基于裁剪適配體的納米金比色法用于金黃色葡萄球菌腸毒素A的可視化檢測

崔麗偉，魏 榮，常惟丹，岳曉禹，許文濤,2,

（1.河南牧業經濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046；2.中國農業大學營養與健康系，食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100191）

金黃色葡萄球菌腸毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）所引起的食物中毒事件頻發，是影響食品安全和人類生命安全的重大隱患。當食品中SEA的含量超過18 μg/100 g時，會引起嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重時會導致休克。據報道，2017—2020年間我國有15.2%的食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌腸毒素造成[1-3]。因此，實現SEA的快速定量分析檢測極為重要，是保障食品安全的一道重要防線。

現有的SEA檢測方法主要有分子生物學[4-5]、免疫學[6-7]、色譜法[8-9]、生物傳感器[10-12]等。這些方法均可以實現SEA的定量分析測定，但大多具有樣品前處理繁瑣、易出現假陽性、測定成本高、測定時間長、需要昂貴的儀器和專業技術人員等局限性。近年來，適配體由于其具有易合成、成本低的顯著特點，其作為識別原件的生物傳感器受到廣大研究者的青睞。核酸適配體是與靶標具有高特異性、高親和力的單鏈DNA或RNA，常通過指數富集的配基系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得，但所得到的適配體往往序列冗長，存在無效堿基，出現合成成本增加、親和力低等問題，所以還需進一步優化以滿足分析測定需求[13-14]。常見的適配體優化策略主要有截短、突變和化學修飾，其中，截短為適配體優化的首選策略。為了確定截斷后的序列與靶標具有較高的特異性、親和性和穩定性，常常根據適配體的二級結構進行反復實驗。有研究顯示，利用分子模擬的方法能夠直接獲得結合位點，從而特異性地針對結合位點進行截短或突變優化[15-17]。例如，顏志超等[18]在分子模擬指導下對SELEX篩選所得的河鲀毒素核酸適配體進行連續優化，得到了親和力較高的河鲀毒素適配體。Hu Bo等[19]利用分子模擬研究DNA適配體與海葵毒素的結合機制，并獲得了較其他SELEX篩選結果親和力更高的適配體。

本研究擬利用分子對接和分子動力學模擬的方法對SEA適配體進行截短指導和結果預測，再利用納米金顯色的方法驗證模擬結果，以優化得到親和力高、穩定性好、特異性強的SEA適配體，將其作為分子識別原件，構建一種可視化的SEA快速檢測分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購自當地超市。

氯金酸四水合物、檸檬酸三鈉、氯化鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；SEA、腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）、腸毒素C（staphylococcal enterotoxin C，SEC）由本實驗室提供；黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（ochratoxin A，OTA）青島普瑞邦生物工程有限公司。

適配體均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，Apt1：5′-ATCTGCTGACGTTGGTCGTCATTG GAGTATC-3′；Apt2：5′-AACGTCAGCATCTGCTG ACGTTGGTCGTCATTGGAGTATC-3′；Apt3：5′-CG TCAGCATCTGCTGACGTTGGTCGTCATTGGAGTA TC-3′；Apt4：5′-CCTAACCGATATCACACTCACAG TATACCGCTCCACCAGTGTGATATCGGGATCTGC TGACGTTGGTCGTCATTGGAGTATC-3′[20]；Apt5：5′-ATCTGCTTTGGTCGTCATTGGAGTA-3′；Apt6：5′-ATCTGCTTTGGTGTATTGGAGTA-3′。

1.2 儀器與設備

UV-1900PC紫外-可見光分光光度計 上海美析儀器有限公司；PL-9602G酶標儀 北京普朗新技術有限公司；HR-T16MM臺式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子對接模擬

對核酸適配體的結構建模，適配體的二級結構通過IDT網站（https://sg.idtdna.com）進行預測，設置折疊溫度為25 ℃，離子條件為50 mmol/L Na＋溶液。選擇能量最小的二級結構導入RNA Compser在線預測網站（http://rnacomposer.ibch.poznan.pl），將胸腺嘧啶改為尿嘧啶后生成RNA三級結構，隨后將其導入分子可視化程序（Visual Molecular Dynamics，VMD）軟件中，將尿嘧啶改為胸腺嘧啶，從而得到適配體的三級結構。同時，從蛋白質數據庫（Protein Data Bank，PDB）中獲取SEA晶體結構（ID：1ESF），隨后使用HDOCK Web服務器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）進行分子對接，適配體為受體，SEA為配體，對接完成后，選擇能量最穩定的復合物，使用GROMACS軟件進行分子動力學模擬。分子動力學自發結合模擬方法可以預測適配體與SEA的結合區域。選擇蛋白質/核酸通用力場，Tip3p水模型，復合物置于水立方體中心，水立方體表面距離復合物最小距離為10 ?，先進行預平衡，再進行成品模擬，模擬時間為10 ns。動力學結束后，修正復合物運動軌跡后，計算復合物分子模型的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）以評估構象穩定情況[14,19,21]。

1.3.2 納米金顯色分析

采用檸檬酸鈉還原氯金酸法制備納米金[22]。向每個酶標板中分別加入50 μL金納米粒子溶液，再加入50 μL 0.3 μmol/L的適配體溶液，在酶標板振蕩器中以37 ℃孵育10 min；加入50 μL不同質量濃度的SEA溶液，37 ℃孵育10 min；最后加入25 μL 0.3 mol/L的氯化鈉溶液，37 ℃顯色5 min。使用紫外分光光度計進行光譜掃描，掃描波長在480～700 nm之間，記錄其在650 nm波長處與520 nm波長處吸光度的比值（A650nm/A520nm），同時以無菌水代替不同質量濃度的SEA溶液，做空白實驗，扣除空白后，吸光度比值記作ΔA650nm/A520nm。

1.3.3 實驗條件的優化

為了提高方法的準確度以及靈敏度，在SEA質量濃度為250 ng/mL時，采用單因素試驗分別測定鹽溶液濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mol/L）、適配體濃度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L）、反應時間（2、4、6、8、10、12、14 min）對ΔA650nm/A520nm的影響，獲得最佳的反應體系。

1.3.4 特異性實驗

為了驗證本方法檢測SEA的特異性，分別選用質量濃度均為100 ng/mL的SEB、SEC、AFB1、OTA和ZEN進行特異性驗證，SEA質量濃度為100 ng/mL。操作同1.3.2節，將SEA分別用上述毒素代替。

1.3.5 實際樣品檢測

取25 g攪碎后的豬肉樣品，加入一定量的SEA，然后再加入225 mL無菌水均質，使樣品中的SEA終質量濃度為50、100、200 ng/mL。取均質液在90 ℃加熱10 min，2 000 r/min離心5 min，取上清液進行測定。參照1.3.2節方法進行測定，每個濃度進行3 組平行實驗，同時做空白實驗。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據處理及分析（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 8.5軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 適配體篩選

2.1.1 適配體設計及分子模擬結果

根據6 條適配體的二級結構對最長鏈適配體進行裁剪[23]，裁剪過程如圖1所示，Apt4具有82 個堿基，具有較長的鏈，將其與SEA進行分子模擬后，發現SEA和Apt4結合區域在其3′端，又由于適配體與靶標結合區域大多在其莖環部位[24-25]，所以對其進行裁剪，得Apt1。為了驗證Apt1中與SEA作用的關鍵堿基序列，一方面在其5′端分別增加多余冗長堿基9 個和7 個，得Apt2和Apt3；另一方面，對其5′端的小莖環進行裁剪，得Apt5和Apt6。將6 條適配體分別與SEA進行10 ns分子動力學模擬，得到二者結合后的三維結構圖（圖2A）以及RMSD值曲線（圖2B）。Apt6從圖2A可以看出適配體彎曲折疊，SEA在其空間“口袋”內，相交處為兩者相互作用區域。RMSD值是評價構象穩定的重要指標，其值越小，說明構象與原始構象越相近，在分子模擬時，隨時間的波動，RMSD值越小，說明系統越接近于平衡狀態。如圖2B所示，6 條適配體與SEA結合后，三級結構均發生不同程度的變化。其中，Apt1和Apt4波動最明顯，其次為Apt2和Apt3，而Apt5和Apt6相對穩定。波動程度越大，說明復合物空間構象越不穩定，越容易發生變化。分子模擬結果顯示Apt5和Apt6穩定性較好，推測可能是核酸適配體與SEA的核心結合區，適合用于生物傳感器構建。

圖2 適配體Apt6與SEA分子模擬結果（A）及不同裁剪適配體與SEA分子動力學后的RMSD值（B）Fig.2 Molecular simulation results of Apt6 and SEA (A) and RMSD values obtained in molecular dynamics simulation of different tailored aptamers and SEA (B)

2.1.2 納米金顯色結果

利用納米金的鹽效應實現SEA定量測定的可能性進行驗證，結果如圖3A所示。分散狀態下的納米金溶液呈現酒紅色（曲線a），加入鹽后，溶液顏色變為藍色，520 nm波長處的吸光度下降，650 nm波長處的吸光度上升（曲線b），鹽的加入引起納米金粒子聚集，造成顏色改變。當納米金溶液中存在適配體時，由于靜電吸附作用，適配體吸附在納米金顆粒表面，鹽效應減弱（曲線c），溶液顏色變化不明顯。當納米金溶液中同時存在適配體和靶標時，由于二者發生特異性結合，使得納米金粒子失去適配體的“保護”，引起粒子聚集，靶標質量濃度越大，鹽效應越明顯（曲線d和e，A650nm/A520nm比值分別為1.28和1.31）。納米金溶液的A650nm/A520nm值與SEA含量呈正相關，可通過溶液顏色的變化實現SEA的定量檢測。

圖3 不同體系下溶液的吸收光譜圖（A）以及不同適配體和SEA的納米金顯色結果（B）Fig.3 Absorption spectra of different systems (A) and color development results of gold nanoparticles in the presence of different aptamers and SEA (B)

對6 條適配體（0.5 μmol/L）和SEA（250 ng/mL）的親和性和穩定性進行探究，平行測定6 次，結果如圖3B所示。與其他適配體相比，Apt4親和力較弱且不穩定，這可能是由于其堿基數量較多、鏈較長引起。經過裁剪和改造后的Apt1、Apt2和Apt3，親和力得到明顯提高，Apt2和Apt3親和力無明顯差別，這說明：一方面，裁剪效果明顯，有效堿基得到保留；另一方面，在一定程度上增加堿基數量，對親和力影響較小。與Apt1相比，經過再次裁剪的Apt5和Apt6，親和力得到進一步提高，且穩定性較好，說明裁剪策略正確，有效堿基得到保留，鏈的縮短使得適配體空間結構趨于穩定。上述結果與分子模擬結果一致，根據實驗結果和測定成本綜合考慮，選擇Apt6用于后續測定。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 鹽濃度

當體系中鹽溶液濃度小于0.3 mol/L時，ΔA650nm/A520nm值隨著鹽濃度的增大而升高，當鹽濃度大于0.3 mol/L時，其比值趨于水平。說明鹽濃度小于0.3 mol/L，納米金粒子不能得到有效聚集，鹽效應較小，而當鹽溶液濃度大于0.3 mol/L時，納米金聚集現象明顯，適配體保護能力減弱，呈現穩態。因此，0.3 mol/L為最佳鹽濃度。

2.2.2 適配體濃度

在適配體濃度小于0.3 μmol/L時，ΔA650nm/A520nm值不斷下降，當適配體濃度大于0.3 μmol/L時，ΔA650nm/A520nm值趨于水平，如果適配體的濃度過低，則體系中的適配體無法完全保護金納米粒子，低濃度的氯化鈉就會使金納米粒子發生聚集，此時無論體系中是否有SEA存在，金納米粒子都是聚集的狀態，無法對溶液中的SEA進行檢測。如果適配體的濃度過高，一部分適配體吸附在納米金表面，另一部分游離在溶液中，當靶標存在時，優先與游離的適配體結合，然后再與吸附在金納米粒子表面的適配體結合，這樣會大大降低方法的靈敏度。當反應體系的氯化鈉濃度不變時，金納米粒子團聚的程度隨著適配體濃度的升高而不斷降低，在0.3 μmol/L處達到最低后趨于水平，表明適配體的濃度為0.3 μmol/L時，可以完全保護金納米粒子不發生聚集，且體系中的SEA更容易被識別、靈敏度最高。因此，最優適配體濃度為0.3 μmol/L。

2.2.3 反應時間

金納米粒子的團聚程度和反應時間有關，結果顯示，當反應時間小于10 min時，ΔA650nm/A520nm值隨著反應時間的延長而增大，在10 min達到最大后趨于水平，說明10 min時體系反應完全，吸光度比值達到平衡，因此，最優的反應時間為10 min。

2.3 標準曲線的建立

在優化實驗條件下，繪制納米金溶液與不同質量濃度SEA反應后的吸收光譜圖，結果如圖4A所示。隨著SEA溶液質量濃度的增加，體系在520 nm波長處的吸光度不斷下降，在650 nm波長處的吸光度不斷上升，體系顏色從酒紅色逐漸變為藍色（圖4A內插圖）。以ΔA650nm/A520nm值為縱坐標，SEA溶液質量濃度為橫坐標，繪制二者相關性曲線，如圖4B所示，在SEA質量濃度為5～250 ng/mL內，線性回歸方程為Y=0.001 7X＋0.452 3，相關系數為0.984 7，檢出限為4.32 ng/mL（RSN=3）。說明該方法可實現SEA的快速可視化檢測。與報道的方法相比，本研究建立的方法操作簡單，檢測速度快，檢測限較低，具有一定優勢（表1）。

表1 不同腸毒素A檢測方法的對比Table 1 Comparison of different methods for detection of SEA

圖4 不同質量濃度的SEA吸收光譜圖（A）和線性擬合圖（B）Fig.4 Absorption spectra of SEA at different mass concentrations (A) and linear relationship between absorbance ratio and SEA mass concentration (B)

2.4 特異性實驗

選用不同毒素對方法的特異性進行研究。結果如圖5所示，發現裁剪前后的適配體對SEA、SEB和SEC均有響應，這可能是因為SEA與SEB、SEC具有40%～60%序列同源性，適配體對該共同結構域具有識別位點[1]；但對于其他的微生物代謝的小分子毒素如ZEN、AFB1、OTA幾乎沒有響應。說明本方法對于腸毒素的檢測具有一定的廣譜性優勢，對于其他毒素，具有良好的特異性。

圖5 不同裁剪適配體的特異性分析Fig.5 Specificity analysis of different tailored aptamers

在相同條件下，連續7 d用所構建的傳感器測定質量濃度為250 ng/mL 的SEA，重復測定3 次，測定結果相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值小于5%，說明該傳感器具有良好的穩定性。

2.5 實際樣品檢測

以豬肉作為實際樣品，通過測定加標回收率驗證本方法的準確性，進行3 次重復，結果如表2所示，豬肉樣品中SEA的加標回收率在84.00%～93.62%之間，RSD值為5.24%～6.63%。由此得出，該生物傳感器檢測的準確性高、數據可靠，可以對豬肉中的SEA進行篩選甄別。

3 結論

本實驗通過分子模擬，指導適配體裁剪，預測適配體與SEA作用區域，篩選出目標適配體，提高適配體篩選效率，獲得長度更短、親和力更好、特異性更高、穩定性更好的核酸適配體。將篩選得到的適配體作為信號識別原件，利用納米金的鹽效應，構建了一種SEA的高靈敏度、高特異性的可視化檢測方法。本方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強的特點，為基于適配體的SEA快速檢測試劑盒的研發提供了一定理論基礎。