基于行業標準中馬和驢成分檢測方法用于騾肉檢測的分析

周 藏，項佳林，劉立兵，王金鳳，付 琦，孫曉霞，王建昌,

（1.河北醫科大學公共衛生學院，河北 石家莊 050017；2.石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050051；3.河北省環境與人群健康重點實驗室，河北 石家莊 050017）

2002年歐盟頒布的一般食品法中強調食品安全是食品政策和健康的關鍵優先事項，確認食品真偽是保證食品安全的重要內容之一[1]。然而，自2013年歐洲爆發了“馬肉風波”后，肉類摻假事件在全球范圍內層出不窮[2-4]，嚴重危及了消費者對食品行業安全的信任，引起人們對肉類摻假現象的關注，促使加強食品安全監管的需求增加?？焖?、有效、準確、可靠的檢測技術是監管和檢測食品摻偽的關鍵。

目前已有多種關于動物源性成分檢測方法用于肉類摻假鑒別，但其中大多數方法主要用于實驗室研究，很少應用于食品行業的常規分析檢測。色譜法和光譜法所需儀器昂貴，后續數據處理復雜，對操作人員的專業水平要求較高，不適用于在資源有限的地區開展檢測[5-6]；而酶聯免疫吸附實驗不能區分密切相關的物種，且因目的蛋白易變性，適用范圍小，難以推廣使用[7-8]；與之相比，基于分子生物學的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法靈敏度高，特異性好，操作簡單，且DNA受熱穩定，使得其可用于熱加工肉制品的檢測。因此，PCR是應用最廣泛的成熟動物源性成分檢測方法[9-10]。目前我國已基于實時PCR（real-time PCR）技術建立了食品中多種動物源性成分檢測的相關國家、行業或地方標準。

行業標準SN/T 3730.4—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分：驢成分檢測 實時熒光PCR法》和SN/T 3730.5—2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》以驢和馬線粒體基因ATPase 6為靶基因進行檢測，是目前常用于馬、驢成分檢測的標準方法。但在實際樣品檢測過程中，發現對于已知來源的單一動物源性成分的肉制品，存在兩種源性成分均有檢出的情況，即結果顯示馬、驢兩種成分均有檢出，與實際情況不符；考慮樣品為騾肉的情況，則與線粒體基因的嚴格母系遺傳理論相悖[11]。針對在實際檢測中發現的上述問題，本研究基于SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013分別對馬肉、驢肉和騾肉中馬、驢成分的檢測結果進行分析，并就上述標準在騾肉中出現馬、驢成分均可檢出的情況進行深入的原因分析，旨在為實驗室中騾肉樣品的檢測結果判定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共收集9 份生肉樣品，包括3 份馬肉H1～H3、3 份驢肉D1～D3和3 份騾肉L1～L3，所有樣品均來自張家口蔚縣某屠宰場。

食品基因組DNA 提取試劑盒 美國Promega公司；Perfect Start?II Probe qPCR SuperMix（2×）、2×EasyTaqPCR SuperMix（＋dye）北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖 上海貝晶生物技術有限公司；DNA Marker I分子質量標準 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1-14臺式離心機 德國Sigma公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；Quant Studio 5實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司；SL 202電子天平 德國賽多利斯公司；BT-20T恒溫金屬浴 上海本亭儀器有限公司；T-Gradient梯度PCR儀德國Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針

參照SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013合成檢測馬、驢成分的特異性引物和探針；參考諶陽等[12]的方法分別合成基于線粒體基因和核基因檢測馬、驢成分的特異性引物。所有引物和探針均由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，序列如表1所示。

表1 所需引物和探針序列信息Table 1 Information of the primers and probes used in this study

1.3.2 動物基因組DNA的提取

使用干凈無菌的剪刀對樣品深層組織進行多點取樣，置于研缽中使用液氮研磨成粉末，每取完一份樣品更換一把剪刀。分別取50 mg已研磨均勻的肉粉，置于1.5 mL離心管中，按照食品基因組DNA提取試劑盒操作說明進行核酸提取，最終以100 μL無菌水溶解基因組DNA。使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，置于-20 ℃貯存，備用。同時提取實驗室保存的馬、驢肉粉各50 mg，重復以上步驟提取基因組DNA，作為陰、陽性對照模板。

1.3.3 樣品種源確定

以提取的9 份生肉樣品的基因組DNA為模板，參考文獻[12]的引物分別基于線粒體基因和核基因對樣品中的馬、驢成分進行PCR擴增測序，分析其種源情況。PCR反應體系總體積為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為2 μL，模板DNA為1 μL，無菌水7.5 μL。進行PCR擴增的反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

1.3.4 SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013標準方法的檢測

以提取的9 份生肉樣品的基因組DNA 為模板，以ddH2O為空白對照，以馬、驢基因組DNA分別為陰性對照和陽性對照，使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物和探針對樣品中馬、驢成分分別進行檢測。real-time PCR體系總體積為25 μL：2×PerfectStart?II Probe qPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為1 μL，10 μmol/L探針為1 μL，模板DNA為1 μL，無菌水8.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環，在退火延伸時采集熒光信號。所有樣品重復檢測3 次，并記錄循環閾值（cycle threshold，Ct）。

同時使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物對樣品中馬、驢成分分別進行普通PCR擴增。PCR體系總體積為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL（終濃度1×），10 μmol/L的上、下游引物均為2 μL，模板DNA為1 μL，無菌水7.5 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取所有PCR擴增產物5 μL經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。擴增的產物由擎科生物（北京）科技有限公司測序。使用Megalign軟件結合Clustal W算法對擴增序列與馬或驢的同源性進行分析，將同源性大于98%的樣品歸為同一種[13]。

2 結果與分析

2.1 樣品DNA的濃度和純度

使用NanoDrop 2000C超微量分光光度計對提取的樣品DNA質量濃度和純度進行檢測。結果表明，所提取的樣品DNA質量濃度均在200～500 ng/μL范圍內，A260nm/A280nm值在1.7～2.0之間，A260nm/A230nm值在2.0左右，可用于后續PCR[14-15]。

2.2 樣品種源的分析結果

使用引物馬-MF/R、驢-MF/R、馬-NF/R、驢-NF/R分別對9 份樣品中的馬、驢線粒體基因和核基因片段進行擴增，將擴增產物進行測序，分析其種源情況。如圖1A所示，H1～H3在基于線粒體基因和核基因的檢測中，均只檢出馬成分，其擴增產物分別命名為馬M-H1～H3和馬N-H1～H3；D1～D3在基于線粒體基因和核基因的檢測中，均只檢出驢成分，其擴增產物分別命名為驢M-D1～D3和驢N-D1～D3。而L1～L3在基于線粒體基因檢測中，只檢出馬成分，其擴增產物分別命名為馬M-L1～L3；而在基于核基因的檢測中，馬、驢成分均有檢出，擴增產物分別命名為馬N-L1～L3和驢N-L1～L3。

圖1 樣品中馬、驢成分的PCR檢測結果Fig.1 PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

進一步對擴增產物的測序結果進行分析，結果顯示馬M-H1和馬M-L1～L3對馬的同源性分別為99.3%、100%、100%、99.3%，驢M-D1對驢的同源性為100%；馬N-H1和馬N-L1～L3對馬的同源性分別為98.4%、99.2%、99.2%、98.4%，驢N-D1和驢N-L1～L3對驢的同源性均為100%。測序分析結果與凝膠電泳成像顯示的馬、驢成分擴增情況一致，即H1～H3只含有馬成分，D1～D3只含有驢成分，L1～L3既含有馬成分，又含有驢成分。判斷H1～H3均為馬肉，D1～D3均為驢肉，L1～L3均為馬騾肉，符合預期樣品情況。

2.3 SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013標準方法的檢測結果

以9 份樣品的基因組DNA為模板，設立ddH2O為空白對照，馬、驢基因組DNA各自為陰性對照和陽性對照，同時進行馬、驢成分的real-time PCR方法檢測。結果如圖2所示，對于馬成分檢測，以驢基因組DNA作為陰性對照，未見擴增曲線，以馬基因組DNA作為陽性對照，出現特異性擴增曲線；對于驢成分檢測，以馬基因組DNA作為陰性對照，未見擴增曲線，以驢基因組DNA作為陽性對照，出現特異性擴增曲線。

圖2 樣品中馬、驢源性成分real-time PCR擴增情況Fig.2 Real-time PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

對9 份樣品分別進行馬、驢成分檢測，結果顯示，樣品H1～H3、L1～L3均檢出馬成分，且Ct值在15.00～18.00范圍內；樣品D1～D3未檢出馬成分。樣品D1～D3、L1～L3均檢測出驢成分，其中D1～D3的Ct值在13.00～15.00范圍內，L1～L3的Ct值在25.00～35.00范圍內；樣品H1～H3未檢出驢成分。重復3 次real-time PCR檢測，結果一致，所得Ct值如表2所示。

表2 real-time PCR方法檢測結果Table 2 Real-time PCR results of horse-and donkey-derived ingredients in samples

使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中的引物分別對9 份樣品中的馬、驢成分進行PCR擴增測序，對測序結果進行分析。如圖1B所示，馬、驢特異性的real-time PCR方法中的引物在普通PCR反應中對9份樣品均有擴增，將SN/T 3730.5—2013中馬成分的引物對樣品1、樣品4和樣品7～9的PCR擴增產物分別命名為馬-H1、馬-D1、馬-L1～L3；將SN/T 3730.4—2013中驢成分的引物對樣品1和樣品7～9的PCR擴增產物分別命名為驢-H1、驢-L1～L3。對擴增產物的測序結果進行分析，如圖3所示，馬-H1、馬-L1～L3與馬的同源性均為100%，與驢的同源性分別為86.1%、85.9%、86.1%、86.1%；馬-D1與馬的同源性為86.1%，與驢的同源性為100%。驢-H1與馬的同源性為100%，與驢的同源性為86.1%；驢-L1～L3與馬的同源性為91.0%、89.9%、88.6%，與驢的同源性為85.9%、91.1%、89.9%。將同源性大于98%的樣品歸為同一種，具體分類情況如表3所示。

圖3 SN/T 3730.5—2013和SN/T 3730.4—2013對樣品的PCR擴增產物序列Fig.3 Sequences of PCR amplification products from samples using SN-T 3730.5-2013 and SN/T 3730.4-2013 methods

表3 樣品中馬、驢源性成分測序結果的種源分析Table 3 Origin analysis of sequencing results of horse-and donkeyderived ingredients in samples

3 討論

騾是馬驢雜交的后代，自身不具有繁育生殖能力，因此并不屬于一個物種。目前尚無針對食品中騾成分特異性檢測的相關研究。對騾成分的檢測，通常是基于馬和驢成分的檢出情況進行綜合判斷：以核基因進行擴增檢測時，若馬、驢成分同時檢出，則可判斷為騾成分[11]。根據母系不同，騾又可分為馬騾和驢騾。此時，根據線粒體基因嚴格母系遺傳的理論，基于線粒體基因進行馬和驢成分檢測時，騾肉中可檢出其母系物種，即馬成分或驢成分[16-17]。在本研究中，先根據基于線粒體基因和核基因的檢測確定了樣品的種源情況，即樣品H1～H3均為馬肉，D1～D3均為驢肉，L1～L3均為馬騾肉，從而可以進行后續驗證實驗。

SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013均以線粒體基因ATPase 6為靶基因，進行馬、驢成分檢測時，能夠特異性區分馬和驢成分，也是目前應用最為廣泛的食品中馬、驢成分特異性檢測的標準方法。本實驗室在使用上述標準進行日常實際樣品檢測過程中，發現部分明確為非混合肉樣品，存在馬、驢兩種成分均有檢出的情況，并且一種成分Ct值一般≤20.00，另一種成分的Ct值則在25.00～35.00之間。該現象嚴重困擾了檢測人員的判斷。本研究中針對馬騾肉樣品，使用SN/T 3730.4—2013驢成分real-time PCR法檢測時，Ct值在25.00～35.00范圍內出現擴增，根據標準中的結果判定原則，應判為檢出驢成分，但是與實際樣品成分不符。

李亞楠等[18]在SN/T 3730.4—2013標準中檢出限合理性的探討中，指出以非混合肉樣品的基因組DNA為模板，馬成分real-time PCR方法檢測Ct值為17.00～20.00的同時，驢成分real-time PCR方法檢測Ct值在25.00～35.00范圍內，原因可能是對非混合肉樣品中馬成分的非特異性擴增。與其結論相比，本研究中使用SN/T 3730.4驢成分檢測Ct值為25.00～35.00的樣品也檢出了馬成分（Ct值為16.00～18.00），但并非所有Ct值在16.00～18.00范圍內的馬基因組DNA在驢成分檢測方法中都出現非特異性擴增，且李亞楠等[18]的研究僅對樣品檢出的馬成分進行了測序分析，未確定樣品的種源，不能排除馬騾肉的情況。

使用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013的引物，通過普通PCR方法擴增馬肉、驢肉的基因組DNA后，出現了相同的目的條帶，盡管不能特異性區分馬和驢，但無論是馬成分引物對驢的非特異性擴增，還是驢成分引物對馬的非特異性擴增，擴增片段的測序結果仍能正確鑒別出馬和驢，如馬-D和驢-H測序結果的種源分析。因此，若馬騾中線粒體靶基因序列完全遺傳自馬，則驢成分引物同樣能對其中的馬成分進行擴增并且測序結果將與馬同源。但實際結果顯示，使用驢成分引物對馬騾中線粒體靶基因序列的擴增產物與馬的同源性分別為91.0%、89.9%和88.6%，不能歸于馬種，與驢的同源性分別為85.9%、91.1%和89.9%，也不能歸于驢種。

基于線粒體基因嚴格母系遺傳的理論，在對子代線粒體基因進行檢測時，僅能檢測出母系物種成分[19]。然而，對線粒體基因進行提純較因難，在實際應用中，通常使用基因組DNA進行檢測。已有研究表明，核基因中存在線粒體基因序列Numts[20]。自1994年，Lopez等[20]在家貓核基因組中發現了一段與線粒體基因組同源的序列，此后，已陸續在人類、真菌、植物、節肢動物、鳥類和其他哺乳動物中發現了大量的Numts[20-25]。目前，核基因中的Numts片段已經涵蓋了線粒體基因組的全部基因，物種不同，其重復數不同，可為10～500 次[20-21]，且Numts內部常會發生堿基的插入、缺失[23-27]。因此，針對線粒體基因進行檢測時，若核基因中存在靶序列，將對檢測結果產生干擾，并可能從子代基因組DNA中檢測到父系線粒體基因片段。本研究針對馬騾肉樣品，應用SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013對樣品進行馬、驢成分檢測，結果表明，兩種成分均能檢出，但Ct值差異明顯。造成該現象的原因可能是馬騾全基因組DNA中針對馬、驢的擴增片段存在于兩個不同的位點，即分別位于線粒體基因和核基因，且兩個位點的拷貝數相差較大，分別對應線粒體基因的拷貝數和核基因中Numts的重復數[28]，其中線粒體基因的拷貝數通常為102～104[29-30]。以確定的馬騾肉樣品基因組DNA為模板，進一步使用SN/T 3730.4—2013的引物進行普通PCR擴增，其測序結果與SN/T 3730.5—2013的測序結果不同，可能為驢的該線粒體基因片段在核基因中發生了部分堿基的插入或缺失，進一步使得馬成分引物不能識別核基因中的位點，而驢成分引物可以識別該位點，從而與對線粒體基因位點的識別一同擴增，影響了測序的準確性，導致對擴增產物的測序結果既不與馬同源，也不與驢同源。雖然本研究確定了樣品的種源情況，驗證了SN/T 3730.4—2013應用于騾肉檢測的能力。但由于SN/T 3730.4—2013和SN/T 3730.5—2013中擴增片段均較短，為130 bp，因此，其擴增片段的測序結果在準確鑒別物種上存在一定的局限。

4 結論

在日常檢測工作中，SN/T 3730.4—2013 和SN/T 3730.5—2013能夠實現肉制品中馬、驢成分的特異性鑒別檢測。對已知來源于單一動物源性成分樣品的分析中，出現一種成分Ct值較低（一般≤20.00），同時另一種成分也出現擴增且Ct值在25.00～35.00范圍內，應考慮騾源性的可能。