林先麗,張曉娟,李 晨,柴麗娟,陸震鳴,許泓瑜,王松濤,張宿義,沈才洪,史勁松,許正宏,
(1.江南大學生物工程學院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學 糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫 214122;3.國家固態釀造工程技術研究中心,四川 瀘州 646000;4.江南大學生命科學與健康工程學院,江蘇 無錫 214122)
白酒是中國傳統文化的典型代表,作為世界六大蒸餾酒之一,具有悠久的歷史[1]。不同于其他蒸餾酒,白酒采用的是雙邊發酵體系[2]。白酒是以糧食和谷物為主要原料,酒曲為糖化發酵劑,通過蒸餾獲得基酒,經長時間貯藏后進行勾調,最終獲得成品酒[3]。目前,中國白酒根據其風味可以分為12 種香型:醬香型、濃香型、清香型、米香型4 種基本香型和其他衍生香型(芝麻香型、老白干、馥郁香型、特香型、鳳香型、豉香型、藥香型和兼香型)[4]。醬香型白酒因為其復雜的工藝、獨特的風格和復雜的成分區別于其他香型,但受生產原料、生產工藝、生產環境等多方面的因素影響[1,5],醬酒的質量也參差不齊。因此,建立醬酒的質量控制體系對市場監管、生產企業質控以及市場規范都具有重要意義。
傳統的醬酒質量等級判別方法主要依靠專業人員的感官審評[6-7],但是判別結果容易受外界的干擾,如品評人員的身體狀況、品評環境等,因此具有一定的局限性[8]。儀器分析作為一種快速、準確的檢測手段,越來越多的應用于白酒等風味食品的分析檢測[9]。迄今為止,紫外吸收光譜(ultraviolet spectrum,UV)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、氣相色譜-嗅覺(gas chromatography-olfactometry,GC-O)、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)等白酒的分析檢測方法已經得到充分開發。UV檢測原理是對風味物質的官能團產生特征吸收峰,從而間接指征風味物質組成,其簡單方便、分析速度快,適合具有特征官能團的低濃度物質的檢測分析[10];NMR是一種無損檢測技術,可以反映酒體成分中質子的情況,多用于有機化合物的檢測鑒別[11];GC-O是將儀器與嗅覺結合起來的分析方法,多用于食品風味的檢測和風味鑒定[12-13];GC-MS可實現對復雜組分的定性和定量分析,廣泛應用于生物食品等各種領域,由于較高的靈敏度和可操作性,是目前最常用、最成熟有效的方法[8]。同時,NIST數據庫和Willey質譜庫也日益完善,方便使用者對化合物進行定性分析。Zhang Qian等[14]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(headspace solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GCMS)聯用、UV和NMR研究了乳酸與白酒風味的相互作用;Feng Minxue等[15]通過固相萃取與HS-SPME-GCMS,建立了一種靈敏可行的檢測白酒萜類物質的新方法;Niu Yunwei等[16]采用攪拌吸附萃取、GC-O和GC-MS等方法對賴茅中的活性芳香化合物和氨基酸進行了鑒定。電子舌由信號調理電路、交互敏感傳感器陣列和模式識別算法構成的智能分析儀器,被認為是一種快速評估食品味道的有效工具,它避免了長時間培訓品評成員,節約了時間成本[17]。近年來,電子舌通過與其他方法結合或是單獨使用,在白酒的質量等級判別方面也起著重要的作用。彭厚博等[18]利用電子舌對不同年份的4 種濃香型白酒進行判別分析;Ao Ling等[19]首次采用電子舌與GC-MS的方法對不同等級的濃香型基酒進行了分級。電子舌不僅能夠根據人的感官評價結果,通過判別函數分析模型將濃香型基酒樣品分為4 個等級,更能快速有效地預測未知等級的濃香型基酒。通過GC-MS研究了不同等級濃香型基酒揮發性物質的差異,發現隨著濃香型基酒等級的增加,香氣化合物的種類和含量增加。
GC-MS聯用等現代分析儀器檢測會產生豐富的數據信息,然而龐大的數據量中會有一些與質量等級無關的參數,這些冗余信息,對白酒的質量判別的準確性有一定影響,因此需要利用化學計量學方法對其中的有效信息進行提取[20]。主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)是較為常用的化學計量學方法,現已廣泛應用于白酒的年份[21]、陳釀時間[22]、香型[23]等方面的判別。程鐵轅等[24]對相同窖池不同部位蒸餾出的濃香型白酒的色譜成分進行采集并利用PCA對其進行評價,結果發現PCA可以很好地區分相近等級的白酒。Song Xuebo等[17]通過液液萃取結合GC×GC-TOFMS對四川盆地和江淮流域的濃香型白酒的數據進行采集,發現PCA和PLS-DA可以有效地區分不同地域的濃香型白酒;通過投影值的可變重要性獲得29 個潛在標志物并利用層次聚類對其中定量的24 個標志物進行靶向分析,進一步證實了區分不同地域濃香型白酒的有效性。綜上所述,采用GC-MS和電子舌等對醬酒進行分析檢測,并結合化學計量學方法,能有效提取醬酒質量等級的關鍵信息,提高醬酒質量判斷的可靠性和準確性[9,20]。
目前,白酒的揮發性成分已經檢測出2 000多種[16],對不同香型的白酒產地、質量等均有較多的研究。與濃香型和清香型白酒相比,醬香型白酒風味物質更加豐富,骨架物質也更加復雜,各風味物質含量以及它們的整體結構共同決定了醬酒的感官品質,因此難以通過少數幾個指標體現醬酒質量等級的判別;除了揮發性物質以外,醬酒由于其高溫餾酒的工藝特點,低揮發性的物質也較豐富,這類物質對香氣具有一定的影響,同時也造成了滋味特征的巨大差異,因此,在醬酒的質量控制體系中,味覺特征相關參數也不可忽視。由于上述醬香型白酒的復雜性,其質量等級差異研究較少,醬香型白酒成分相較于其他香型更為復雜,體現為風味物質多樣性更高,骨架成分眾多,主體香不明確。因此醬香型白酒的質量等級的研究仍不充分,尚在探索階段[25]。張曉婕等[20]基于GC-MS風味物質含量數據,通過香氣強度獲得氣味活性值大于1的風味物質,結合化學計量學區分不同質量醬香型白酒并構建其質量鑒別模型,篩選出差異風味化合物。除了風味物質含量以外,物質之間的比例關系也是決定白酒風味品質的關鍵因素,因此,本研究從普適性較好的GC-MS以及電子舌兩個分析角度,嘗試通過篩選系列差異物質并探尋物質組成比例關系與質量等級的相關性,進一步豐富醬香型白酒質量等級的差異指標。
基于上述醬香型白酒質量等級判別的難點,本研究目標是通過醬酒風味物質分析結合電子舌的味覺指標分析,采用HS-SPME-GC-MS,通過化學計量學方法,篩選系列與質量等級密切相關的差異風味化合物,并比較重點物質的比例參數在各等級醬酒中的差異;同時利用電子舌對不同質量的醬酒進行味覺檢測分析,通過PCA對不同質量醬酒進行判別。最后,基于篩選的化合物和味覺數據,采用隨機森林(random forest,RF)、邏輯回歸(logistic regression,LR)、支持向量機(support vector machine,SVM)和梯度提升(gradient boosting,GB)4 種模型建立醬酒質量判別方法。為醬香型白酒的等級鑒定及質量控制提供方法和豐富的指標體系,也為醬香型白酒及其他酒精飲料提供一種可供推廣、可借鑒的判別方法建立思路。
不同質量等級醬香型白酒樣品從市場購買或貴州仁懷市生產企業提供,乙醇體積分數53%,其中優級酒9 個(編號A1~A9),一級酒6 個(編號B1~B6),二級酒6 個(編號C1~C6)。
無水乙醇(色譜級)國藥集團化學試劑有限公司;標準品:異丁醇、異戊醇、2-甲基丁醛、異戊醛、壬醛、2-壬酮、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、丁酸丁酯、己酸乙酯、丁酸異戊酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、丁酸己酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、糠醛、苯甲醛、壬酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、甲酸辛酯、丁酸、苯乙酮、苯甲酸乙酯、異戊酸、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、2-十三烷酮、己酸、3-苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、2-十五烷酮、棕櫚酸乙酯,叔戊醇、乙酸戊酯、2-甲基己酸(純度均大于98%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化鈉(優級純)國藥集團化學試劑上海有限公司。
GC 7890B-MSD 5977B GC-MS聯用儀 美國Agilent公司;PAL多功能自動進樣器 美國Thermo Scientific公司;SA402B電子舌 日本INSENT公司。
1.3.1 醬香型白酒揮發性化合物的檢測
1.3.1.1 酒樣預處理
取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和氯化鈉和10 μL內標(叔戊醇8.05 g/L、乙酸戊酯10.38 g/L、2-甲基己酸14.0 g/L)加蓋密封,進行下一步的檢測。所有樣本重復3 次。
1.3.1.2 GC-MS分析
GC條件:采用DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.5 μm);載氣:He;流速1 mL/min,分流比4∶1;柱溫:進樣口溫度保持250 ℃,起始氣相色譜柱在35 ℃維持0.5 min,以5 ℃/min升溫至50 ℃,并維持2 min,以2.8 ℃/min升溫至105 ℃,以2.6 ℃/min升溫至140 ℃,再以8 ℃/min升溫至215 ℃,并保持10 min。
MS條件:離子源溫度230 ℃;接口溫度230 ℃;電離方式:電子電離;電子能量70 eV;掃描質量范圍33~350 u。
1.3.2 醬香型白酒味覺指標的檢測
1.3.2.1 酒樣預處理
準確量取每種酒樣3 0 mL,加蒸餾水稀釋至120 mL,均勻混合,將稀釋后的白酒密封儲存在玻璃容器中,待用。
1.3.2.2 電子舌分析
在進行樣品檢測之前需對參比電極和傳感器活化24 h。準確移取稀釋后40 mL酒樣于相應的小量杯中,先將傳感器在正負清洗液中清洗90 s,去除上面的其他吸附物;然后在參比溶液中洗滌120 s至平衡,獲得參比溶液電位。最后將傳感器浸泡于每個樣品之中30 s獲得樣品的點位。每個樣品重復3 次。
1.3.3 揮發性化合物的定性和定量
定性方法:方法參考實驗室前期建立的定性方法[26]。
定量方法:將所有的標準品混合在53%的乙醇溶液中并稀釋成一系列濃度。每條校準曲線是通過以待測物與內標的含量比為橫坐標,峰面積比為縱坐標繪制而成。各標準溶液中內標的添加量與白酒樣品相同,標準曲線的GC-MS條件與白酒分析的條件完全相同。標準曲線的線性用R2表示。
用Excel進行柱狀圖、雷達圖分析和對測量數據進行歸一化處理;PCA、總含量熱圖、ANOSIM差異分析通過在線網站(http://www.cloudtutu.com)繪制;PLS-DA和變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)用SIMCA 14.1分析;篩選物質的平均含量熱圖用GraphPad Prism 9.0分析;用SPSS 26.0軟件進行單因素ANOVA分析;用Orange[27]軟件進行建模分析。
2.1.1 不同質量等級醬香型白酒揮發性化合物定性定量分析
通過GC-MS對21 個不同質量等級的醬酒樣品的40 種物質進行定性定量分析,包括酯類25 種、醇類2 種、酸類4 種、酮類4 種和醛類5 種。基于這些風味物質的含量數據集,按照每個風味物質為一個變量,對各樣品進行了PCA,PCA中,前5 個PC的累計貢獻率達71%,可以代表大部分成分信息,結果如圖1a所示。3 種質量等級的醬香型白酒可以較好地分成3 部分,但是有部分重疊。

圖1 不同質量等級醬香型白酒揮發性化合物PCA(a)和ANOSIM差異分析(b)Fig.1 PCA (a) and ANOSIM analysis (b) of volatile compounds in Jiang-flavor baijiu of different grades
ANOSIM是一種基于秩和檢驗和置換檢驗的非參數檢測方法,可以檢驗組間和組內誰的差異更顯著,從而判別所分的組別是否有意義。對3 種等級醬酒進行基于Bray-Curtis距離的ANOSIM組間差異分析,結果由圖1b所示,R=0.484(>0),表明組間距離大于組內距離,分組有意義,P=0.001(<0.05),表明3 組數據之間差異顯著,可以用于進一步分析。
3 個質量等級醬香型白酒在揮發性化合物含量上具有較為明顯的差異(圖2b、c)。己酸、辛酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸乙酯等化合物在優級酒中含量較高;乙酸、壬酸乙酯、糠醛、苯甲醛等物質在一級酒中含量較高;二級酒的物質種類和含量普遍低于優級和一級。

圖2 3 個等級醬香型白酒樣品中各類揮發性化合物總量(a)、各成分的含量(b)以及各物質在3 個等級的平均含量(c)Fig.2 Contents of total (a) and individual (b) volatile compounds and average contents of volatile compounds (c) in Jiang-flavor baijiu of different grades
對比不同質量等級醬香型白酒揮發性化合物各大類物質在各樣品中的含量情況(圖2a),可以看出優級酒的總物質質量濃度在6 583 mg/L左右,酯類物質是白酒呈香的重要化合物[28],結果體現優級酒中主體揮發性成分都為酯類物質,同時酸、醛、醇的含量相差不大,優級酒的大類物質結構都比較一致;一級酒的物質結構有一定的差異,其中醇類、醛類和酸類物質含量在不同樣品中有較大差異;二級酒的物質總質量濃度在4 908 mg/L左右,顯著低于另外兩個等級,大部分樣品在醛類和醇類物質的含量非常少,整體揮發性成分的豐富度低于其他兩個等級。
2.1.2 化學計量學分析篩選關鍵差異揮發性化合物
為了篩選出區分不同質量等級醬香型白酒之間的關鍵差異化合物,對測得的數據進行PLS-DA,結果如圖3a所示。不同質量等級的醬香型白酒具有明顯的區分,且優級主要分布在第4象限,一級主要分布在第1象限,二級主要分布在負半軸。通過置換檢驗判別模型是否過擬合,從圖3b可以看出,R2截距為0.238,Q2截距為-0.424,說明模型沒有過度擬合,表現良好,可以用于3 種等級的區分。為了確定影響3 個等級的重要化合物指標,通過預測值的VIP(標準VIP>1),確定了16 種揮發性化合物作為重要差異化合物,其中酯類9 種、醛類4 種、酸類2 種和酮類1 種(圖3c)。其中VIP排名在前5的物質分別為棕櫚酸乙酯(1.533 07)、乙酸(1.491 6)、苯甲醛(1.430 95)、異戊酸乙酯(1.301 44)、己酸(1.278 45)。其中,VIP最高的棕櫚酸乙酯具有微有油味和甜味,有可能造成酒體渾濁的現象[29]。在3 種等級的醬香型白酒中,棕櫚酸乙酯在優級酒中含量相對較低(圖3c)。酯類化合物在白酒中主要表現出花果香,是白酒中風味豐富的重要物質,從3 種質量等級的16 種潛在差異化合物的平均含量(圖3c)可以看出,異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸丙酯、乙酸異戊酯和DL-白氨酸乙酯的含量均在優級酒中含量較高,且隨著等級的降低含量顯著降低。醛類物質主要貢獻烘焙香、堅果香,適量的醛類物質對醬酒的香氣有一定貢獻[30],具有堅果、甜味的2-甲基丁醛和異戊醛在優級和一級酒中的含量顯著高于二級酒。酸類物質是白酒中的重要風味物質,適量的酸可以使白酒酒體更為豐滿、回味悠長[31]。乙酸、丁酸和己酸是白酒中的重要短鏈脂肪酸,是公認的白酒骨架化合物。而本研究中,乙酸和己酸作為重要的質量等級指標化合物被篩選出來。3 種等級酒中,優級酒的己酸含量最高,且與其他等級有顯著性差異。乙酸在一級酒中的平均含量最高,優級和二級之間沒有顯著區別。

圖3 不同質量等級醬香型白酒PLS-DA得分圖(a)、置換測試的執行(b)、關鍵差異化合物VIP值和關鍵差異化合物在各等級樣品中的平均含量(c)Fig.3 PLS-DA score plot of Jiang-flavor baijiu of different grades (a),premutation test (b) and VIP values and average contents of key differential compounds in baijiu of different grades (c)
進一步對比16 種關鍵差異物質在其各自物質類型中在總含量中比例(例如乙酸乙酯在總酯中的比例),結果如圖4所示,發現呈花果香的酯類物質,例如異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等,在優級酒中占比較高,且隨著等級的降低占比減少。長鏈的脂肪酸乙酯,如肉豆蔻酸乙酯(似芹菜或黃油味)和棕櫚酸乙酯(微有油味、脂肪氣味不明顯,帶甜味)均在優級酒中占比較低,且隨著等級的降低占比逐漸增加。呈堅果香的2-甲基丁醛和異戊醛均在優級酒中占比高,且隨著等級的降低而逐漸降低,而苯甲醛和糠醛在優級酒中占比低,且隨著等級的降低而逐漸升高。乙酸和己酸的占比數據趨勢與上述含量數據的趨勢類似,體現出優級酒具有相對較高的己酸和相對較低的乙酸。


圖4 關鍵差異化合物在各自對應的大類物質總含量中的占比Fig.4 Percentage of key differential compounds in the total content of their classes
2.2.1 不同質量等級醬香型白酒電子舌分析
檢測不同等級醬酒的酸、苦、澀、鮮、咸和甜味幾個味覺指標,所有數據均經過參比溶液矯正。重復測定的誤差平均值均小于0.1,不同樣品對測定影響的誤差率均小于50%,檢測穩定性較好。由圖5可以看出,3 種等級醬酒的味覺指標有著明顯的區別。優級酒的味覺指標相似度比較高,其中咸味、鮮味、澀味、苦味回味、澀味回味、豐富度都高度一致,而酸味、甜味和苦味指標上存在一定的差異,整體輪廓較一致。一級和二級酒的味覺指標變化較為明顯,且隨著等級的降低,部分味覺指標的在組內的差異增加。為觀察不同等級醬酒的味覺指標是否具有顯著差異,通過單因素方差分析計算3 種等級醬酒味覺指標的顯著性,結果如圖6所示。優級酒整體樣本較為集中,樣本的味覺指標相似度較一級和二級高,表明優級酒具有較一致的味覺感官特征。酸味、咸味、咸味、甜味、澀味和苦味回味在不同等級醬酒中沒有顯著區別,但優級酒的澀味回味和苦味在3 個等級之中較低,說明優質的醬酒對苦澀相關的味覺特征都控制得較好。

圖5 3 種質量等級醬香型白酒電子舌結果對比Fig.5 Electronic tongue analysis of Jiang-flavor baijiu of three grades


圖6 3 種質量等級醬香型白酒電子舌單因素方差分析Fig.6 One-way analysis of variance of electronic tongue data of Jiangflavor baijiu of three grades
2.2.2 不同質量等級醬香型白酒味覺指標PCA
PCA是一種考察多個變量之間相關性的統計方法,廣泛應用于數據降維[32],為確定3 種等級醬酒之間的味覺特征是否具有統計差異,通過各樣品的9 個味覺響應值,對不同質量等級醬酒樣品進行PCA,前2 個PC的累計貢獻率為70.8%,可以代表大部分的成分信息,結果如圖7所示。除個別樣本(B1和B6),PCA可以較為明顯地區分3 種等級醬酒的味覺指標。綜上所述,電子舌分析得到的特征指標具有成為快速鑒別醬酒質量等級的區分參數的潛力。

圖7 3 種質量等級醬香型白酒基于味覺指標的PCA得分圖Fig.7 PCA score plot of Jiang-flavor baijiu of three grades based on taste indexes
為驗證篩選的16 種關鍵差異化合物和9 種味覺指標是否能區分3 種質量等級醬香型白酒,根據共計25 個指標建立判別模型。63 個觀測值中隨機挑選80%作為模型的訓練集,20%作為模型的測試集,采用十折交叉驗證提高模型的泛化能力,結果如表1所示。通過接收者操作特征曲線下面積(area under curve,AUC)、準確性(cluster accuracy,CA)、F1分數、精確率和召回率指標對模型進行評價,AUC、CA、F1、精確率和準確率的值越接近于1,表明模型的分類效果越好。RF、LR、SVM和GB 4 種模型對3 種質量等級的判別能力均較高,準確率均高于95%,其中SVM在4 種模型中的表現最好,準確率達100%。由表2可以看出,除GB外,4 種模型的預測能力也均高于90%。GB在優級酒中預測能力為96.3%,但在一級和二級酒中能力較差;RF對一級和二級的預測能力優秀,為100%,但對優級預測能力略遜一籌;LR對3 種等級醬酒的預測能力接近,都在95%左右;SVM在3 種等級醬酒中的預測能力均表現優秀,均為100%。綜上所述,SVM是最優的判別模型,對3 種質量等級醬香型白酒的預測能力均能達到100%。

表1 醬香型白酒質量等級判別模型的評價指標Table 1 Evaluation indexes of discriminant models for Jiang-flavor baijiu of different grades

表2 醬香型白酒質量等級判別模型結果準確性Table 2 Accuracy of discriminant models for Jiang-flavor baijiu of different grades
通過HS-SPME-GC-MS對3 種質量等級醬香型白酒的揮發性化合物進行定性定量分析,共檢測出40 種物質。結果表明,相比于其他等級,各優級酒的物質組成輪廓相似度更高,其花果香特征的酯類物質在總酯中占比也最高。通過對不同質量醬酒進行電子舌的檢測分析,發現3 種等級醬酒的味覺指標有明顯的區別,優級酒的味覺指標輪廓較一致,樣本之間各味覺的數值沒有顯著樣品差異,隨著等級的降低味覺指標的差異性增加,二級樣品中與甜味和鮮味相關的味覺特征具有明顯的樣品差異性,并且整體響應值更高。優級酒的澀味回味和苦味在3 個等級之中顯著較低,說明優質醬酒對苦澀相關的味覺特征都控制得較好。
采用PLS-DA對不同醬酒的揮發性物質進行分析,結果表明PLS-DA可以有效區分3 種等級醬酒。結合VIP>1最后篩選出16 種關鍵差異化合物,即棕櫚酸乙酯、乙酸、苯甲醛、異戊酸乙酯、己酸、2-甲基丁酸乙酯、己酸丙酯、異戊醛、肉豆蔻酸乙酯、糠醛、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁醛、DL-白氨酸乙酯、苯乙酸乙酯和2-壬酮。這些物質是造成醬酒質量差的關鍵化合物。采用PCA對3 種等級醬酒的味覺指標進行分析,可以明顯對3 種等級醬酒進行區分,表明電子舌參數可以作為一種快速區分醬酒質量等級的方法。
采用機器學習對所篩選關鍵差異化合物和醬酒的味覺指標進行判別模型的建立,結果表明,4 種判別模型均有很好的解釋度,表現良好,其中SVM模型表現最優,準確率高達100%。
本實驗建立了一種快速分析鑒別醬酒質量等級的方法,與感官評價相比操作更為簡便,結果更為客觀,這為醬酒的質量控制和等級鑒別提供依據,也為醬酒及其他酒精飲料的質量鑒定提供一種有效手段。