使ChNFs表面的羧基特征峰更加明顯，將新制備的ChNFs水分散液常壓干燥成膜，經酸處理再洗滌至中性后測試。

將新鮮制備的ChNFs冷凍干燥并剪成粉末以便開展測試。XRD測試條件：反射法，Cu靶（λ＝1.54 ?），設置掃描速率為5°/min，掃描步長為0.02，掃描范2θ為5°～40°。

1.3.3.4 粒徑和Zeta電位測量

利用納米粒度儀測量ChNFs及RE-ChNFs水分散液的粒徑及Zeta電位。測試前用去離子水對分散液進行稀釋，以消除多重散射效應的影響。

1.3.3.5 流變學特性

利用多功能流變儀來測定乳液的流變學特性。將由不同濃度ChNFs穩定的乳液滴加在兩塊間距為1 mm、直徑為40 mm的平板中間，用刮刀刮掉周圍多余液體，隨后蓋上涂有礦物油的蓋子。在振蕩模式下進行頻率掃描，記錄乳液的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）。其中測試溫度為25 ℃，頻率為0.1～100 Hz，掃描應變為1%。在剪切速率為0.01～100 s-1的范圍內測試乳液的剪切黏度，測試溫度保持在25 ℃。

1.3.3.6 激光共聚焦掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）

使用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和尼羅紅對乳液進行染色，以異丙醇為溶劑配置1 mg/mL的FITC和尼羅紅溶液置于5 mL離心管中，在另一個裝有1 mL Pickering乳液的5 mL離心管中加入20 μL FITC溶液和10 μL尼羅紅溶液，混勻后室溫靜置24 h，取10 μL染色后的乳液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片后使用CLSM觀察乳液的微觀形態，激發波長為488 nm和543 nm。

1.3.3.7 乳液穩定性

貯藏穩定性：將制備好的由不同濃度ChNFs穩定的Pickering乳液置于室溫貯藏，并選取貯藏時間，觀察乳液的穩定情況。參照Lee等[25]方法測定乳析指數（emulsifying index，EI），EI按下式計算：

式中：H乳液為乳液的高度/cm；H全部為所有相（乳液、添加的ChNFs及連續相）的總高度/cm。

pH值穩定性：新鮮制備的乳液的pH值通過添加0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液進行調節，所得不同pH值的乳液在室溫放置24 h后觀察乳液的穩定情況。

1.4 數據統計與分析

數據采用OriginPro 9.0軟件繪制圖形。利用SPSS 19.0進行數據分析，運用方差分析法進行顯著性分析，部分實驗結果采用表示。

2 結果與分析

2.1 ChNFs和RE-ChNFs的形態表征

圖1A分別為ChNFs和RE-ChNFs水分散液的AFM圖像，可以清楚地看到單個納米甲殼素的纖維形態。不僅如此，新鮮制備及再分散的納米甲殼素在水介質中分散良好，均沒有出現聚集現象。利用圖像處理軟件分別對2 種納米纖維的長度和寬度進行統計學分析，結果分別如圖1B、C所示，再分散前后ChNFs的平均長度分別為271.2 nm和295.4 nm，平均直徑分別為39.4 nm和44.5 nm，長徑比分別約為6.9和6.7，較低的長徑比也符合α-甲殼素“短胖”的形態。此外，在AFM圖像中還觀察到有少許較短的物質存在。Bai Long等[24]對部分脫乙酰的α-甲殼素進行超聲處理，結果發現，當超聲功率相同時，未經超聲處理、超聲處理20 min和40 min所得的ChNFs的長徑比分別約為≥60、15和25。Wang Yuntao等[26]根據再生ChNFs的TEM圖像及水分散液的透光率發現在超聲時間從10 min增加到60 min的過程中，分散的甲殼素的平均尺寸從1 183 nm減小至670.9 nm，并且樣品的透光率也隨之升高，同樣顯示分散液中有小顆粒物質的存在[27]，這些結果均可理解為更多的能量輸入會將甲殼素降解為更小的顆粒。與這些研究結果不同的是，制備得到的ChNFs懸浮液及再分散懸浮液中納米纖維的尺寸變化不大，這可能是由于在制備過程中超聲處理時間較短，對甲殼素尺寸的影響不大，甚至可以忽略不計。

圖1 ChNFs和RE-ChNFs的AFM圖（A）和尺寸分布直方圖（B、C）Fig.1 AFM images (A) and size distribution (B,C) of ChNFs and RE-ChNFs

圖2A為再分散前后ChNFs水分散液在相同濃度下的外觀。結果表明，當水分散液中甲殼素濃度相同時，新鮮制備的ChNFs與RE-ChNFs水分散液的透光性差別不大，即濁度相近。經干燥除去分散介質得到的ChNFs只要再通過簡單的超聲處理就可重新分散在水介質中，且與新鮮制備的樣品相比，除去分散介質后再次分散的過程并不會對ChNFs的分散性產生影響，這主要是由于甲殼素在濃堿和羧甲基化試劑處理之后，大大削弱了分子內和分子間的氫鍵作用。

圖2 ChNFs和RE-ChNFs懸浮液的外觀（A）和TEM圖像（B）Fig.2 Visual appearance (A) and TEM images (B) of ChNFs and RE-ChNFs suspension

AFM和TEM結果（圖2B）表明，利用氯乙酸處理DE-chitin能得到可再分散納米甲殼素，并且，冷凍干燥除去水分散介質及再分散時超聲處理的過程對納米甲殼素的長度和寬度影響不大，說明再分散過程中的冷凍干燥和短暫的超聲處理并不會影響甲殼素的形態。

圖3A所示為新鮮制備和再分散ChNFs懸浮液的粒徑分布，測量前用超純水適當對懸浮液進行稀釋處理，避免多散射現象的影響。結果表明，新鮮制備和再分散ChNFs懸浮液的粒徑分布基本相同，說明再分散過程并未對甲殼素的形態造成太大影響。這與AFM和TEM所得到的結論一致。由圖3B可知，ChNFs懸浮液在pH 7條件下的Zeta電位值為-（38.1±1.2）mV，其絕對值大于30，且多分散性指數（polydispersity index，PDI）為0.380，證明粒徑分布均勻。此外，由粒徑分布強度可知，所制得ChNFs與RE-ChNFs懸浮液尺寸均比較均一，粒徑范圍較小，這與所測得較小的PDI值吻合。

圖3 ChNFs和RE-ChNFs懸浮液粒徑（A）及不同pH值ChNFs的Zeta電位（B）Fig.3 Particle sizes of ChNFs and RE-ChNFs suspension (A) andzeta potential of ChNFs at various pH (B)

2.2 ChNFs和RE-ChNFs的結構表征

通過FT-IR及XRD結果確定所制備ChNFs的化學和晶體結構。圖4A為甲殼素原料、PU-chitin、DE-chitin及ChNFs的紅外圖像，圖4B為1 800～1 000 cm-1范圍內的放大圖，可以看出，1 730 cm-1處附近出現一個小峰，此峰是羧基的特征峰，表明在甲殼素分子鏈上成功引入羧基。Fan Yimin[28]和Ma Qinyan[29]等分別利用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基氧化和過硫酸銨處理魷魚骨制備羧基化ChNFs時也得到類似結論，酸處理能使甲殼素表面的羧基電離，使紅外譜圖上羧基的特征峰更加明顯。與甲殼素原料及PU-chitin的結果相同的是，ChNFs的酰胺I鍵在1 660 cm-1和1 621 cm-1處有雙重吸收峰，說明實驗中所用甲殼素的晶體結構為α-晶型，且其晶體結構在整個處理過程中未發生變化[30]。

圖4 甲殼素原料、PU-chitin、DE-chitin和ChNFs的FT-IR（A）及其放大圖（B）Fig.4 FT-IR spectra (A) of chitin,PU-chitin,DE-chitin and ChNFs and their zoom-in images (B)

圖5中XRD結果顯示，4 種甲殼素樣品均在9.4°、12.8°、19.3°、20.8°、23.4°及26.4°處出現衍射峰[22]，分別對應α-甲殼素晶體中的（020）、（021）、（110）、（120）、（130）及（013）晶面[31-32]，這與FT-IR譜圖結果一致。同時FT-IR譜圖及XRD結果表明，在ChNFs的制備過程中，其部分脫乙酰化和羧甲基化均只發生在ChNFs的表面[33-34]。與未經處理的甲殼素相比，在甲殼素純化、部分脫乙酰及羧甲基化的處理過程中，樣品結晶峰的峰值均隨處理過程的增加而逐漸降低，這也表明了甲殼素的分子間氫鍵在處理過程中進一步被破壞[26]。

圖5 甲殼素原料、PU-chitin、DE-chitin和ChNFs的XRDFig.5 XRD profiles of chitin,PU-chitin,DE-chitin and ChNFs

2.3 乳液的流變學特性

已有研究表明，可以通過增稠提高乳狀液的穩定性，用這種方法同樣可以有效提高Pickering乳液的穩定性[35]。當乳液處于凝膠化這一極端情況時可以長期穩定貯存。為了解不同質量分數ChNFs對Pickering乳液穩定性的影響，考察由不同質量分數ChNFs穩定的Pickering乳液樣品的流變行為。圖6A為Pickering乳液的彈性模量（G′）和黏性模量（G″）隨頻率的變化趨勢，可以看出，即使乳液中ChNFs含量在很低的情況下，3 個樣品在低頻區的G′均高于G″，表明這些乳液都表現出明顯的凝膠特性[36]，且當ChNFs質量分數大于1.0%時，所穩定乳液樣品的G′、G″值在低頻區不依賴于頻率的變化。除此以外，ChNFs質量分數為1.0%和2.0%時，穩定的Pickering乳液G′、G″變化趨勢與0.5%時的變化趨勢略有不同，當用來穩定乳液的ChNFs質量分數較低（0.5%）時，G′和G″在較低頻率條件下較低，在較高頻率下相交，這一現象與Xu Baomei等[2]研究結果類似，他們將這一現象歸因于乳液中的物質很少或沒有形成網絡結構。隨著穩定乳液的ChNFs質量分數的增大，乳液的G′和G″逐漸增大，當乳液中ChNFs質量分數為2.0%，乳液的G′和G″值分別約為22 Pa和3 Pa，此時G′值超過G″值7 倍以上，且在0.1～10 Hz的頻率范圍內相對保持不變，這一結果說明此時乳液中的物質形成凝膠狀網絡結構[37]。圖6B所示為Pickering乳液的黏度隨剪切速率的變化趨勢，可以看出，當剪切速率高于0.1 s-1時，3 種乳液樣品均表現出典型的剪切稀化行為，即在低剪切速率下，乳液的剪切黏度都很高；隨著剪切速率的不斷增加，乳液的剪切黏度逐漸減小，這表明乳液網絡可以被較高的剪切速率破壞，同時這一現象也證明所制備的乳液類型屬于水包油型乳液[38]。此外，乳液的表觀黏度隨ChNFs質量分數增加而增加，這可能是由于ChNFs懸浮液連續相的黏度增加導致[30]。

圖6 不同濃度ChNFs穩定乳液的流變學特性Fig.6 Rheological properties of the Pickering emulsions stabilized by ChNFs at various concentrations

2.4 乳液的微觀結構

圖7為ChNFs質量分數為1.0%時穩定的Pickering乳液的CLSM圖像，其中油相用尼羅紅染色，ChNFs用FITC染色，可以看出，在乳液中綠色的ChNFs幾乎占據整個觀察背景區域，呈連續相分布（圖7B），而紅色的石蠟呈現出相對獨立的液滴狀分布（圖7A）。如圖7C所示，在ChNFs的水連續相周圍包圍著獨立分布的油滴，這一現象證實制備的乳液類型為O/W型乳液，也與乳液的流變學測試結果保持一致。

圖7 1% ChNFs穩定Pickering乳液的CLSM圖Fig.7 CLSM images of the Pickering emulsions stabilized by 1.0% ChNFs

2.5 乳液的貯藏穩定性

由圖8A可知，隨著分散液中ChNFs質量分數的增大，ChNFs分散液的光散射增加，即濁度增加[24]。圖8B～F為不同質量分數ChNFs穩定的Pickering乳液在室溫條件下貯藏0、7、14、28 d和90 d的外觀圖片。表1所示為不同乳液樣品在貯藏期間的EI。這些結果表明，0.1%～2.0%的ChNFs在0 d（新鮮制備時）均能有效穩定Pickering乳液，且EI值無顯著差異。此外，當用于穩定乳液的ChNFs質量分數較低時（0.1%、0.2%），樣品在0～7 d的貯藏期內會出現明顯分層，且在3 d乳液底部就可觀察到少量分層并隨著貯存時間的延長，分層現象逐漸明顯。乳液在貯藏后期會表現出相對較低的EI值，盡管它們的EI值較低，但是通過視覺觀察外觀，它們依然是穩定的乳液，這一現象也與之前的報道結果一致[25,39]。與之相反的是，當用于穩定乳液的ChNFs質量分數較高時（0.5%～2.0%），所制備的乳液在整個90 d的貯藏期內均不會出現明顯分層，除0.5% ChNFs穩定的乳液在貯藏后期EI值略有降低外，其他2 個乳液樣品的EI值均能維持在1左右，表明乳化效果良好，乳液具有優異的貯存穩定性，同時也證明制備的ChNFs具有作為乳化劑的潛力。

表1 水包油型Pickering乳液在貯存0、7、14、28 d和90 d的EITable 1 EI of oil/water Pickering emulsions at 0,7,14,28 and 90 days of storage

圖8 不同質量分數ChNFs（A）和ChNFs穩定的Pickering乳液（B～F）的視覺外觀Fig.8 Visual appearance of ChNFs at concentrations (A) and the Pickering emulsions stabilized by ChNFs (B–F)

2.6 pH值對乳液穩定性的影響

pH值對乳液穩定性的影響通常可歸因于表面活性組分中極性基團的電離，因為電離可以引起一定的靜電排斥作用，從而破壞界面的內聚力[40]。目前，大多數具有pH值響應的乳化劑都是無機顆粒或者合成接枝聚合物，但一般情況下這些乳化劑的制備成本較高且對環境不友好。通過部分脫乙酰化處理使得ChNFs表面帶有一定量的氨基，再通過羧甲基化處理賦予其羧基，使ChNFs具有類似蛋白質的雙電荷性質。利用2.0% ChNFs懸浮液在不同pH值條件下制備得到的石蠟-水乳液放置24 h后，研究pH值對乳液穩定性的影響，其中油水的體積比為1∶9。由圖9可知，當乳液的pH值在3～11范圍內時，24 h內ChNFs都可以穩定乳液，若進一步增大或減小乳液的pH值則會出現破乳現象。研究表明，納米粒子作為乳化劑對乳液穩定性影響的主要因素是表面電荷和濕潤性。由圖3B中Zeta電位的測量結果可知，當pH值在6～8范圍內時ChNFs的疏水性會有一定程度增加，疏水性變化會導致納米粒子能被油水兩相潤濕[34]。在較高或較低pH值時出現破乳現象的原因可能是此時納米粒子電荷密度較高，導致排斥力增加，從而出現油水分層的現象。盡管如此，ChNFs依然具有在較大pH值范圍內穩定乳液的能力，與傳統具有pH值響應性的乳化劑相比，本實驗制備得到的ChNFs還具備來源廣、可再分散及生物相容性高的優點，應用前景可觀。

圖9 pH值對ChNFs穩定Pickering乳液的影響Fig.9 Effect of pH on ChNFs-stabilized Pickering emulsion

3 結論

利用脫乙酰化法結合羧甲基化處理，制得同時帶有氨基和羧基的ChNFs，且其經干燥除去分散介質后仍能再次分散，便于大規模運輸和貯存。此外，這種ChNFs能有效穩定O/W型Pickering乳液，結果表明所制得的Pickering乳液具有良好的凝膠特性，同時還具有良好的貯藏穩定性及較寬范圍pH值適應性，可以用于保護和遞送對pH值敏感的活性物質，拓展了甲殼素在食品生物領域的應用。