花色苷-硫酸軟骨素共色物復合普魯蘭多糖穩態體系構建與評價

鮑義文，任廣宇，李佳欣，田金龍，楊曙方，楊一鋆，司 旭,，李 斌,

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.浙江藍美技術股份有限公司，浙江 諸暨 311800）

花色苷是一種廣泛分布于植物中的水溶性天然功能色素，屬黃酮多酚類化合物，是漿果中重要的活性成分，具有抗氧化、緩解視力疲勞、延緩衰老、調節糖脂代謝、防御神經退行性疾病等多種生理功能，廣泛應用于飲料、藥品、化妝品和營養藥品的制造中[1-2]。隨著藍莓等漿果產業的迅速發展，特色漿果制品市場迎來熱潮，藍莓花色苷（blueberry anthocyanins，BA）作為重要功能色素，在加工中可以賦予制品色澤、提供營養價值。然而，由于花色苷穩定性差，易受環境脅迫（pH值、光、熱等）發生降解，導致其在加工過程中損失嚴重，體內吸收利用率低，限制了藍莓深加工制品的產業化應用[3-4]。因此，尋求提高藍莓制品中花色苷穩定性技術，構建花色苷穩態體系研究尤為重要。

共色技術和包封技術是提高花色苷穩定性的重要手段。共色是指花色苷與生物聚合物、酚酸類物質和金屬離子等共色物自締合或形成復合物的現象[5-6]。這一作用機制可以增強花色苷的色澤強度，保護有色的黃烊陽離子免受水分子的親核攻擊，穩定花色苷結構[7-9]。硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種獨特的帶負電荷的酸性黏多糖，廣泛分布在動物組織的細胞外基質中，其分子鏈由β-1,4連接的葡萄糖醛酸以及β-1,3-N-乙酰乙酰基-D-氨基葡萄糖交替單元組成[10-11]。與低分子質量酚酸輔色花色苷相比，CS分子質量較大、具有較高的電荷密度可以保持與花色苷的π-π堆積構型，起到更加穩定的作用[12]。包封技術可以穩定共色物結構，最大限度地保留花色苷含量，以阻止其受環境脅迫帶來的負面效應。普魯蘭多糖（pullulan，PU）是一種天然的水溶性微生物細胞外多糖，由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接的麥芽三糖單元組成，具有良好的生物相容性、可食用性和優異的成膜性能，有利于形成穩定的凝膠體系，此外由于PU作為非離子多糖不會對BA-CS共色物之間的電荷相互作用產生干擾，因此其可作為天然生物大分子包埋活性成分的理想材料[13-15]。共色與包封技術的聯合使用可以最大限度增強花色苷色澤并提高其穩定性，在食品工業中具有廣闊應用前景。

本研究基于共色與包封結合技術，采用CS離子絡合BA形成共色復合物，利用PU包封共色物，構建負載BA的穩態體系（BA-CS-PU）。利用紫外-可見光譜和色度參數評價共色物增色效果，通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）及熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）等對穩態體系進行結構表征，解析其共色包埋機制，探究加工條件及體外模擬消化對穩態體系中BA的穩定性影響，從而評價BA-CS-PU體系在藍莓深加工制品中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍美I號BA（純度40%）浙江藍美技術股份有限公司；CS（純度90%）鑫瑞生物科技有限公司；PU（純度99%）北京索萊寶科技有限公司；胰酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶 上海瑞恩生物科技有限公司；膽汁提取物 北京奧博生物科技有限公司；VC、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Evolution 201紫外-可見分光光度計、FTIR光譜儀 賽默飛世爾科技公司；pH計、TGA儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NS 800分光測色儀 深圳市三恩時科技有限公司；DK-S26水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；磁力恒溫攪拌器 鄭州南北儀器設備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 BA-CS共色物的制備

取適量CS將其溶解于超純水中制備成質量濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/mL的CS溶液，用1 mol/L的鹽酸溶液將pH值調節至3.0。將一定量的BA溶于pH 3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，將BA溶液加入制備好的CS溶液中，使BA終質量濃度為0.2 mg/mL，磁力攪拌30 min，得到CS質量濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/mL的BA-CS共色物溶液。

1.3.2 色度測定

通過分光測色儀測定溶液的色澤參數（L、a、b），并根據式（1）計算ΔE值：

式中：L為色澤的明亮度；a為色澤的紅綠度；b為色澤的黃藍度。L0、a0、b0為對照樣品的色度值。

1.3.3 紫外-可見光譜測定

測量BA溶液、CS溶液及BA-CS共色物溶液在pH 3條件下的紫外-可見光譜，掃描波長為380～780 nm。同時，用相機記錄BA溶液和BA-CS共色物溶液的色澤變化。

1.3.4 BA-CS-PU穩態體系構建

將PU溶解于pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌制備得到質量濃度為2.0、3.0、4.0 mg/mL的PU溶液。將制備的BA-CS共色物溶液與PU溶液等體積混合，在磁力攪拌器的作用下室溫攪拌40 min得到BA-CSPU穩態體系，根據PU的添加質量濃度將其命名為BACS-PU2、BA-CS-PU3和BA-CS-PU4。以單獨BA溶液作為實驗的對照組。

1.3.5 FTIR

采用FTIR光譜儀測定BA、CS、PU、BA-CS、BA-PU和BA-CS-PU的吸收光譜，分析基質組分之間的相互作用。光譜的掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 TGA

將冷凍干燥的BA、CS、PU、BA-CS、BA-PU和BA-CS-PU粉碎，然后使用TGA儀進行檢測。分析范圍為25～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min，氮氣流速為100 mL/min。記錄TGA和微商熱重（derivative thermogravimetrc，DTG）曲線。

1.3.7 BA保留率測定

采用pH示差法測定BA的含量。將樣品用pH 1.0和pH 4.5檸檬酸緩沖溶液稀釋一定倍數，使用紫外-可見分光光度計測量BA的吸光度，使得BA吸光度在0.2～0.8之間。避光顯色1 h后，分別于520 nm和700 nm波長處測定BA溶液的吸光度，每個樣品做3 次平行實驗。樣品中BA質量濃度（C）及保留率分別按式（2）、（3）計算：

式中：A＝（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；DF為稀釋因子；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）的相對分子質量（449.2）；ε為C3G的摩爾消光系數（26 900 L/（mol·cm））；L為光程長（1 cm）。

式中：Ct為BA在t時刻的質量濃度/（mg/mL）；C0為BA的初始質量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 體外模擬消化

參考Guo Ruixue等[16]的體外模擬方法并稍作修改。用6 mol/L的HCl溶液和0.9 mol/L的NaHCO3溶液對消化過程pH值進行調節。消化過程使用恒溫水浴搖床于37 ℃、120 r/min振蕩進行。口腔消化：將樣品裝入錐形瓶并加入1 mL唾液模擬液（32.5 mgα-淀粉酶和2.775 mg CaCl2溶于25 mL超純水中）消化10 min，取樣。胃消化：唾液消化結束后，pH值調至3并加入1 mL胃液模擬液（1 g胃蛋白酶溶于25 mL超純水中）于樣品中，消化2 h，每隔1 h取樣1 次。小腸消化：胃消化結束后，pH值調至7.5，并加入10 mL腸液模擬液（0.5 g胰酶、3.125 g胰蛋白酶、3 g膽汁鹽、0.21 g NaHCO3溶于25 mL超純水中）消化2 h，每隔1 h取樣一次。以單獨BA樣品作為空白對照。樣品中BA質量濃度及保留率分別通過公式（2）和（3）計算得到。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 CS輔色BA效果評價

2.1.1 CS質量濃度對BA的色澤影響

CS與BA以不同比例復合的色澤參數、色差值及表觀色澤如表1所示。結果表明，隨著CS的加入溶液的L值和b值降低，說明其溶液亮度變暗，黃色色度降低。值得注意的是，CS的加入使得溶液的a值顯著增加（P＜0.05），說明溶液的紅色色度顯著增強，證明了CS與BA復合后共色物的形成增強了BA溶液原本的紅度。從表1可以清晰看到，色澤增強現象，由鮮紅轉變為深紅色，表明CS已與BA復合形成共色物。其中，CS質量濃度為2 mg/mL時，復合溶液的a值（5.77±0.04）最大，此時與單獨BA溶液相比ΔE值（3.97±0.80）顯著增加。因此，CS質量濃度為2 mg/mL時與BA復合表現出了最佳共色效果，后續選定此質量濃度進行共色物評價及穩態體系構建。

表1 BA及不同質量濃度CS輔色BA的色度參數及色澤變化Table 1 Color parameters and color changes of BA and BA complexes with different concentrations of CS

2.1.2 BA-CS共色溶液的色澤及紫外-可見光譜分析

BA及BA-CS共色物溶液在pH 3的條件下色澤變化及紫外-可見光譜如圖1所示，對比單獨的BA溶液，BA-CS共色物溶液產生的離子絡合現象使色澤強度顯著增加。單獨BA溶液的最大吸收波長在520 nm左右，加入CS之后形成的共色復合物最大吸收峰移動到540 nm附近，與單獨BA溶液相比，波長向長波長方向發生移動，產生紅移現象。然而單獨的CS溶液在此波長范圍內沒有吸收峰的產生，說明是二者共色物的產生使波長發生移動。此外BA-CS共色物在最大吸收峰位置的吸光度顯著增加（0.99→1.67），進一步證明了共色現象的發生，這與Xie Chenjing等[17]的研究結果一致，表明CS的加入與BA產生離子絡合物發生共色作用從而增強了BA溶液的色澤，使得最大吸收峰發生紅移[17-18]。

圖1 BA、CS及BA-CS共色物紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-vis spectra of BA,CS and BA-CS co-pigmentation complex

2.1.3 BA-CS共色物色度及色澤穩定性評價

BA溶液及BA-CS共色物溶液在pH 2～8條件下的色澤變化參數及圖像對比如表2所示，隨著pH值增加，BA溶液色澤發生變化，是由于花色苷的結構變化導致的（黃烊陽離子→查耳酮、甲醇甲堿→醌式堿）[19-20]。隨著CS的加入，在pH 2～3時，L、a值無顯著差異，b值降低。從結果看出，BA溶液在較穩定的pH值范圍內（pH 2～3），CS的加入對BA的紅值無顯著影響，但從圖像色澤可以看出CS與BA發生絡合使共色物色度增強。然而，在pH 4～6的條件下，CS的加入使溶液的L、a、b值均發生顯著變化。值得注意的是，相同pH值條件BA-CS復合溶液的a值顯著高于BA溶液，結果表明CS對花色苷的紅色起到顯著保護作用，并增強了溶液的色澤。當pH值在中性及堿性條件下時，BA溶液的L值較酸性條件有所降低，表明溶液色澤整體偏暗。同時a值及b值呈現小于0的趨勢，表明溶液紅色、黃色逐漸消失并分別向綠色及藍色域轉移。綜上，CS的加入與BA產生共色作用，使得BA在較不穩定的酸性條件下（pH 4～6）紅值顯著增強，同時在廣泛pH值范圍內（pH 2～8）均顯著增強了溶液色澤，證明了共色物的形成。

表2 BA及BA-CS在pH 2.0～8.0下的色澤參數及圖像Table 2 Color parameters and visual color of BA and BA-CS at pH 2.0–8.0

將BA溶液（圖2A）及BA-CS共色物溶液（圖2B）在室溫下存放14 d評價天然色素及添加生物聚合物后的色澤穩定性。每2 d測定一次色澤參數（L、a、b）并以第1天色澤參數為對照計算?E。BA和BA-CS溶液在pH 2～3時顯色最穩定，在貯藏14 d內具有最低的色差值，且整體趨于穩定狀態，說明在此pH值范圍內花色苷的色澤最穩定。當溶液pH值在4～9時，隨著貯藏時間延長，色差值增加，色澤穩定性減弱，貯藏超過10 d后色差值趨于穩定。相比于單獨的BA溶液，CS的加入降低了溶液的色差值，提高了天然花色苷的色澤穩定性。

圖2 BA溶液（A）和BA-CS溶液（B）在pH 2～8條件下的?E變化Fig.2 ?E values of BA solution (A) and BA-CS solution (B) at pH 2–8

2.2 BA-CS-PU穩態體系結構表征

2.2.1 FTIR分析

為確認復合體系的形成，分析BA、CS和PU三者之間存在的相互作用，通過FTIR對各組分進行表征，結果如圖3A所示。FTIR光譜在3 431（BA）、3 445（CS）、3 411（PU）、3 434（BA-CS）、3 422 cm-1（BA-PU）及3 423 cm-1（BA-CS-PU）處的譜帶是由于—OH的存在。在BA的光譜中，1 638 cm-1和1 413 cm-1處的特征峰歸因于苯并吡喃芳香環的振動（C—C環伸展），是黃酮衍生物的象征[21]。CS光譜的特征峰出現在1 632、1 341 cm-1和1 226 cm-1處，分別為酰胺I帶、O—H變角度振動和S＝O伸展[22]。PU光譜在1 153、1 021 cm-1處的特征峰分別歸因于PU的α-1,4糖苷鍵和C—O的拉伸振動，在851 cm-1處觀察到的峰值是PU的α-吡喃葡萄糖單元[23-24]。

圖3 BA-CS-PU穩態體系的表征Fig.3 Characterization of BA-CS-PU

在BA-CS共色物光譜中，CS在S＝O處的1 226 cm-1特征峰移動到1 235 cm-1處，BA的特征峰被掩蔽。因此，結合Xie Chenjing等[17]的結果，合理推測CS和BA的結合方式為BA的活性酚羥基和CS的自由羧基之間發生氫鍵結合，共色作用是由CS和BA之間通過硫酸基團和BA黃烊陽離子形成離子絡合產生[17,25]。在BA-CS-PU復合物體系中，—OH位置特征峰與單獨物質相比均發生偏移，推測各組分之間存在氫鍵相互作用。此外各組分的特征峰出現移動，峰強發生變化，說明各物質之間發生結合，BA被嵌入到復合物中，成功構建負載BA的穩態體系。

2.2.2 TGA結果

通過TGA方法評價BA-CS-PU體系的熱穩定性，TGA（圖3B）和DTG（圖3C）曲線反映出BA-CS-PU的熱降解過程主要有3 個階段。第1階段發生在25～100 ℃范圍內，質量損失約10%，質量變化為每分鐘下降1.0 mg，這可能是由于復合體系中表面附著的BA降解造成。第2階段發生在160～220 ℃，熱質量損失約9%，質量變化為每分鐘下降2.0 mg，這可能是由于BA-CS-PU體系中自由水的蒸發和解吸作用，與包封材料固有的親水性有關[17,26]。第3階段發生在220～265 ℃，由于多糖結構的分解，質量損失率約為17%，質量變化為每分鐘下降1.6 mg，此時體系中BA大部分被降解和釋放[27]。此外，從DTG圖可以看出，BA、BA-CS、BA-PU及BA-CS-PU的吸熱峰溫度分別為218.4、194.2、297.5 ℃及262.5 ℃。因此，從熱質量損失率及吸熱峰溫度變化綜合考慮，BACS-PU體系具有更好的耐熱性。由于CS中的硫酸鹽基團與BA黃烊陽離子相互作用（圖3A），增強了膠體的表面穩定性，從而在BA-CS共色物上產生了大量的親水表面[12]。為了增強穩態體系對BA的保護作用，使用PU包裹BA-CS共色物，形成類似凝膠網絡結構，將共色物嵌入其中，通過共色與包封技術的結合更大程度保護BA的穩定性，結合FTIR分析其作用機理示意圖如圖3D所示。

2.3 BA-CS-PU穩態體系的加工穩定性評價

2.3.1 熱加工

BA很容易受到溫度的影響，導致其降解。因此研究大分子穩態體系對BA的保護作用具有重要意義。BA溶液和BA-CS-PU體系在不同溫度處理條件下的保留率及a值分析如圖4所示。在食品常用加工溫度范圍內，隨著熱處理溫度的升高，BA保留率降低，90 ℃處理后BA保留率最低（66.24%）。這可能是因為在熱加工過程中BA受熱發生水解反應，糖苷鍵斷裂，破壞了BA的結構。值得注意的是，在各個溫度處理條件下，BA-CS-PU復合體系中的BA保留率均顯著高于游離BA組。其中，在70、80 ℃和90 ℃處理組中，3 mg/mL的PU形成的BA-CS-PU3組對BA的保護作用最明顯，保留率比對照組分別提高了7.68%、4.97%和7.17%（圖4A）。穩態體系中BA熱穩定性提高可能與BA與壁材之間的非共價鍵相互作用有關，除吸收較高能量外，BA均不容易被破壞[28]。

圖4 不同溫度處理時BA-CS-PU體系對BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.4 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B) at different temperatures

BA溶液的紅色域強度是評價其感官色澤的重要指標。由于花色苷自然狀態下色澤為紅色域，因此通過a值的大小可以評價BA溶液紅色的強弱，以證明復合體系對BA色澤的保護作用。從a值結果看出，不同溫度處理組單獨的BA溶液具有最低的a值，而BA-CS-PU復合體系的a值顯著高于對照組，其中以3 mg/mL的PU形成的BA-CS-PU3組對BA的色澤保護作用最明顯（圖4B）。綜上分析，PU質量濃度在3 mg/mL時，形成的復合體系可能最佳。

2.3.2 酸堿強度

食品加工過程不同體系中往往伴隨著pH值的變化，然而BA受pH值影響顯著，因此模擬加工的廣泛pH值范圍內BA的保留率情況具有重要意義。熱處理30 min后，避光貯藏24 h，BA保留率如圖5A所示。在pH 2～4范圍內BA的保留效果較佳，在此pH值范圍內，BA以黃烊陽離子形式存在，具有穩定的母核結構，此范圍內不易受外界環境脅迫導致失穩。其中pH 3時BA的保留率最高。在pH 5～6時，BA保留率顯著降低，此范圍內BA由黃烊陽離子結構逐漸轉化為甲醇甲堿或查耳酮形式，導致其母核結構不穩定，易受親水核攻擊，BA保留率降低。值得注意的是，在廣泛pH值條件下BA-CS-PU體系的處理后BA的保留率均比對照組顯著提高（P＜0.05）。因此，加工過程為最大限度保留BA含量，在加工體系中盡量選擇pH 3體系。值得注意的是，在弱酸環境下BA-CS-PU體系可以顯著提高BA的保留率，以3 mg/mL PU形成的BA-CS-PU3體系對BA的保留率最為顯著。

圖5 不同pH值處理時BA-CS-PU體系對BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.5 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B) at different pH levels

BA的pH值變化與其形成的色澤顯著相關，BA溶液在pH 2～4時呈現紅色，此時BA主要以黃烊陽離子形式存在；pH 5～6時，BA逐漸轉化為接近無色的甲醇甲堿或查耳酮形式；pH 7～10時，BA轉化為藍色的醌式堿形式；在pH 11～12時，BA降解產生酚酸類物質使溶液呈現出黃褐色[19]。如圖5B所示，BA在pH 3時a值最大，隨著pH值升高a值降低，說明BA的紅色度逐漸下降。然而，與對照組相比BA-CS-PU體系顯著提高了BA的a值，保護了其有色結構的穩定性。因此BA-CS-PU所形成的穩態體系在保護BA的色澤，提升相關加工食品的色澤穩定性中具有重要價值。

2.3.3 VC共存

然而，因其本身表現的強還原性，對BA的穩定性具有破壞作用。Chung等[29]發現VC會加速BA的降解。在不同質量分數VC處理條件下游離BA及BA-CS-PU體系中BA的保留率如圖6A所示。隨著VC質量分數增加，BA保留率呈下降趨勢，這可能是由于VC在有氧條件下氧化生成了H2O2或BA與VC之間發生了縮合反應，從而降低BA的穩定性[30]。值得注意的是，與對照組相比，任意VC含量下BA-CS-PU體系中BA的保留率顯著增加（P＜0.05）。其中，以3 mg/mL PU形成的BA-CS-PU3體系對BA的保留率最為顯著。結果表明，VC共存條件下，BA-CS-PU體系可以有效保護BA的穩定性。

圖6 不同質量分數VC處理時BA-CS-PU體系對BA保留率（A）和a值（B）的影響Fig.6 Effect of BA-CS-PU system on BA retention rate (A) and a value (B)in the presence of different concentrations of VC

如圖6B所示，在VC共存條件下，隨著其含量增加，BA的a值逐漸減小，說明其溶液紅色逐漸淡化。與單獨BA相比，BA-CS-PU體系在0.05%～0.5% VC條件下，a值均顯著增加（P＜0.05），說明體系中共色物的存在結合PU的包封效果可以顯著提高BA溶液色澤穩定性，在富含VC與BA的液態飲品中，BA-CS-PU體系可以最大程度保護BA的色澤，提升食品的感官品質。

2.4 BA-CS-PU穩態體系的消化穩定性評價

在模擬加工穩定性實驗中，綜合比較發現BA-CSPU3體系對BA具有最優的保護效果。因此進一步利用體外模擬消化實驗，探究BA-CS-PU3穩態體系對BA的保護作用效果。樣品在模擬口腔、胃1 h、胃2 h、腸1 h和腸2 h條件下BA的殘留率情況如圖7所示，BA對照組經過唾液、胃、小腸后保留率逐漸降低，唾液、胃1 h、胃2 h、腸1 h及腸2 h消化后的保留率分別為96.47%、92.71%、91.87%、22.41%和15.12%，而對應的實驗組BA-CS-PU3體系，在消化過程中的保留率分別為98.81%、96.78%、95.94%、31.02%和23.75%。可以看出BA在唾液中降解不明顯，這是由于在唾液階段停留的時間較短。BA經過胃消化后降解仍不明顯，這是由于胃環境pH值較低，此時BA以其穩定的黃烊陽離子結構存在。然而消化至小腸時，BA的損失嚴重，這是由于BA在小腸時處于極不穩定的堿性條件，其結構由有色的黃烊陽離子轉化為無色的查耳酮或甲醇甲堿形式，破壞了BA的穩定性[31]。值得注意的是，在小腸消化1 h和2 h后，實驗組BA-CS-PU3體系中BA的保留率較對照分別提高了8.61%和8.63%，進一步證明BA-CS-PU穩態體系對BA的正向保護作用。

圖7 BA和BA-CS-PU復合物體外模擬消化后的殘留率變化Fig.7 Changes in retention rates of BA and BA-CS-PU complex during simulated digestion in vitro

3 結論

BA易受環境脅迫影響色澤穩定性，限制其在食品加工中的應用。本研究通過共色技術與物理包埋相結合，以CS與BA離子絡合形成共色物再與PU復合制備了負載BA的BA-CS-PU穩態體系。紫外-可見光譜及色度結果表明了BA-CS共色物的形成。FTIR和TGA結果表明各組分之間存在氫鍵相互作用，共色作用發生在CS的硫酸基團和BA黃烊陽離子之間的離子絡合。BA-CS-PU顯著提高了BA的熱加工、酸堿強度、VC共存條件下的保留率和色澤穩定性，同時提高了胃腸消化穩定性。綜上，基于共色與物理包埋技術結合所制備的BA-CS-PU穩態體系在富含花色苷的食品中具有廣闊應用前景。