基于多元儀器分析結合化學計量法的不同產地胡椒油樹脂品質比較

李 彤，王雨行，王向紅，張玉涵，米 思,

（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.晨光生物科技集團股份有限公司，河北 邯鄲 057250；3.河北省植物天然色素產業(yè)技術研究院，河北 邯鄲 057250）

胡椒（Piper nigrumL.）是胡椒科胡椒屬植物，主要種植于越南、印度尼西亞等熱帶地區(qū)[1]，因其具有刺激性辣味和強烈的芳香味被許多國家用作食品加工中的香料[2]。此外，胡椒果實中含有多種生物活性成分，使其具有抗癌和免疫調節(jié)等作用，因此也被用于醫(yī)學研究[3]。胡椒油樹脂是以胡椒為原料通過有機試劑、超臨界流體等提取浸提生產而成，保留了胡椒原料原有的辛辣風味和營養(yǎng)價值。因此，胡椒油樹脂正逐漸替代胡椒粒或胡椒粉在食品香料中的地位。

已有研究表明，產地是影響包括胡椒在內的食品香料品質的重要因素之一[4-5]，Campmajo等[6]借助高效液相色譜技術實現(xiàn)了對不同歐洲產地辣椒的判別分析；Feng Xiya等[7]利用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyion mobility spectroscopy，GC-IMS）和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術分析不同產地花椒中的揮發(fā)性有機物的差異。近年來針對不同產地胡椒樣品的品質分析比較也有報道。張玉涵等[8]利用超快速氣相電子鼻技術比較了不同國家胡椒及其提取物的成分組成差異；Tokalioglu[9]、Potorti等[10]利用電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）手段評估了不同產地多種香料中化學元素組成的異同點。

胡椒油樹脂在我國乃至世界香辛料產業(yè)中占有越來越重要的地位。我國是胡椒消費大國，目前胡椒產量尚不能滿足國內市場需求，胡椒原料多是從越南、印度尼西亞等東南亞國家進口。明確不同產地胡椒油樹脂的品質特征與差異對后續(xù)產品開發(fā)具有重要意義。因此，本研究以產自越南、印度尼西亞、斯里蘭卡的胡椒油樹脂為研究對象，采用包括高效液相色譜、ICP-MS、GC-IMS在內的多元儀器分析手段，結合方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法分析不同產地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿類化合物、化學元素以及揮發(fā)性風味化合物組成及含量，并識別對產地判別具有重要貢獻的化學標志物，確定胡椒油樹脂的優(yōu)勢產區(qū)，旨在為不同產地的胡椒油樹脂的品質辨別與選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡椒油樹脂由晨光生物科技集團提供，來源于印度尼西亞、斯里蘭卡和越南3 個產地，樣品命名：印尼1、印尼2、蘭卡1、蘭卡2、越南1、越南2。胡椒油樹脂樣品置于4 ℃冰箱保存，待測。

甲醇（色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；胡椒堿標準品（純度≥98%）、蓽茇酰胺標準品（純度≥98%）北京索萊寶科技有限公司；胡椒酸標準品（純度≥98%）北京喀斯瑪惠通科技有限公司；胡椒醇標準品（純度≥98%）上海麥克林生物科技有限公司；2-甲基-3-庚酮對照品（純度＞99%）德國Dr.Ehrenstorfer公司；其余有機試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；FlavourSpec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S公司；CEM MARS 5型密閉微波消解儀 美國CEM公司；7700X型ICP-MS儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜分析

標準品制備：稱取胡椒堿、胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺標準品5.0 mg，分別用無水乙醇溶解并定容至5 mL作為母液，將母液梯度稀釋成100、62.5、50、25、12.5、5 mg/L的標準溶液，備用。

樣品制備：稱取0.050 g的胡椒油樹脂，用無水乙醇定容至5 mL，避光超聲提取30 min，提取液用0.22 μm的有機濾膜過濾待測。

胡椒堿和胡椒酸分析的色譜條件：Waters Diamonsil C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（77∶23，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長為343 nm（胡椒堿）和254 nm（胡椒酸）；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

胡椒醇和蓽茇酰胺分析的色譜條件：流動相為甲醇-水（60∶40，V/V）；檢測波長為285 nm，其余均與胡椒堿的檢測條件一致。

1.3.2 ICP-MS

微波消解條件：稱取0.250 g胡椒油樹脂，置于PTFE消解管中，加入6 mL 65%的濃硝酸溶液進行預消解。1 h后，加入2 mL 30%的H2O2溶液，混勻后于微波消解儀中進行消解。微波消解儀溫度在8 min內升至120 ℃，保持2 min；然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，并且保持5 min，再以4 ℃/min的速率升至180 ℃，保持15 min。消解后冷卻至室溫，用去離子水（＞18.2 MΩ）洗出樣品，定容至100 g，備用。

ICP-MS條件：射頻功率1 280 W；霧化室溫度2 ℃；載氣流速1.0 L/min；蠕動泵流速0.5 mL/min；氧化物指標0.45%；雙電荷指標1.01%。以Ge、In、Bi為所選內標，當內標元素的相對標準偏差（3 次重復測定）＞10%，需重新測定樣品。

1.3.3 GC-IMS分析

樣品前處理條件：準確稱取2.500 g胡椒油樹脂置于20 mL頂空瓶中，加入100 μL 0.2 mg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液，振蕩搖勻后備用。

自動進樣條件：孵育溫度40 ℃，孵化轉數(shù)500 r/min，孵育時間10 min，采用頂空自動進樣方式，進樣量1 mL，進樣針溫度85 ℃，不分流模式進樣。

GC條件：采用MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm），柱溫60 ℃，載氣為氮氣（≥99.999%）。

IMS條件：溫度45 ℃，分析時間30 min，載氣/漂移氣為氮氣（≥99.999%）；載氣的流速程序為0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～25 min，15～100 mL/min；25～30 min，100 mL/min。

數(shù)據(jù)處理條件：采用GC-IMS儀器配套的VOCal軟件（內置NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫）對不同產地胡椒油樹脂樣品中的風味化合物進行定性分析，利用Reporter和Gallery Plot插件對比風味指紋圖譜的差異。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 不同產地胡椒油樹脂胡椒堿類化合物組成分析

本研究測定胡椒堿、胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺4 種化合物在胡椒油樹脂樣品中的含量，分析結果見表1。其中胡椒堿在胡椒油樹脂樣品中的質量分數(shù)最高（25.83%～31.57%），這與劉紅等[2]的研究一致。胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺質量分數(shù)相對較少，且4 種化合物含量在不同產地胡椒油樹脂樣品中均存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 不同產地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿及其類似物含量Table 1 Contents of piperine and related compounds in pepper oleoresin samples

胡椒堿是胡椒油樹脂中存在的特征辣味成分，質量分數(shù)越高產生的刺激感越強[11]。蘭卡2中胡椒堿的質量分數(shù)（31.57%）顯著高于其他產地樣品，越南產地胡椒堿質量分數(shù)整體偏低（表1）。該結果與Rivera-perez等[12]的研究類似。已有研究表明，胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺等化合物的存在會對胡椒油樹脂的風味品質產生影響。胡椒酸是一種芳香酸[13]，其在蘭卡2中的質量分數(shù)（0.72%）顯著高于其他樣品。胡椒醇和蓽茇酰胺化合物在印尼1樣品中的質量分數(shù)最高，分別為1.88%和1.89%（表1）。綜上，不同產地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿類化合物的質量分數(shù)存在顯著差異，越南產地的胡椒油樹脂樣品中4 種化合物的質量分數(shù)適中，因此具有更加適中的口嘗辣感。產地是影響胡椒油樹脂辛辣成分組成的重要因素之一，這種差異可歸因于植物生長的土壤、水質、氣候條件等[14-16]。

2.2 不同產地胡椒油樹脂化學元素組成分析

本研究同時測定54 種化學元素在不同產地胡椒油樹脂樣品中的含量，其中Sc、Se、Y、Rh、Pd、Tb、Lu、Th 8 種元素在各樣品中均未檢測到，其余46 種元素測定結果見表2。K、P、Na、Cu、Mg、Fe、Al、Ca是胡椒油樹脂樣品中含量較豐富的元素，這與陳福北等[17]研究結果相似。統(tǒng)計分析結果表明，Mo、Ru、Ce、Pr、Nd、Eu、Na、Mg、P、K、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、As、Rb、Ag、Sn、Cs、Ba、La 23 種元素含量在不同樣品間存在顯著差異（P＜0.05）。其中，Mg、Ba、V、Ce、La、Nd、Pr、Eu 8 種元素在蘭卡2中含量最高；Fe、Sn、Cr、Mn、Co、As、Ag 7 種元素在印尼1中含量最高；K、P、Na、Rb、Ru 5 種元素在越南2中含量最高；Cs在印尼2中含量最高；Cu、Mo在越南1中含量最高（表2）。此外，Cd、As、Pb等重金屬元素均未超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》規(guī)定的標準。

進一步針對46 種化學元素進行多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。圖1a為46 種化學元素分析的PCA得分圖，PC1的方差貢獻率為31.63%，PC2的貢獻率為18.38%，累計貢獻率達50.01%，可以反映出大部分化學元素含量信息，樣品間分離程度好，表明各樣品的化學元素組成存在明顯差異。

圖1 化學元素的PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分圖Fig.1 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of chemical elements

2.3 不同產地胡椒油樹脂揮發(fā)性風味化合物組成分析

采用GC-IMS法對不同產地胡椒油樹脂風味化合物組成進行分析檢測，結果見圖2。受試樣品中共檢測出90 種揮發(fā)性風味化合物，包括醛類18 種、醇類17 種、酮類14 種、酯類13 種、烯烴類7 種、酸類3 種、醚類3 種、胺類3 種、呋喃類2 種、噻唑類2 種、吡嗪類2 種、芳香烴類1 種、烷烴類1 種、其他化合物4 種（表3）。統(tǒng)計分析結果表明，除2-癸烯醛、二乙醇縮乙醛、壬醛、順式-3-辛烯醇、乙醇、3-辛醇、甲基庚基甲酮、丁酸乙酯、丙酸己酯、己酸丙酯、4-三氟甲基苯腈外，其余79 種化合物含量在不同產地胡椒油樹脂樣品中均存在顯著差異（P＜0.05）（表3）。由揮發(fā)性風味化合物指紋圖譜（圖2）可知，越南兩樣品風味化合物組成較相似；除A框中化合物在蘭卡2中信號強度較高外，其他化合物在印尼2、蘭卡1、蘭卡2中的含量接近；B框中的化合物在印尼1中的含量明顯高于其他樣品。

圖2 揮發(fā)性風味化合物指紋圖譜Fig.2 Volatile fingerprint of pepper oleoresin samples

表3 不同產地胡椒油樹脂樣品中揮發(fā)性風味化合物組成及含量Table 3 Composition and content of volatile flavor compounds in pepper oleoresin samples

PCA結果（圖3a）表明，PC1、PC2方差貢獻率分別為35.71%、27.80%，累計貢獻率達63.51%。PC1中印尼2、蘭卡1、蘭卡2聚集度較高，越南1和越南2樣品較接近，樣品越聚集表明揮發(fā)性風味化合物組成越相似[24]；PC2中印尼1與其他5 種樣品可明顯區(qū)分。以上PCA結果與指紋圖譜反映出的結果對應。

圖3 揮發(fā)性風味化合物PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分圖Fig.3 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of volatile flavor compounds

前期文獻報道指出，烯烴類化合物，例如2-蒎烯、檸檬烯、石竹烯等，是胡椒油樹脂中的特征香氣成分[3,8,26]。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，烯烴類化合物在越南1樣品中總體含量相對較高，其中2-蒎烯多存在于天然精油中[25]，含量最大（14.31 μg/g）；檸檬烯含量為4.46 μg/g，可賦予胡椒油樹脂柑橘香氣[27]；石竹烯含量為6.51 μg/g，賦予胡椒油樹脂木質香氣。除烯烴類特征香氣化合物之外，越南1樣品中還含有相對豐富的醛類、酮類、酸類化合物（表3）。醛類化合物閾值較低，對胡椒油樹脂風味品質影響較大，尤其是2-十一烯醛、反式-2-己烯醛等含量較高的化合物，能夠賦予胡椒油樹脂樣品草香味[28]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、甲基環(huán)戊烯醇酮等酮類化合物可作為雜環(huán)化合物的中間產物，間接反映香氣的貢獻[29]。此外，4-戊烯酸、正己酸等酸類化合物在越南1樣品中含量最高，主要賦予胡椒油樹脂焦糖香氣。以上分析結果表明，越南1胡椒油樹脂在風味化合物組成及豐度方面優(yōu)于其他產地樣品，風味濃郁，品質較優(yōu)。

3 結論

本研究綜合分析比較印度尼西亞、越南、斯里蘭卡3 個產地胡椒油樹脂的胡椒堿類化合物、化學元素、揮發(fā)性風味化合物的組成及含量。結果表明，斯里蘭卡產地樣品中胡椒堿類化合物質量分數(shù)最高，越南產地樣品中胡椒堿類化合物質量分數(shù)較低。借助ICP-MS手段同時測定胡椒油樹脂樣品中54 種化學元素的含量，元素豐度按照越南＞印尼＞蘭卡順序遞減，結合多元變量統(tǒng)計分析，篩選出Cs、Na、Cu、Rb、Ru、P、Mg、Sn、Ag、K、Mo、Cr、Co 13 種元素作為判別元素。利用GC-IMS技術鑒定出90 種揮發(fā)性風味化合物，結合多元變量統(tǒng)計分析篩選出27 種具有判別意義的風味標志物，越南產地的胡椒油樹脂風味化合物含量顯著優(yōu)于其他產地樣品，風味較濃郁。綜上所述，產地是影響胡椒油樹脂化學組成的重要因素，相對而言越南產地的胡椒油樹脂辣感適中、化學元素含量最高、風味最濃郁，品質明顯優(yōu)于其他3 個產地。本研究借助多元儀器分析結合化學計量法構建了印度尼西亞、越南、斯里蘭卡產地胡椒油樹脂的化學指紋圖譜，明確了不同產地樣品的品質差異，為胡椒油樹脂的精深加工和產品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。