負載鳙魚肽的殼聚糖/三聚磷酸鈉和殼聚糖/亞麻籽膠復合納米顆粒的穩定性和生物相容性評價

鄭昌亮，陳夢婷，汪 蘭，曲映紅，施文正，石 柳，陳 勝，喬 宇，李 新，郭曉嘉，吳文錦,，楊玉平

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.武漢藥品醫療器械檢驗所，湖北 武漢 430075）

近年來，多肽類藥物因其靶向性和治療效果優于化學藥物且副作用少而備受關注[1]。多肽類藥物常以口服的形式進入體內。然而，多肽的滲透效率有限，口服后生物利用度低，嚴重阻礙了多肽的利用[2]。為解決這些問題，人們開發了各種納米和微米尺度的多肽遞送體系。近年來用于多肽遞送的主要有聚合物型[3-4]、脂質體型[5-6]、乳液型[7-8]、無機顆粒型[9-10]、蛋白納米顆粒型[11]等。殼聚糖是一種陽離子天然多糖，由于殼聚糖（chitosan，CS）存在帶正電荷的氨基，其酸溶性溶液富含陽離子電荷，因此可以與帶負電的交聯劑、多糖、蛋白質等物質發生分子間靜電吸引，用以包埋遞送一些生物活性成分[12]。

封裝生物活性的納米顆粒在食品加工中不可避免地暴露在不同的環境條件下，除了一些本征參數外，離子強度、pH值、貯藏時間對納米顆粒也有一定的影響[13]。一般認為納米顆粒的Zeta電位絕對值大于30 mV便可認為具有優異的穩定性[14]，在長時間儲藏中不會發生解聚等現象；pH值會影響CS的質子化程度，進而對納米顆粒的穩定性有一定的影響，為了確保溶液中聚陰離子與聚陽離子足夠多，pH值應控制在兩種聚合物的pKa之間[15]；鹽的存在會減弱靜電作用的強度。Costalat等[16]提出了一種通過調節體系中鹽濃度制備CS聚合物的新型可控組裝工藝，高濃度NaCl用于溶解聚電解質溶液，當混合兩種聚電解質溶液時，由于電解質的靜電吸引力作用而沒有發生絡合。隨后利用透析緩慢消除NaCl后，兩個對應物之間的靜電相互作用逐漸恢復，并形成絡合物。

制備負載多肽的CS納米顆粒必須通過胃腸道進行轉運吸收，因此納米顆粒必須進行細胞毒性實驗以評估納米顆粒的安全性；其次，腸道的轉運、滲透、內化量也是評估納米顆粒性能的重要指標。納米顆粒的Zeta電位和粒徑與滲透吸收密切相關，納米顆粒粒徑越小越容易通過腸細胞黏液層；其次，Zeta電位值越大更易與帶負電荷的黏蛋白糖基發生靜電相互作用而黏附在上皮細胞上，延長它們在吸收位點的停留時間以增加其生物利用度[17]。Caco-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞，具有與分化小腸上皮細胞類似的結構和功能，包括微絨毛以及小腸刷狀緣上皮相關的酶系，因此在進行體外細胞實驗時可以用來模擬體內腸轉運現象。除此之外，HT-29細胞也常作為研究納米顆粒體內滲透的模型。Kim等[18]采用Caco-2和HT-29共同評價CS納米顆粒的跨細胞轉運能力，發現采用高分子質量的交聯劑所制得的納米顆粒具有較高的黏附性和跨細胞滲透性。

本研究主要探究離子強度、pH值、模擬消化和貯藏時間對制備的負載鳙魚肽（bighead peptides，BCP）殼聚糖/三聚磷酸鈉（chitosan/sodium tripolyphosphate-bighead peptides，CS/TPP-BCP）和殼聚糖/亞麻籽膠（chitosan/flaxseed gum-bighead peptides，CS/FG-BCP）納米顆粒的影響，并以Caco-2細胞為模型，評估CS納米顆粒處理的胞外乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）的含量、體內抗氧化能力和細胞攝取度，以期為多肽類食品藥物的工業化應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Caco-2細胞 尚恩生物技術有限公司；血清 德國Pan Biotech公司；DMEM培養基 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CS（脫乙酰度≥85%）上海麥克林生化科技有限公司；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）（分析純）南京化學試劑有限公司；BCP（分子質量＜5 kDa）、亞麻籽膠（flaxseed gum，FG）為實驗室自制；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、LDH細胞毒性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）北京博奧森生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）莫納生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Mastersizer 2000激光粒度儀 英國Malvern公司；IX81熒光顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；FORMA 371二氧化碳培養箱 美國Thermo Fisher公司；LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 CS納米顆粒的制備

1.3.1.1 CS/TPP納米顆粒的制備

根據實驗室前期優化的結果制備[19]，將CS溶于質量分數為1%的冰醋酸中，攪拌過夜得到CS溶液。用濃度為1 mol/L的NaOH溶液將CS溶液的pH值調整為4，并勻速滴加質量濃度為2 mg/mL的BCP，使CS與BCP質量比為1∶1。然后在磁力攪拌下以CS與TPP質量比為6∶1勻速滴加質量濃度為0.8 mg/mL的TPP溶液，并調整前后pH值使其保持一致，室溫下繼續磁力攪拌30 min，獲得BCP的CS納米顆粒懸浮液。

1.3.1.2 CS/FG納米顆粒的制備

參考Rajabi等[20]制備CS/阿拉伯膠納米顆粒的方法簡要修改，將20 mL 0.5 mg/mL CS溶液置于燒杯中，在磁力攪拌下將BCP以1∶1（m/m）的比例加入CS溶液中攪拌，然后加入40 mL 0.5 mg/mL FG溶液，攪拌15 min，以制備負載BCP的CS/FG納米顆粒。

1.3.2 物理穩定性分析

1.3.2.1 pH值穩定性

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液將制備的兩種CS納米顆粒懸浮液的pH值分別調整到1.5、2、3、3.5、4、5、6、7，室溫放置過夜后測量納米顆粒的Zeta電位值、粒徑和濁度并觀察外觀形貌。

1.3.2.2 離子強度穩定性

將制備好的兩種CS納米顆粒的懸浮液和BCP溶液與等體積不同濃度的NaCl溶液混合，最終使得NaCl溶液的濃度分別為0、50、100、150 mmol/L和200 mmol/L，過夜后測量納米顆粒的Zeta電位和粒徑值。

1.3.2.3 模擬消化穩定性

參考欒曉旭等[21]制備模擬消化工作液的方法并簡要修改。取稀鹽酸16.4 mL，加去離子水800 mL，加入胃蛋白酶10 g，搖勻后加水稀釋成1 000 mL即得模擬胃液。取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值至6.8。另取胰蛋白酶10 g，加水溶解后將兩液混合，然后稀釋至1 000 mL即為模擬腸液。將模擬胃液和腸液與納米顆粒和多肽等體積混合后分別置于37 ℃水浴振蕩，固定時間取樣1 mL測Zeta電位值和粒徑值。

1.3.2.4 貯藏穩定性

將制備好的兩種CS納米顆粒懸浮液和多肽溶液置于室溫放置，分別在第0、7、14、21、28天測量Zeta電位值和粒徑值。

1.3.3 細胞實驗

1.3.3.1 LDH活力檢測

將Caco-2細胞培養于96 孔板（5×104個/孔）中，在37 ℃下孵育4 h，取每孔0.5 mL，1×105個/mL的細胞懸液接種于12 孔板中，在5% CO2、37 ℃和95%相對濕度的培養箱中培養24 h后，根據實驗分組的情況進行處理和培養。培養結束后收集細胞培養的上清液，根據試劑盒的操作步驟進行LDH活力的檢測[22]。

1.3.3.2 細胞內ROS含量檢測

調整細胞懸液濃度至1×105個/mL，每孔1 mL接種于12 孔板中，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，根據實驗分組情況（空白對照、H2O2處理、CS/TPP-BCP＋H2O2處理、CS/FG-BCP＋H2O2處理、CS/TPP-BCP處理、CS/FG-BCP處理）進行處理和培養。培養完成后，棄上清液，用PBS洗2 遍，每孔加入100 μL胰酶于培養箱中消化2 min，加入1mL培養基吹打收集細胞，2 000 r/min離心3 min，去上清液，再用PBS洗2 遍，加入200 μL 10 μmol/L 2,7-二氯熒光素二乙酸酯溶液37 ℃避光反應30 min，2 000 r/min離心5 min后棄上清液，PBS洗2 遍，用500 μL PBS重懸細胞，最后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞中的熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.3.3.3 細胞內化能力檢測

使用與1.3.1.1和1.3.1.2節中相同的方法制備FITC標記的CS納米顆粒，不同的是采用FITC標記肽，參考ZhaoYuanhui等[23]的方法進行標記。

以5×105個/孔的密度培養Caco-2細胞，將納米顆粒孵育2 h。取出樣品，然后用預熱的PBS洗滌細胞。將洗滌后的細胞固定在4%多聚甲醛溶液中，并用碘化丙啶（propidium iodide，PI）復染后使用LSM700激光掃描共聚焦顯微鏡檢查細胞。其中，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

1.3.4 粒徑、電位的測定

參考Butstraen等[24]的方法并簡要修改。通過基于動態光散射方法對BCP的CS納米顆粒進行表征。測量前將BCP的CS納米顆粒懸浮液用去離子水稀釋10 倍，取0.8 mL樣品于25 ℃下使用粒徑電位儀測量電位。取未稀釋的懸浮液1 mL測量粒徑和多分散性指數（polydispersity index，PDI），平衡時間為60 s。

1.3.5 濁度的測定

取1.3.2.1節中不同pH值的納米顆粒懸浮液2 mL，使用紫外-可見分光光度計在500 nm波長處測量溶液的濁度，評價樣品溶液的分散穩定性。

1.4 數據處理

所有處理均重復3 次，使用SPSS程序進行方差分析確定各組之間的差異顯著性，并使用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 pH值穩定性分析

如圖1a所示，隨著pH值的升高，納米顆粒的濁度呈現增長的趨勢，這一變化也體現在外觀圖1b中。當pH值升高到6時出現絮凝現象，pH值為7時絮凝現象更嚴重，同時由圖1c可知，在pH值為6和7時粒徑增大至1 774.3 nm和2 145.7 nm。出現這種現象的原因與CS的質子化有關。當pH值在6～7時，接近CS的等電點（≈6.5），其質子化程度低，粒子間聚集作用增強導致粒子析出[25]。Zeta電位值反映了納米顆粒的穩定性，從圖1d可以發現，在較低pH值下納米顆粒的Zeta電位絕對值均在30 mV以上，說明納米顆粒穩定，不會出現聚集絮凝等現象。隨著pH值的逐漸升高，Zeta電位逐漸變小，當pH值為7時出現負值。從Zeta電位值的變化趨勢也可以看出在接近中性環境下納米顆粒穩定性較差。

圖1 pH值對CS/TPP納米顆粒濁度（a）、外觀（b）、粒徑（c）和Zeta電位（d）的影響Fig.1 Effect of pH on turbidity (a),appearance (b),particle size (c) and zeta potential (d) of chitosan/sodium tripolyphosphate nanoparticles

由圖2a可知，與CS/TPP-BCP納米顆粒相同的是隨著pH值的升高濁度也呈現上升趨勢。但是在pH值為3時CS/FG-BCP納米顆粒就出現輕微的混濁（圖2b），可能原因是FG的等電點比CS低。在較低pH值下，羧基會首先質子化，從而降低了FG的溶解度，導致納米顆粒析出[13]。圖2c表明粒徑也隨著pH值的升高而增大。從圖2d發現，pH值小于3時的Zeta電位值均比pH值大于3時高，說明CS/FG-BCP納米顆粒在極酸性條件下比在中性條件下更穩定。

圖2 pH值對CS/FG納米顆粒濁度（a）、外觀（b）、粒徑（c）和Zeta電位（d）的影響Fig.2 Effect of pH on turbidity (a),appearance (b),particle size (c) and zeta potential (d) of chitosan/flaxseed gum nanoparticles

2.2 離子強度穩定性分析

離子強度對納米顆粒的影響如圖3所示，BCP、CS/TPP-BCP和CS/FG-BCP納米顆粒的初始粒徑值分別為510.2、152.1 nm和136 nm，且粒徑值均隨著NaCl濃度的增加而升高，當NaCl濃度增加至200 mmol/L時，粒徑分別增加至1 013.5、239.5 nm和440.7 nm。溶液中存在的反離子（Na＋和Cl-）會中和納米顆粒上的電荷，削弱液滴之間的靜電排斥，引發粒子間聚集[26]。與CS/FG-BCP納米顆粒相比，CS與TPP之間的交聯較強，受離子強度的影響較小，在NaCl濃度從50 mmol/L增加到200 mmol/L過程中粒徑沒有顯著變化。BCP Zeta電位值對NaCl濃度變化不敏感。兩種CS納米顆粒的Zeta電位絕對值均隨著濃度的增加而降低，Zhu Yiqing等[27]研究NaCl濃度對負載含硒肽黃原膠/溶菌酶納米顆粒穩定性的影響時得出與此相同的結論。Zeta電位絕對值的降低也證實了液滴間靜電排斥減弱，隨著NaCl濃度增加，CS/TPP-BCP納米顆粒的電位絕對值始終高于CS/FG-BCP納米顆粒，這也印證了CS與TPP之間的靜電作用強于FG。

圖3 NaCl濃度對CS納米顆粒Zeta電位（a）和粒徑（b）的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on zeta potential (a) and particle size (b) of chitosan nanoparticles

2.3 模擬消化穩定性分析

利用體外模擬消化體系對BCP和兩種CS納米顆粒的穩定性進行了評估。如圖4所示，CS/TPP-BCP和CS/FGBCP納米顆粒的Zeta電位值在模擬消化過程中均顯著下降（P＜0.05），證明模擬消化對納米顆粒的穩定性具有一定的影響。在模擬消化過程中CS/TPP-BCP納米顆粒的Zeta電位值始終高于CS/FG-BCP納米顆粒，且在模擬消化過程中CS/TPP-BCP納米顆粒的粒徑沒有顯著變化，這再次證實了CS/TPP-BCP納米顆粒的穩定性優于CS/FG-BCP納米顆粒，與pH值和離子強度對納米顆粒穩定性影響的結果一致。由于CS/FG-BCP納米顆粒的不穩定性，在胃腸的模擬消化過程中粒徑呈現先增加后減小的趨勢。粒徑在模擬胃階段顯著增加，這與胃蛋白酶介導的水解從而降低了納米顆粒表面的靜電排斥有關[28]。進入模擬腸液后粒徑顯著性降低，且在4 h內沒有顯著性變化，這與模擬腸液中胰蛋白酶的存在促進了膠體間結構的形成有關[29]。Liu Qianyuan等[26]探究模擬消化對玉米醇溶蛋白/褐藻糖膠基納米顆粒的影響時得出與此相同的結論。與BCP相比，納米顆粒在模擬消化過程中具有更高的穩定性，也說明納米顆粒在一定程度上對BCP具有保護作用。

圖4 模擬消化對不同樣品Zeta電位（a）和粒徑（b）的影響Fig.4 Effect of simulated digestion on zeta potential (a) and particle size (b) of different samples

2.4 貯藏穩定性分析

如圖5所示，BCP在貯藏過程中粒徑顯著增加，Zhu Yiqing等[27]研究貯藏時間對含Se肽粒徑的影響時得出與此相同的結論。與BCP相比，兩種納米顆粒在貯藏過程中Zeta電位值均保持在較高水平，粒徑也沒有顯著變化，說明經兩種具有相反電荷的聚合物包封后能夠提高BCP的穩定性。

圖5 貯藏時間對不同樣品顆粒Zeta電位（a）和粒徑（b）的影響Fig.5 Effect of storage time on zeta potential (a) and particle size (b) of different samples

2.5 LDH釋放量分析

細胞培養液中LDH含量可以反映細胞膜的破損程度，當細胞膜破損時，存在于細胞質基質中的LDH就會釋放到細胞培養液中，所以培養液中LDH含量越高表明細胞膜的破損程度越高。由圖6可知，在較低質量濃度下，BCP和兩種CS納米顆粒處理后的上清液中LDH含量與對照組沒有顯著差異（P＜0.05），說明在較低質量濃度下BCP和兩種CS納米顆粒不會對細胞的生長造成影響，具有較高的生物相容性。

圖6 Caco-2細胞上清液中LDH活力Fig.6 LDH activity of Caco-2 cell supernatant

2.6 細胞內ROS含量檢測

細胞內的ROS是代謝活動的產物，當體內積累過量的ROS時會對機體造成氧化損傷。圖7中綠色熒光的強度反映了細胞內ROS含量多少，由圖7可知，經H2O2誘導后的細胞內產生了較強的熒光，表明細胞內存在大量的ROS。當用BCP和兩種CS納米顆粒處理后細胞內ROS的含量明顯降低，表明BCP和兩種CS納米顆粒均具有抗氧化能力。與BCP相比，兩種CS納米顆粒處理的細胞內ROS含量較低，說明兩種納米顆粒的抗氧化穩定性優于BCP，這與體外抗氧化實驗的數據一致。劉錢媛[30]研究負載紫檀芪的玉米醇溶蛋白-褐藻糖膠納米顆粒時發現，經過負載后納米顆粒的抗氧化能力優于未負載的紫檀芪，與本實驗的結果類似。

圖7 BCP和CS納米顆粒對細胞中ROS含量的影響Fig.7 Effects of BCP and chitosan nanoparticles on intracellular ROS content

2.7 細胞內化能力分析

游離肽和兩種CS納米顆粒的細胞熒光圖如圖8所示。與游離肽相比，經過CS納米顆粒負載后多肽的熒光強度增加，這表明CS納米顆粒比游離肽更容易被細胞攝取。CS/TPP-BCP納米顆粒熒光強度強于CS/FG-BCP納米顆粒，說明細胞對CS/TPP-BCP納米顆粒的攝取度高于CS/FG-BCP納米顆粒，這可能與CS/TPP-BCP的電位較高有關（37.3 mV＞20.1 mV）。

圖8 游離肽和CS納米顆粒的細胞熒光圖Fig.8 Fluorescence images of free peptides and chitosan nanoparticles

3 結論

本研究分析了負載BCP的CS/TPP-BCP和CS/FG-BCP納米顆粒在不同pH值、離子強度、模擬消化和貯藏過程中的穩定性。并以Caco-2細胞為模型，探究了兩種CS納米顆粒和BCP對細胞外LDH釋放量和細胞內ROS含量的影響，并測定了細胞對兩種納米顆粒的攝取度。具體結論如下：酸性條件下兩種納米顆粒具有較高的穩定性，Na＋和Cl-會削弱液滴之間的靜電排斥，引發粒子間聚集，經CS納米顆粒包封后提高了BCP的穩定性；細胞實驗證實了兩種納米顆粒具有較高的生物相容性和體內抗氧化能力，增強了BCP在小腸上皮細胞的滲透性。