光甘草定/羥丙基-β-環糊精包合物的釋放特性、黏液滲透性及細胞攝取

李德鋒，樊金玲，姚培培，任國艷，杜 琳，張曉宇

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

光甘草定（glabridin，GLD）是光果甘草特有的異黃烷類化合物，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、神經保護等[1-5]。但是，GLD的生物利用度很低[6-7]，無法在體內充分發揮其功能，從而很大程度上制約了GLD的應用。

溶解度低是GLD 生物利用度低的一個主要原因。小腸上皮細胞主要以被動擴散的跨膜轉運方式攝取和轉運GLD[7]，而被動擴散是由小腸上皮細胞腸腔內消化液中高藥物濃度驅動。GLD的水溶性極低（在25 ℃水中溶解度約7 μg/mL[8]），造成口服利用時在腸腔中的濃度很小，嚴重影響它的小腸吸收率。透過腸上皮細胞的滲透性差是影響GLD 生物利用度的另一重要原因。Ito等[6]報道了10 μmol/LGLD 透過Caco-2 細胞單層模的Papp僅為（1.70±0.16）×10-5cm/s，為低滲透性分子。此外，人體腸道上皮表面存在著由水和黏蛋白為主要成分的黏液層，是影響很多營養成分或藥物吸收的重要物理屏障[9]。迄今為止，尚缺少有關GLD對黏液層的滲透性研究。

環糊精（cyclodextrin，CD）具有外親水、內疏水的獨特籠狀結構，能夠通過靜電相互作用、氫鍵和范德華力等非共價力與多種化合物相互作用，尤其是疏水性化合物，疏水性化合物被包合在CD的空腔中，形成主-客體包合物，從而使難溶性化合物的溶解度得到提高[6,10-12]。研究表明：某些黃酮的CD包合物可促進黃酮化合物的口服吸收，提高其生物利用度[11]，可能途徑及機制有：1）改善難溶性黃酮化合物的溶出動力學，提高其瞬時飽和溶解度[10]；2）增強親脂性黃酮化合物透過黏液層的能力，提高腸壁藥物濃度[12]；3）增加黃酮化合物的細胞膜滲透性等[13]。

本團隊的前期研究表明：多種CD 對GLD 均有很好的包合作用[14]。本實驗選用羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）包合GLD，采用冷凍干燥法制備了GLD/HP-β-CD包合物，旨在提高GLD在水中的溶解度；通過掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）、差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）法和分子對接技術分別對包合物的表面狀態、GLD的存在形式、GLD與HP-β-CD的相互作用及空間構象進行了分析；采用體外實驗研究GLD被包合前后在胃、腸液中的溶出和釋放特性，利用Transwell小室法研究了包合前后GLD在黏液層中的滲透性；采用Caco-2細胞研究了包合對小腸攝取GLD的影響。研究探討載體HP-β-CD對GLD吸收的影響及可能機制，以期為進一步推動GLD在功能食品、膳食補充劑等領域中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLD 洛陽藍斯利科技有限公司；0.45 μm濾膜日本Millipore公司；HP-β-CD（6位羥基取代，取代度為5.8～7.5）湖北恒碩化工有限公司；MTT上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、氯化鈉、乙腈、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、冰醋酸、二甲基亞砜、吐溫-80 天津市德恩化學試劑有限公司；溴化鉀 上海網化化工科技有限公司；Transwell-24孔板 美國康寧有限公司；鋁坩堝 上海菁儀化工材料有限公司；再生纖維素透析袋（800～1 000 Da）上海吉至生化科技有限公司；黏液素II 上海臻科生物科技有限公司；BCA蛋白質試劑盒 上海鈺博生物科技有限公司；MEM培養基、雙抗 美國Hyclone公司；胎牛血清 美國Gibco公司；胰酶（含酚紅）德國Merck公司；Caco-2細胞 美國典型培養物保藏中心。

1.2 儀器與設備

L5S紫外分光光度計 浙江恒岳儀器有限公司；TENSPOR27 FTIR光譜儀 德國Bruker公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 西安蔚然電子科技有限公司；DSC1型DSC儀上海胥元機械有限公司；EClassical 3100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀蘇州格雷弗工業裝備有限公司；SEM 北京鉑瑞達科技有限公司；DF-101S水浴加熱磁力攪拌器 濟南歐萊博生物科技有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器杭州微米派科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；CQT-191IR恒溫培養箱 上海金畔生物科技有限公司；RS-232C酶標儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 GLD/HP-β-CD包合物的制備

按物質的量比1∶1分別稱取適量的GLD和HP-β-CD，然后用乙醇將其配成質量濃度為30 mg/mL的GLD溶液；用去離子水將其配成濃度為0.04 mol/L的HP-β-CD溶液。將兩種溶液混合，并在25 ℃、200 r/min條件下持續振蕩24 h。在旋轉蒸發器（45 ℃）中除去所得溶液中所含有的乙醇，之后在-20 ℃的環境中預凍12 h。最后在冷凍干燥機中凍干，將凍干后的樣品過80 目篩，即得到所需包合物。

1.3.2 GLD/HP-β-CD包合物的飽和溶解度、包合率和載藥率的測定

1.3.2.1 飽和溶解度

在室溫條件下（25 ℃）借助超聲，使GLD/HP-β-CD包合物在1 mL水中溶解至平衡狀態。溶液過0.45 μm濾膜后，其濾液用80%乙醇溶液進行稀釋。在281 nm波長處測定吸光度，并根據得到的吸光度計算溶液中GLD的含量，即為飽和溶解度。

1.3.2.2 包合率和載藥率

參照文獻[15-17]。分別稱取兩份質量均為10 mg的GLD/HP-β-CD包合物。其中一份先用1 mL去離子水溶解，加入9 mL乙腈，將其在25 ℃條件下，經超聲處理20 min。5 000 r/min離心5 min后，將上清液收集到新離心管中，用乙腈稀釋10 倍。在281 nm波長處測定其吸光度，根據標準曲線計算出溶液中GLD的質量，即為包合物樣品中GLD的總質量。另一份包合物用石油醚（400 μL）溶解，離心后棄掉上清液（除去未被包合的GLD）；重復操作兩次；在通風櫥中，使樣品中的石油醚揮發；按上述包合物樣品中GLD總質量的測定步驟對此樣品中的GLD質量進行測定，即被包合的GLD質量。按照下式計算包合率和載藥率：

1.3.3 GLD/HP-β-CD固體包合物的結構表征

1.3.3.1 SEM

將GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質的量比1∶1均勻混合）及GLD/HP-β-CD包合物用導電的雙面膠固定在樣品臺上，并噴鍍鉑金，在3 kW條件下觀察各樣品的表面形態。

1.3.3.2 DSC分析

分別稱取5 mg的GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質的量比1∶1均勻混合）及GLD/HPβ-CD包合物進行DSC的測定。其氮氣流量為10 mL/min，溫度掃描的范圍設定在25～300 ℃，升溫速率設為10 ℃/min，并以空盤作空白對比，記錄每個樣品的DSC曲線。

1.3.3.3 FTIR光譜法

將適量的GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物（以物質的量比1∶1均勻混合）及GLD/HP-β-CD包合物分別與溴化鉀粉末以質量比1∶100均勻混合，然后在研缽中充分研磨，壓片制得樣品薄片。利用FTIR檢測樣品時，背景單通道掃描的樣品是純溴化鉀粉末。掃描范圍設定為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32 次。

1.3.3.4 分子對接

β-CD模型文件在劍橋晶體數據庫（https://ccdc.cam.ac.uk/）中下載，其編號為1107194，去H2O后，利用Gauss View軟件將7 個葡萄糖單元中的6 位羥基氫用羥丙基進行替換，取代度為7；再通過Gaussian 09軟件中半經驗算法的PM6基組，對幾何構型進行優化，得到HP-β-CD模型；GLD 3D模型文件在PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載，其CID編號為124052，利用Gaussian 09軟件中的DFT方法（B3LYP/6-31G）對3D模型進行優化，再通過Open Babel GUI軟件將優化后的文件格式轉化為pdb格式。

采用Auto Dock Tools 4.2軟件對受體（HP-β-CD）與配體（GLD）分別處理，添加原子電荷和H原子，并在GLD分子內設置可旋轉單鍵數量及根原子，處理好的受體和配體保存為pdbqt文件格式。對接方法采用半柔性對接。分子對接時，以對接盒子的中心點為受體幾何中心，并且盒子的尺寸設置為60 ?×60 ?×60 ?。搜索參數選用拉馬克遺傳基因算法、算法對接輪數設為100、能量評估的最大數目設為250 000，其他參數取默認值。

1.3.4 GLD/HP-β-CD包合物在胃腸液中的溶出

β-CD在胃及小腸部分不被人體消化酶作用[18]。按照Maltais等[19]的方法配制不含消化酶的模擬胃、腸液。用100 mL去離子水將準確稱取的NaCl（2.0 g）溶解在燒杯中，用濃鹽酸調節pH值至1.2，即為模擬胃液。用250 mL去離子水將準確稱取的KH2PO4（6.8 g）也溶解在燒杯中，用0.2 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.9，即為模擬腸液。量取出900 mL胃液或腸液，將其放置于1 000 mL燒杯內，作為溶出介質。在水浴加熱方式的磁力攪拌器中進行攪拌，其水溫保持（37±0.5）℃，攪拌的轉速保持50 r/min。稱取一定量的GLD、GLD與HP-β-CD的物理混合物及GLD/HP-β-CD樣品（GLD含量為100 mg），分別加入燒杯中，并立即開始計時；分別在2、4、6、8、10、15、20、30、45、60 min時吸取1 mL溶出液，同時添加等量新鮮的溶出介質。取出的樣液過0.45 μm的微孔濾膜后，取0.5 mL的濾液，并向其中加入4.5 mL乙腈，充分混勻后，在5 000 r/min離心5 min，取上清液，在281 nm波長處測定吸光度，按下式計算溶出率：

式中：A為某一時間點每1 mL 樣液中溶出的GLD質量/μg；B為之前所有時間點取出的1 mL液體中GLD質量/μg。

1.3.5 GLD/HP-β-CD包合物在胃腸液中的釋放

1.3.5.1 透析袋預處理

將透析袋（800～1 000 Da）剪成8～10 cm小段，去離子水清洗后方可使用。

1.3.5.2 釋放介質的配制

按照1.3.4節所述配制模擬胃、腸液。在模擬胃、腸液中分別加入一定量吐溫-80（體積分數2%）作為胃、腸液釋放介質，其中吐溫-80用于促進GLD在介質中溶解。

1.3.5.3 HPLC法測定GLD含量

采用EClassical 3100 HPLC系統測定GLD的含量；色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 nm，1.7 μm）；流動相：A為水（含1%冰醋酸），B為乙腈，采用A∶B=40∶60進行等度洗脫；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長281 nm。GLD 質量濃度0～100 ng/mL，標準曲線方程為y=0.164 92x＋0.117 58。

1.3.5.4 釋放實驗

燒杯中加300 mL胃液釋放介質（含2%吐溫-80的模擬胃液）；精確稱取一定量GLD/HP-β-CD樣品，將其溶于去離子水中，使GLD質量濃度均為2 mg/mL。分別取3 mL樣品液放入預處理過的透析袋中，用夾子夾緊兩端，放入燒杯中，保證透析袋完全浸沒在釋放介質中。將燒杯放入37 ℃水浴鍋中，每間隔一段時間（0.5、1、2 h）從燒杯中取出1 mL袋外溶液，同時補充1 mL新鮮的胃液釋放介質。2 h后，將燒杯中的釋放介質更換為腸液釋放介質，同樣每間隔一段時間（4、7、16、20、24 h），從燒杯中取出1 mL袋外溶液，同時補充1 mL新鮮的腸液釋放介質。

將上述不同時間段取出的1 mL釋放介質于冷凍干燥機中凍干。加入0.2 mL乙腈進行復溶，0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC測定GLD的濃度（色譜條件見1.3.5.3節）。計算1 mL釋放介質中GLD的質量，并按下式計算累積釋放率：

式中：A為某一時間點每1 mL樣液中釋放的GLD質量/μg；B為之前所有時間點取出的1 mL液體中釋放出的GLD質量/μg。

1.3.6 GLD/HP-β-CD包合物在黏液層的滲透性

1.3.6.1 黏液的配制

配制pH 7.4的緩沖溶液，然后稱取一定量的黏蛋白，將其溶接在pH 7.4的緩沖溶液中，配成一定濃度的黏蛋白溶液。

1.3.6.2 黏液滲透實驗（Transwell小室擴散法）

利用24 孔Transwell小室研究不同GLD-樣品在黏液層中的擴散行為，該裝置包含一個供體室和受體室，同時中間有個聚碳酸酯半透膜，它能允許粒子穿過但黏液不能滲透通過。Transwell小室在使用前，供體室和受體室中均加入pH 7.4的磷酸緩沖液，平衡30 min。將40 μL的黏蛋白溶液加入到供體室的半透膜上，受體室加入1 000 μL的磷酸緩沖液，上室分別加入200 μL相同質量濃度的1 mg/mL的GLD/DMSO或者GLD/HP-β-CD溶液，將裝置至于37 ℃轉速為100 r/min的搖床上培養6 h，于1、2、3、4、5、6 h時，從受體室取出0.15 mL，并向室中加入等量的預熱緩沖液。

1.3.6.3 GLD含量測定

GLD/DMSO組的樣品取出后于冷凍干燥機中凍干，后加入200 μL乙腈復溶，0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC法檢測其中GLD的含量，HPLC法的條件見1.3.5.3節；GLD/HP-β-CD組的樣品取出后可直接用紫外分光光度計檢測其吸光度并計算其中GLD的含量。

1.3.6.4 表觀滲透系數

黏液滲透結果用表觀滲透系數（Papp）表示，計算公式如下：

式中：dQ/dt為受體室在單位時間獲得的藥物量/（μg/（mL·s））；A為Transwell的膜表面積/cm2；C0為藥物的初始質量濃度/（μg/mL）。

1.3.6.5 GLD與黏蛋白的分子對接

應用AutoDock Tools 4.2軟件將黏蛋白（MUC2）與GLD進行分子對接。GLD分子模型的建立參照1.3.3.4節；從PDB數據庫中得到了單體MUC2（MUC2-1）（PDB ID：6TM6）和四聚體MUC2（MUC2-4）（PDB ID：6RBF），采用Auto Dock Tools 4.2工具對上述蛋白受體和配體進行常規處理，再用其Autogrid模塊得到對接活性位點，然后開始進行分子對接，得到結合能，探討GLD與兩種MUC2之間的親和力。并利用PyMOL和Discovery Studio 4.5軟件對分子對接進行可視化分析。

1.3.7 Caco-2細胞對GLD的攝取

1.3.7.1 樣品準備

用DMSO溶解GLD，并將其配制成32.44 mg/mL的母液，然后用MEM培養基稀釋為不同濃度的樣品（DMSO體積分數0.1%），其濃度分別為10、30、50、70、90、100 μmol/L，記為GLD/DMSO組；用MEM培養基溶解GLD，并配制成濃度梯度同GLD/DMSO組的溶液，記為GLD/H2O組。用MEM培養基復溶GLD/HP-β-CD包合物，并配制成濃度梯度也同GLD/DMSO組的溶液，記為GLD/HP-β-CD組。

1.3.7.2 樣品對Caco-2細胞的細胞毒作用

采用MTT法測定不同濃度樣品對Caco-2細胞增殖的抑制作用，用于確定Caco-2細胞攝取實驗中GLD的安全使用濃度。在37 ℃、5% CO2氣體的恒溫培養箱中，將Caco-2細胞在含20%胎牛血清、100 U/mL雙抗的MEM培養基中培養至80%（鋪滿瓶底）。用胰酶消化8 min后，調整細胞濃度為1×105個/mL，將其接種在96 孔板中，每孔200 μL，培養24 h。棄去舊培養基，加入200 μL新鮮培養基或樣品液，作用4 h。結束后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，每孔加入200 μL的新鮮培養基和10 μL的MTT，繼續作用4 h。棄去培養基，添加150 μL DMSO溶液，10 min后，用酶標儀于波長550 nm處測定各孔吸光度。未添加MTT的孔記為A0，添加等體積培養基的孔記為A1，添加MTT的樣品孔記為A2，每個樣品6 個平行孔，根據下式計算細胞存活率：

1.3.7.3 細胞攝取實驗

取對數生長期的Caco-2細胞進行消化，計數后以2.5×105個/mL接種在6 孔板內，每孔加入2 mL細胞懸液，在37 ℃、5% CO2氣體的恒溫培養箱中培養；待細胞融合至80%～90%后（鋪滿瓶底），去除舊培養基，分別加入50 μmol/L的樣品液，每孔2 mL。培養4 h后吸出培養基，用PBS輕輕洗滌2 次（以下步驟均在4 ℃條件下進行），加入0.5 mL胰酶消化8 min，加1 mL MEM培養基中止消化；收集細胞至2 mL的離心管內，1 500 r/min離心3 min，去除上清液；加入1 mL預冷的去離子水重懸細胞，超聲粉碎（功率350 W，工作3 s，停10 s，工作30 次，超聲儀提前用冰塊降溫至4 ℃）；隨后高速冷凍離心機離心（10 000 r/min，10 min，4 ℃），吸取上清液0.9 mL用于后續實驗。

其中，先取上述0.9 mL上清液中的0.8 mL放離心管中于冷凍干燥機中凍干。凍干后，GLD/H2O、GLD/DMSO組樣品加入0.2 mL乙腈進行復溶；GLD/HP-β-CD組樣品先加入20 μL去離子水，后加入0.18 mL乙腈進行復溶；復溶后樣品用0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC法測定上清液中的GLD濃度（色譜條件見1.3.5.3節）。

同時，再取上述0.9 mL上清液中的20 μL，采用4,4′-二羧基-2,2-聯喹啉法（bicinchoninic acid，BCA法）進行細胞蛋白含量的測定。

1.3.7.4 BCA法測定細胞蛋白含量

標準曲線的繪制：將蛋白質標準品（1 mg/mL）按0、20、40、60、80、120、160、200 μL的梯度分別加入到1.5 mL離心管中，添加標準品稀釋液，使最終每管體積為200 μL，且標準品的質量濃度依次為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。將上述標準品按其質量濃度梯度依次加入96 孔板中，每孔20 μL，且每孔3 個平行，再向各孔中加入200 μL的BCA溶液，在37 ℃烘箱中反應30 min，最后在酶標儀562 nm測定每孔的吸光度。繪制標準曲線，其橫坐標為蛋白質質量濃度，縱坐標為吸光度。標準曲線方程為y=0.614 7x＋0.013 3。

細胞蛋白含量的測定：在96 孔板中加入樣品，每孔20 μL，每個樣品3 個平行孔，每孔再加入200 μL的BCA溶液，在37 ℃烘箱中反應30 min，在562 nm波長處測定各孔的吸光度。根據標準曲線可得細胞中蛋白質的含量。

1.3.7.5 細胞攝取量計算

根據下式計算細胞的攝取量：

式中：CGLD為細胞內GLD的質量濃度/（μg/mL）；Cprotein為細胞懸液中蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.4 數據統計及圖像處理

2 結果與分析

2.1 GLD/HP-β-CD的制備及結構表征

2.1.1 GLD/HP-β-CD的制備

經冷凍干燥法制備的GLD/HP-β-CD包合物如圖1所示，GLD/HP-β-CD的包合率、載藥率和飽和溶解度見表1，其包合率和載藥率分別為90.03%、14.51%，載體HP-β-CD能使GLD在水中的飽和溶解度顯著提高至109.36 mg/mL。Wei Yongqin等[8]研究表明GLD在25 ℃水中溶解度約7 μg/mL。與此相比，GLD經HP-β-CD包合后其在水中的溶解度提高了15 622 倍。已有研究表明，通過將β-乳球蛋白[20]、卵清蛋白[21]分別與GLD形成復合物后，可以使GLD在水中的溶解度分別提高至0.231 mg/mL和0.032 mg/mL。而采用HP-β-CD包合GLD，使其在水中的溶解度遠高于上述研究中的方式。

表1 GLD/HP-β-CD的包合率、載藥率和飽和溶解度Table 1 Encapsulation efficiency,drug loading and saturation solubility of GLD/HP-β-CD

圖1 GLD/HP-β-CD固體包合物Fig.1 Visual appearance of GLD/HP-β-CD solid inclusion complexes

2.1.2 GLD/HP-β-CD的結構表征

2.1.2.1 SEM

利用SEM觀察到GLD、HP-β-CD、GLD與HP-β-CD的物理混合物及GLD/HP-β-CD包合物的外部形貌如圖2所示，GLD呈柱狀晶體結構，輪廓清晰；HP-β-CD呈表面多孔的球形結構[22]；物理混合物中同時觀察到柱狀的GLD和球狀HP-β-CD；GLD/HP-β-CD固體包合物呈邊緣鋒利、形狀不規則的片狀結構。

圖2 GLD/HP-β-CD的SEM圖像Fig.2 SEM image of GLD/HP-β-CD

2.1.2.2 DSC

如圖3所示，在233 ℃處，發現到GLD有尖銳的熔融峰，此溫度是該晶體的熔點[23]。在94.08 ℃處，顯示出HP-β-CD具有較寬的吸熱熔融峰，這與HP-β-CD水分損失有關[24]。在物理混合物的DSC曲線中發現，其曲線圖是GLD與HP-β-CD吸熱峰的簡單疊加，表明這兩種物質僅是簡單的物理混合而彼此之間未發生相互作用，在物理混合物中GLD仍表現出晶體特征。在GLD/HP-β-CD包合物的DSC曲線中，HP-β-CD在94.08 ℃處的峰偏移至77.62 ℃，并且強度降低，GLD特征吸熱峰則完全消失，這可能是由于藥物分子取代了HP-β-CD空腔內的水分子造成[25]。以上結果表明，在GLD/HP-β-CD包合物中，GLD是以無定形非晶體的形式存在，GLD已被HP-β-CD包合在空腔內形成了包合物。

圖3 GLD/HP-β-CD的DSC分析Fig.3 DSC analysis of GLD/HP-β-CD

2.1.2.3 FTIR光譜

如圖4所示，在GLD的光譜中，峰位3 346 cm-1出現一強而寬的峰，為O—H的伸縮振動，1 518、1 464 cm-1為芳香環C＝C的伸縮振動，2 964、2 920 cm-1為—CH3的吸收峰[20]。HP-β-CD紅外光譜圖，在波數為3 401 cm-1處有一個由O—H 官能團的振動而產生的寬峰，在2 930 cm-1處有一個峰，由O—CH3官能團的振動產生；1 156、1 083、1 032 cm-1處各有一個峰，是C—O的振動吸收峰[26]。在物理混合物的光譜中，GLD和HP-β-CD的特征吸收峰依然存在，表明物理混合物只是主客體分子的簡單疊加，GLD和HP-β-CD之間沒有相互作用或僅有微弱的相互作用。GLD/HP-β-CD包合物在波數為3 385 cm-1處有一個寬峰，該峰應由HP-β-CD的3 401 cm-1偏移所至，這可能是由GLD與HP-β-CD分子間氫鍵的相互作用造成[27]；與物理混合物光譜相比，GLD/HP-β-CD包合物在波數1 518 cm-1和1 464 cm-1處的吸收峰明顯減弱，這可能是由于GLD進入到HP-β-CD分子的空腔中從而使其芳香環C＝C的伸縮振動減弱。

圖4 GLD/HP-β-CD的FTIR分析Fig.4 FTIR analysis of GLD/HP-β-CD

2.1.2.4 分子對接

如圖5所示，GLD分子能夠完整地進入到HP-β-CD的空腔內，以A環指向CDs的小口端為最佳構象；B環上C2位的OH氫與HP-β-CD某2 個葡萄糖單元中間的氧之間形成一個氫鍵（鍵長為2.0 ?），氫鍵的形成有助于包合物的穩定。GLD與HP-β-CD之間的最佳結合能為-7.37 kcal/mol，分子間的范德華力為-8.12 kcal/mol，表明GLD與HP-β-CD分子間相互作用的主要作用力是范德華力。

圖5 GLD與HP-β-CD對接的最佳能量構象及相互作用圖Fig.5 Optimal energy conformation and interaction of GLD with HP-β-CD investigated by molecular docking

2.2 GLD/HP-β-CD提高GLD的小腸吸收

2.2.1 GLD/HP-β-CD在模擬胃、腸液的溶出特性

難溶性的藥物或生物活性成分的累積溶出率較低，是導致其在體內吸收率低、生物利用度差的重要原因之一[28]。因此，可以通過累積溶出率在一定程度預測難溶性化合物在體內的吸收速率和利用程度[29]。本實驗采用體外模擬實驗，以模擬胃、腸液為溶出介質，將透過0.45 μm微孔濾膜的樣品計為溶出樣品，通過定時取樣測定溶出樣品中的GLD含量，計算累積溶出率、繪制溶出曲線，研究HP-β-CD包合對GLD溶出特性的影響，結果如圖6所示。在模擬胃液和腸液中，GLD在1 h的累積溶出率分別為4%和5%；物理混合物的溶出率略有提高，1 h時溶出率分別約為9%和8%；GLD/HP-β-CD包合物的溶出率均極顯著提高，1 h時溶出率分別為63%和62%，是未被HP-β-CD包合GLD累積溶出率的15.75、12.4 倍。表明GLD經HP-β-CD包合后不僅水溶性顯著提高，在胃、腸液中的溶出速率和累積溶出率也極顯著改善，這是由于GLD與CD上的氫鍵相互作用以及GLD在包合物中的結晶度減少引起。

圖6 GLD/HP-β-CD在模擬胃液（a）、腸液（b）中的溶出曲線Fig.6 Dissolution curves of GLD/HP-β-CD in simulated gastric (a) and intestinal fluid (b)

2.2.2 GLD/HP-β-CD在模擬胃、腸液的釋放特性

藥物或活性分子從CD載體中游離出來的釋放過程與CD載體藥物的溶解過程同時進行。CD與藥物的結合力很大程度上決定了釋放量，也由此影響了藥物吸收：二者結合越強，藥物或活性分子越難從載體中釋放，吸收就越少。因此，CD包合通常情況下總能增加藥物的溶解度、改善溶出性質，但吸收增加不是必然結果。因此，越來越多致力于提高藥物吸收的研究更加關注藥物的釋放過程。

GLD具有溶解度低、腸道滲透性差的特點。根據BCS分類，為BCS IV類藥物。提高GLD的水溶性、改善其滲透性，是提高其在體內吸收利用的關鍵。本部分采用截留分子質量為800～1 000 Da的透析袋體外實驗方法研究GLD和GLD/HP-β-CD包合物中的GLD在胃液2 h、腸液22 h連續條件下的釋放過程（由于實驗初期GLD的釋放量較小，本部分采用HPLC法檢測透過液中的GLD含量），結果如圖7所示。GLD在20 h時開始檢測到GLD，24 h的累積釋放率為0.32%；GLD與HP-β-CD物理混合物在第16小時開始檢測到GLD，第24小時的累積釋放率為1.33%；GLD/HP-β-CD從1 h開始檢測到GLD，在此后的24 h內累積釋放率呈現線性增長趨勢，第24小時達16.98%，相對未被包合GLD累積釋放率提高約53 倍。這一結果表明：HP-β-CD包合不僅顯著提高了的GLD溶解度、改善了溶出性質，同時包合物中的GLD在腸液中能較好地釋放，預示著GLD/HP-β-CD可有效提高腸腔中游離GLD分子的濃度。

圖7 GLD/HP-β-CD在胃腸液連續條件下的釋放曲線Fig.7 Continuous release curve of GLD/HP-β-CD in simulated gastrointestinal fluid

2.2.3 GLD/HP-β-CD在黏液層的滲透性

人體腸道上皮表面存在著一層由水和黏蛋白為主要成分的黏液；黏液不斷地從黏膜表面分泌和脫落，形成一種立體網格狀、且動態變化的物理屏障，具有清除有害物質的作用，但同時也限制了藥物的吸收[9]。本實驗利用Transwell小室法研究了HP-β-CD包合前后GLD透過黏液層的能力。為考察在溶解狀態下游離的GLD分子滲透通過黏液層的能力，本實驗將GLD充分溶解于DMSO后再進行Transwell小室的透過實驗，以排除GLD不溶于水時聚集成大顆粒對實驗結果的干擾。結果表明：采用HPLC法，第4小時接受室開始檢測到GLD，對應的累積滲透率僅為0.02%、滲透系數僅為9.24×10-9cm/s，說明游離的GLD分子幾乎無法滲透黏液層；GLD/HPβ-CD在黏液層中4 h的累積滲透率為32%，滲透系數為1.43×10-5cm/s，是GLD的1 600 倍（表2）。實驗進一步選用不同質量濃度黏蛋白進行GLD/HP-β-CD的滲透實驗，結果顯示：黏蛋白質量濃度越大，GLD/HP-β-CD累積滲透率越小（圖8）。上述研究表明：黏蛋白構成的黏液層是GLD到達腸上皮細胞的主要屏障，而GLD/HP-β-CD則顯著提高了GLD透過黏液層的能力。

表2 不同樣品在20 mg/mL黏液層中Papp值Table 2 Papp values of GLD/HP-β-CD in 20 mg/mL mucous layer 10-5 cm/s

圖8 黏蛋白質量濃度對GLD/HP-β-CD累積滲透率的影響Fig.8 Effects of different concentrations of mucin on the cumulative permeability of GLD/HP-β-CD

為進一步探討GLD透過黏液層能力差的原因，采用分子對接技術研究GLD與腸道黏液層的主要成分MUC2的單體（MUC2-1）和四聚體（MUC2-4）的相互作用，結果圖9所示。GLD與MUC2-1的結合位點位于MUC2-1的表面凹陷中，與MUC2-4的結合位點位于4 個MUC2-1相互接合區域的凹槽中；與MUC2-1和MUC2-4的結合能分別為-6.95 kcal/mol和-5.85 kcal/mol，均小于-5.0 kcal/mol，表明GLD與MUC2單體和四聚體均具有較好的親和力[30]。氫鍵、范德華力、π-烷基（疏水作用的一種）是兩分子間的主要作用力。例如：GLD與MUC2-1的CYS-1338等3 個氨基酸殘基形成氫鍵，與ASP-1358等5 個氨酸酸殘基通過范德華力產生相互作用。上述結果表明：GLD與MUC2分子間存在較強的相互作用，這可能是造成GLD即使溶解在DMSO中，滲透性仍很差的一個重要原因。在GLD/HP-β-CD包合物中，GLD整個分子處于HP-β-CD的疏水空腔中，無法與MUC2產生相互作用；另一方面，由于HP-β-CD表面親水，推測其不能與MUC2發生較強的相互作用，因此，GLD/HPβ-CD包合物可以順利透過腸黏液層。

圖9 GLD與MUC2分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of GLD and MUC2

2.2.4 Caco-2細胞對GLD的攝取

藥物或活性分子被小腸細胞攝取是其吸收過程的又一重要環節；高攝取量通常是高吸收率、高生物利用度的前提和保障。載體可能因改變細胞膜滲透性而影響藥物的細胞攝取，進而影響吸收。Caco-2細胞在結構和生化特性上都與小腸上皮細胞相似，因此被國內外廣泛地用于研究藥物的小腸攝取和吸收[31]。本實驗采用Caco-2細胞模擬小腸上皮細胞，研究了GLD/HP-β-CD包合物對GLD細胞攝取的影響。

2.2.4.1 細胞毒性

不同濃度GLD樣品處理Caco-2細胞4 h，細胞存活率如圖10所示。在10～50 μmol/L范圍內，GLD/H2O、GLD/DMSO及GLD/HP-β-CD處理的細胞存活率均在85%以上，基本對細胞無毒副作用[32]。因此，選擇濃度50 μmol/L做3 個樣品后續的攝取實驗。

圖10 不同濃度GLD樣品處理的Caco-2細胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of different concentrations of free and encapsulated GLD to Caco-2 cells

2.2.4.2 Caco-2細胞對GLD的攝取量

50 μmol/L的GLD/H2O、GLD/DMSO及GLD/HP-β-CD孵育Caco-2細胞4 h后，Caco-2細胞對樣品中GLD的攝取量如圖11所示。Caco-2細胞對GLD/H2O組的攝取量最小，為0.039 mg/g；對GLD/DMSO樣品的攝取量顯著高于GLD/H2O組，約為0.113 mg/g，是GLD/H2O組的2.9 倍。GLD/HP-β-CD的細胞攝取率達0.349 mg/g，比GLD/H2O組提高了795%，比GLD/DMSO組提高了209%。

圖11 GLD-樣品在4 h對Caco-2細胞的攝取量Fig.11 Uptake of free and encapsulated GLD by Caco-2 cells at 4 h

對于GLD/H2O和GLD/DMSO樣品，GLD主要以被動擴散的方式通過細胞膜從而被Caco-2細胞攝取。被動擴散方式下，GLD在細胞膜兩側的濃度差是推動其進入細胞的主要動力。DMSO提高了GLD的水溶性，因此Caco-2細胞對GLD/DMSO樣品的攝取量遠高于GLD/H2O樣品。與GLD/H2O相比，GLD/HP-β-CD可以顯著提高GLD在細胞培養基中的濃度，因此也可顯著提高被動運輸方式下小腸上皮細胞對GLD的攝取量。而Caco-2細胞對GLD/HP-β-CD中GLD的攝取量甚至顯著高于GLD/DMSO樣品，表明除被動運輸外，還存在其他的攝取方式，如通過內吞作用進入細胞從而提高細胞的攝取量。

3 結論

制備GLD/HP-β-CD固體包合物，GLD/HP-β-CD中GLD的包合率和載藥率分別為90.03%、14.51%，載體HP-β-CD能使GLD在水中的飽和溶解度顯著提高至109.36 mg/mL。SEM結果顯示GLD/HP-β-CD固體包合物呈形狀不規則的片狀。DSC結果顯示GLD/HP-β-CD包合物中GLD以無定形非晶體結構存在；FTIR及DSC充分證明了HP-β-CD已將GLD包合在空腔內形成了包合物。分子對接顯示GLD與HP-β-CD之間的最佳結合能為-7.37 kcal/mol，GLD分子能夠完整地進入到HP-β-CD的空腔內，GLD與HP-β-CD分子間形成1 個氫鍵，GLD與HP-β-CD分子間的相互作用主要靠范德華力維持。GLD/HP-β-CD顯著改善了GLD在模擬胃、腸液的溶出速率和累積溶出率，顯著提高了在模擬胃、腸液中游離的GLD濃度，極大程度地提高了GLD透過腸上皮表面黏液層的能力，并顯著提高小腸上皮細胞對GLD的攝取量。以上研究結果表明：GLD/HP-β-CD具有提高GLD吸收、改善GLD生物利用度的潛力。