溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對豬肝蛋白結構和功能特性的影響

唐永欣，彭松林，郭晨晨，徐 毅，尚永彪

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

肉類行業每年生產大量副產品，如內臟、骨頭、血、皮、角和蹄，其中很多副產物沒有被有效利用，大量廢棄物已成為影響資源充分利用的嚴重問題，更好地利用這些肉類副產品是全世界屠宰加工行業的共同目標[1]。在動物副產品中，動物內臟蛋白質含量豐富，可以作為生產高價值產品的潛在原料。豬肝是生豬屠宰的副產品，約占豬體質量的1.4%～2.5%，其蛋白質、鐵、多種維生素（VA、VE、VB1、VB2、葉酸）等營養成分的含量遠高于其他肉類產品[2]。

豬肝是價格低廉的高蛋白資源，豬肝蛋白（porcine liver protein，PLP）包括水溶性和水不溶性兩類蛋白質，PLP以水溶性蛋白為主，占比高達78.6%，但PLP的分子質量較大、結構緊密、溶解性較差、乳化性和起泡性等功能特性欠佳[3]，因此，PLP的加工利用受到很大局限。利用科學的方法對天然蛋白質進行人工修飾能夠改變蛋白質的結構，可改善其功能特性。熱處理是常用的蛋白改性方式，適當熱處理能加速蛋白分子運動，促進疏水性氨基酸暴露，使得蛋白質三級結構部分或完全展開，從而使蛋白質結構更加靈活。Zhang Yazhen等[4]分別用70、80 ℃或90 ℃處理花生分離蛋白（peannut protein isolate，PPI）30 min，發現加熱后的PPI具有更高的表面疏水性、膨脹模量和表面壓力，加熱也使其粒徑減小、乳化穩定性增加。然而動物源蛋白質對溫度較為敏感，熱穩定性較差[5]。pH值偏移處理主要是將中性的蛋白質溶液pH值調至遠離自身等電點的酸、堿性環境中，在酸、堿性環境處理一段時間后，再將蛋白溶液pH值調回中性。pH值偏移處理通過改變電荷的方式來調控蛋白分子間及分子內靜電排斥作用力，從而使蛋白結構發生改變。相比于直接熱處理，在酸、堿性條件下的熱處理更為溫和，既能改變蛋白質的三級結構，又對蛋白質分子二級結構的影響較小，避免蛋白質之間熱聚集[6]。Yu Yali等[6]采用溫和熱處理和pH值堿性偏移處理相結合，提高蛋清蛋白的乳化性能。Farhad等[7]利用堿熱處理蠶豆分離蛋白使溶解度分別在pH 3.0、6.0和7.0條件下從43%、14%和35%提高到90%以上，在pH 11.0條件下加熱，也能有效改善起泡性和泡沫穩定性。這些研究均表明適度的堿熱處理能有效促進動物蛋白分子在界面的吸附作用，從而對蛋白的乳化性起著正向積極作用。然而，目前關于pH值堿性偏移與溫和熱處理對PLP的相關研究鮮有報道。

本研究針對PLP功能特性差的問題，選擇pH 9、11作為pH值堿性偏移處理條件，同時在25～50 ℃溫度范圍內對PLP進行加熱改性，考察溫和熱處理與pH值堿性偏移處理相結合對PLP水合性質和表面功能特性的影響，分析探討PLP功能特性變化的內在原因，旨在為豬肝資源的高值開發和有效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肝（80～120 kg洋三元公豬屠宰后約3 h）重慶北碚區天生麗街永輝超市；一級玉米油 山東三星玉米科技有限公司；透析袋（分子截留量為8 000～14 000 Da）美國生物醫學公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍R-250 上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸 寧波大川精細化工有限公司；五水硫酸銅 廣東光華科技有限公司；酒石酸鉀鈉 寧波大川精細化工有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）成都市科隆化學品有限公司；甘氨酸（Gly）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、SDS 德國Biofroxx公司；以上試劑純度級別均為分析純及以上。

1.2 儀器與設備

TGL-16高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；UV-5100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；PowerPacTMBasic小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；XHF-D內切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-4C＋酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；ZEN3690馬爾文激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；Spectrum100紅外光譜儀 美國珀金埃爾默儀器有限公司；F-2500熒光分光光度計 日本日立公司；BX53熒光正置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 PLP提取

參考潘成磊等[8]的方法并稍加修改。將豬肝洗凈后剔除筋膜，切塊清洗2 次瀝干，再打成泥狀。以料液比1∶3的比例向豬肝泥中加入0.05 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液，采用內切式勻漿機高速勻漿3 次（10 000 r/min，每次30 s），隨后離心（4 ℃、9 000×g，20 min），再用紗布過濾除去脂肪，濾液收集于錐形瓶中，沉淀絞碎后按上述操作反復2 次，合并所有收集的濾液，透析48 h后冷凍干燥得到目標產物PLP粉。經測定，該PLP粉蛋白質量分數（以凱氏定氮法測定）為（87.67±0.8）%，水分質量分數為（4.79±0.21）%，脂肪質量分數為（1.34±0.16）%，灰分質量分數為（7.87±0.27）%，所提蛋白于-18 ℃冰箱密封保存。

1.3.2 PLP質量濃度測定

參考Cui Leqi等[9]的方法進行，牛血清蛋白作為標準蛋白，用雙縮脲法測定PLP濃度，以蛋白質量濃度、吸光度為橫、縱坐標，制得標準曲線為y＝0.048 4x＋0.000 8，R2＝0.999 8。

1.3.3 樣品處理

配制質量濃度為10 mg/mL的PLP溶液，冰水浴磁力攪拌30 min保證溶解充分。將溶液pH值調為7.0后冰水浴攪拌15 min，然后將溶液分為3 組，分別調整pH值至7、9、11，每組再以3 份試樣為一小組，分別在25、40、50 ℃水浴加熱30 min。以pH 7在25 ℃攪拌30 min為對照，各處理組分別命名為pH 7-40、pH 7-50、pH 9-25、pH 9-40、pH 9-50、pH 11-25、pH 11-40、pH 11-50。處理后的樣品冷卻后用2 mol/L的HCl溶液將pH值調至7.0攪拌15 min，樣品由初始pH 7調整到9或11后再調回到pH 7的過程即為pH值偏移處理。具體實驗分組見表1。

表1 實驗樣品分組Table 1 Experimental sample grouping

1.3.4 蛋白溶解度測定

參考計紅芳等[10]方法。將稀釋質量濃度為2.5 mg/mL的PLP溶液冷凍離心（4 ℃、5 500×g，15 min），用雙縮脲法分別測定上清液及離心前溶液的蛋白質量濃度。蛋白溶解度按式（1）計算：

式中：C1為離心后上清液蛋白質量濃度/（mg/mL）；C0為離心前溶液中蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 乳化活性測定

參考Pearce[11]和Kingsley[12]等的方法并稍作修改。將蛋白液（質量濃度2.5 mg/mL）和大豆油按3∶1的體積比加入50 mL塑料離心管中，高速勻漿后立即吸取50 μL底部乳化液至含有5 mL 0.1% SDS溶液的試管中，搖勻后立即用紫外分光光度計測定500 nm波長處的吸光度（A0），50 μL超純水進行相同處理作為空白對照。PLP乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）按式（2）計算：

式中：φ為油相體積分數（油的體積/乳化體系的體積）；ρ為蛋白質量濃度/（g/mL）；A0為乳化液在0 min時的吸光度；稀釋倍數為101。

1.3.6 乳液穩定性測定

參考Lu Yinyin等[13]的方法并稍作修改。測定穩定30 min乳液在500 nm波長處的吸光度，A500nm為濁度，表示乳液的乳化穩定性。

1.3.7 粒徑分布及Zeta電位測定

參考吳佳[14]的方法并稍作修改。將所有樣品用超純水稀釋為1mg/mL的PLP溶液，用激光粒度分析儀測定，記錄其粒徑分布。條件參數為散射角90°、平衡時間60 s、測試溫度25 ℃，分散劑為水，黏度0.887 2，折射率1.330；蛋白，折射率：1.450。Zeta電位測定：將所有樣品稀釋成1 mg/mL的PLP溶液，用激光粒度分析儀測定其電位。

1.3.8 活性巰基的測定

參考Beveridge[15]和Gao Hao[16]等的方法測定PLP的游離巰基含量，并稍作修改。用4 mmol/L EDTA、0.09 mol/L Gly和0.086 mol/L Tris配制pH 8.0的Tris-Gly緩沖溶液，隨后將PLP溶于緩沖液中配制成1 mg/mL的PLP溶液。將3 mL的PLP溶液與0.03 mL的4 mg/mL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)緩沖液混合，振蕩混勻，于30 ℃水浴鍋中避光水浴30 min，測定412 nm波長處吸光度，以緩沖液和蛋白溶液為空白，活性巰基含量按式（3）計算：

式中：A412nm為蛋白溶液在412 nm波長處吸光度；D為稀釋因子；C為蛋白質量濃度/（mg/mL）；73.53由106/（1.36×104）計算，摩爾吸收率為1.36×104。

1.3.9 SDS-PAGE測定

參考Li Yihe等[17]的方法適當修改。按照SDS-PAGE試劑盒的要求，制作體積分數分別為12%、5%的分離膠與濃縮膠。將蛋白樣品（2.5 mg/mL）與上樣緩沖液按4∶1（V∶V）的比例混合密封后，于100 ℃煮沸5 min后待其自然冷卻。取20 μL注入濃縮膠泳道中，濃縮電壓為60 mV，分離電壓為80 mV。用考馬斯亮藍R-250染色3 h，然后配制脫色液（100 mL冰醋酸、50 mL無水乙醇，純水定容至1 000 mL）進行脫色，保證脫色液液面高于凝膠，每隔30 min更換一次脫色液，直至條帶清晰為止，結果用相機拍照。

1.3.10 紅外光譜測定

參考趙飛[18]的方法并有所修改。將樣品真空冷凍干燥，設定測定紅外吸收光譜范圍4 000～600 cm-1，分辨率4 cm-1，以不放樣品為空白。用Spectrum軟件對數據切換成吸光度后進行基線校正、數據調整、平滑、歸一化等操作。Peakfitv4軟件擬合譜帶范圍1 600～1 700 cm-1，計算PLP二級結構的含量。

1.3.11 熒光光譜測定

參考Gao Hao等[16]的方法并有所修改。配制0.25 mg/mL PLP溶液，在室溫（25 ℃）條件下使用熒光分光光度計對蛋白溶液進行分析。熒光條件：石英比色皿光程1 cm，激發波長290 nm，發射光譜范圍300～460 nm，狹縫寬度5 nm，電壓700 mV，掃描速率300 nm/min。

1.3.12 表面疏水性測定

參考朱建宇等[19]的方法并稍作修改。取4.0 mL質量濃度調為0.25 mg/mL的PLP溶液，滴入8 mmol/L的ANS溶液20 μL，暗處振蕩均勻，設定激發波長390 nm，發射波長480 nm，2 種狹縫寬度均為5 nm測定熒光強度。

1.3.13 乳液的光學顯微鏡觀察

吸取10 μL均質后的乳液制作裝片，制作過程中避免產生氣泡，用光學顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP溶解度的影響

如圖1所示，與對照組相比，處理組pH 7-40和pH 7-50的溶解度沒有顯著變化（P＞0.05），說明單獨加熱處理不能顯著提高PLP溶解度；在pH 9偏移條件下，溶解度相較于對照組大幅度增加，但50 ℃較40 ℃處理變化不顯著（P＞0.05）；隨著pH值堿性偏移處理程度的增強（pH 11偏移處理），蛋白質溶解度顯著提高，且在同一pH值中，溶解度隨處理溫度的提高而顯著上升（P＜0.0.5）。Wang Yuntao等[20]研究發現單一熱處理PPI時，其溶解度未有明顯變化，而pH 10偏移結合適當加熱能顯著提高溶解度。王慶玲[21]發現僅熱處理對漢麻蛋白溶解度沒有顯著影響，而堿熱處理能顯著提高漢麻蛋白的溶解度。Oliyaei等[22]在不同提取溫度、不同堿性條件提取燈籠魚蛋白，發現在pH 10、pH 12偏移條件下，隨著提取溫度的升高，溶解度逐漸增加。本實驗結果與上述研究結果一致。

圖1 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP溶解度的影響Fig.1 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on the solubility of PLP

2.2 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳化活性的影響

如圖2所示，pH 7-40的乳化性與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05），50 ℃溫和熱處理使得PLP乳化活性比對照組更差（P＜0.05）。在pH 9堿性偏移條件下，隨著溫和熱處理溫度的提高，PLP乳化活性先上升后下降，但pH 9-25與pH 9-50處理組之間并無顯著差異（P＞0.05），Li Lingyun等[23]認為pH 值堿性偏移處理使得蛋白質提前展開，這能提高蛋白在較高溫度下熱穩定性。在pH 11堿性偏移條件下，較高的溫度下也能提高PLP乳化活性（P＜0.05）。耿蕊[24]發現在pH值酸性偏移結合溫和熱處理大豆蛋白時，單獨熱處理（50 ℃、60 ℃）并未改善大豆分離蛋白的乳化性質，而pH 1.5與溫和熱處理結合顯著改善其乳化活性與乳化穩定性。楊慧[25]在研究溫度對大鯢肌漿蛋白乳化活性時，也發現適當加熱能提高蛋白乳化活性，熱處理溫度升高至50 ℃，肌漿蛋白乳化活性開始降低。本實驗結果與上述研究結果基本一致。

圖2 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳化活性影響Fig.2 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on the emulsifying activity of PLP

2.3 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳液穩定性的影響

乳化液是一種不穩定的分散體系，在長時間的靜置狀態下可能會出現失穩現象，乳化液的濁度或濁度比降低，出現分層現象，并且分層界面會隨時間的推移不斷從底層向上移動[26]。從圖3可以看出，在50 ℃條件下pH 9和pH 11偏移處理均能提高乳化穩定性，且pH 11偏移處理更有利于提高乳化穩定性（P＜0.05）。單純溫和熱處理時，隨著處理溫度的提高，乳液的乳化穩定性顯著下降（P＜0.05）；pH 9偏移處理時，隨著處理溫度的提高，乳液的乳化穩定性有所下降，但50 ℃處理組與40 ℃處理組之間無顯著差異（P＞0.05）；pH 11偏移處理時，不同溫度處理組之間的乳化穩定性無顯著差異（P＞0.05）。上述結果表明，與對照組相比，在pH值為7的條件下進行加熱處理不能提高乳液的乳化穩定性，pH值大幅度堿性偏移（pH 11處理組）可顯著提高乳化穩定性，單從乳化穩定性的角度看，25 ℃輔助pH 11偏移處理更為有利。

圖3 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳液穩定性的影響Fig.3 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on the emulsion stability of PLP

2.4 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP粒徑分布、Zeta電位的影響

溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP溶液粒徑分布及平均粒徑的影響如圖4A、B所示，與對照組相比，單一溫和熱處理時，蛋白質的粒徑隨著溫度的升高而大幅度減小，但粒徑分布指數（polymer dispersity index，PDI）并沒有下降、粒度的分布范圍仍然很廣。在同樣溫度條件下，pH值堿性偏移處理能使蛋白質的粒徑大幅度減小、粒徑分布范圍變窄，但各處理組之間的PDI沒有顯著差異。前人的研究發現，較高堿性pH值偏移處理能促進鵝肝蛋白[27]、蛋清蛋白[28]等蛋白聚集體解聚，從而降低蛋白粒徑。Farhad等[7]研究發現單獨加熱或堿性pH值偏移協同熱處理均能顯著降低蠶豆蛋白粒徑，但與單獨pH值堿性偏移處理組相比，單獨加熱組的粒徑更大。

圖4 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP粒徑分布（A）、平均粒徑（B）和Zeta電位（C）的影響Fig.4 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on particle size distribution (A),average particle size (B) and zeta potential (C) of PLP

溫和熱輔助pH值堿性偏移處理后PLP的Zeta電位變化情況如圖4C所示，所有蛋白試樣在處理后恢復至中性環境，因此蛋白表面均為負電荷。對照組的Zeta電位絕對值為18.47 mV，除pH 7-40處理組外，其他處理組的Zeta電位絕對值均顯著高于對照組，且pH 11-50處理組的Zeta電位絕對值最高（26.63 mV）。

上述的實驗結果表明，溫和熱處理、pH值堿性偏移處理以及溫和熱輔助pH值堿性偏移處理均能夠減小蛋白質的粒徑、增加蛋白質表面的電荷數量，其中溫和熱輔助pH 11堿性偏移處理的效果最好。pH 11堿性偏移處理能使蛋白質粒徑減小、增強蛋白質間的靜電排斥作用，而適度的溫和熱輔助處理能加速分子間的運動，使蛋白分子相互碰撞，從而進一步減小粒徑，這就解釋了PLP溶解度提升的原因。此外，堿性條件提供負電荷使得蛋白結構提前展開，熱處理又使得蛋白進一步展開，改善其界面活性和表面膜的形成，有助于蛋白質擴散到油-水界面，得到乳化性和乳化穩定性更好的乳液。

2.5 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP活性巰基的影響

活性巰基是蛋白質中重要的功能基團，其含量的變化可以反映蛋白質空間構象的變化。從圖5可以發現，在同一溫度下，隨著堿性pH值偏移程度的增加，PLP活性巰基含量呈現下降趨勢（P＜0.05），王瑛[29]在研究酸堿誘導重折疊對羅非魚肌球蛋白的影響時也發現活性巰基含量較對照組明顯下降，這可能是因為蛋白在去折疊、重折疊過程中發生不同程度的變性，不能完全恢復原本的結構，使巰基更易氧化成二硫鍵。在堿性pH 9偏移基礎上結合熱處理則加劇這一趨勢（P＜0.05），造成這一現象的原因可能是加熱使PLP活性增強，活性巰基轉化成二硫鍵導致活性巰基含量降低。本結果與吳曉娟等[30]在pH值偏移結合熱處理米糠蛋白對活性巰基含量影響研究中的變化趨勢一致。同時Du Xin等[31]也發現在pH 5～8條件下，鏡鯉肌原纖維蛋白的總巰基含量隨溫度升高（30～90 ℃范圍內）而明顯下降。

圖5 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP活性巰基含量的影響Fig.5 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on reactive sulfhydryl content of PLP

2.6 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP的SDS-PAGE影響

為了研究溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP一級結構的影響，通過SDS-PAGE觀察樣品中PLP亞基的變化。如圖6所示，PLP對照組的電泳條帶分子質量分布范圍為10～15 kDa以及25～200 kDa，而在40～70 kDa范圍的電泳條帶顏色更深。單獨溫和熱處理與溫和熱輔助pH值堿性偏移處理的多數試樣保持了與對照組相同的電泳條帶特征，但pH 9-50、pH 11-25、pH 11-40組濃縮膠條帶頂部有更深的條帶。單獨溫和熱處理、單獨pH值偏移及溫和熱輔助pH值偏移處理后PLP的電泳條帶相似，表明各處理均沒有引起PLP的明顯降解，可見在堿性條件下熱處理使PLP溶解度增加的主要原因不是蛋白質水解，而是蛋白高級結構的變化與非共價鍵作用改變[32]。pH 9-50、pH 11-25、pH 11-40組濃縮膠頂部有更深條帶的原因可能跟二硫鍵的形成有關，Wang Yuntao等[20]研究發現在加熱處理或pH值偏移條件下的熱處理蛋白過程中，較大的團聚體和聚合物產生的原因可能是二硫鍵的形成。

圖6 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP SDS-PAGE的影響Fig.6 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on SDS-PAGE of PLP

2.7 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP紅外光譜的影響

蛋白質的紅外光譜通常具有不同的酰胺區域，酰胺I帶（1 600～1 700 cm-l，為C＝O伸縮振動峰）和酰胺II帶（1 500～1 600 cm-1，為C—N的伸縮振動峰和N—H彎曲振動峰）這2 個波段的光譜波長變化和強度大小常被用來表征蛋白質的二級結構變化，其中大多數研究者使用酰胺I帶對蛋白二級結構進行研究。

如圖7所示，PLP的紅外圖譜具有6 個主要特征吸收峰，分別在3 283（酰胺A帶，為N—H伸縮振動吸收峰）、2 922（酰胺B帶，C—H的對稱和非對稱伸縮振動峰）、1 638（酰胺I帶，為C＝O伸縮振動峰）、1 536（酰胺II帶，為C—N的伸縮振動峰和N—H彎曲振動峰）、1 392 cm-1（為C—H彎曲振動峰）和1 231 cm-1（酰胺III帶，為N—H變形振動峰）。對照組與處理組的紅外光譜顯示出相似的峰圖，表明PLP的二級結構沒有發生重大變化。然而，與對照組波數（1 638 cm-1）相比，單獨熱處理的波數更低（1 633 cm-1），堿性pH值條件下的熱處理也有類似波數降低的情況，這可能是因為PLP的α-螺旋結構相對含量減少[33]。酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）共擬合得出12 個蛋白峰，PLP二級結構相對含量如圖8所示，單獨熱處理導致α-螺旋和β-轉角結構相對含量下降，而β-折疊相對含量上升，表明PLP結構發生變化。相較于堿性條件下的熱處理，單獨熱處理對二級結構的影響更加劇烈，PLP作為熱敏感蛋白在較高溫度下變性而無法有效地包裹油脂[34]，這可能就是加熱溫度升高到50 ℃時（pH 7-50、pH 9-50），PLP乳化活性降低的原因。Fan Linlin等[35]與周若楠[36]分別發現熱處理使β-乳球蛋白、菠蘿蜜種子分離蛋白的α-螺旋和β-轉角含量下降、β-折疊含量增加，并指出較高的β-折疊及無規卷曲會增加蛋白的柔性，從而有利于起泡能力的改善。李春翼[37]研究發現熱處理使麥醇溶蛋白α-螺旋、β-轉角含量下降、β-折疊含量增加。鄭云芳等[38]研究表明熱處理的溫度升高、時間延長使得鱸魚肌原纖維蛋白α-螺旋、β-轉角含量下降，而無規卷曲和β-折疊含量相應增加。綜上所述，溫和熱輔助pH值堿性偏移處理改變了PLP二級結構。

圖7 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP紅外光譜的影響Fig.7 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on infrared spectrum of PLP

圖8 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理后PLP二級結構相對含量Fig.8 Relative contents of secondary structures in PLP after mild heating assisted alkaline pH shift treatment

2.8 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP三級結構的影響

如圖9所示，與對照組相比，內源熒光強度隨熱處理溫度升高、堿性pH值偏移程度增加而下降，最大發射波長λmax從333 nm后移至337 nm。未進行pH值堿性偏移處理的PLP加熱到40 ℃，其熒光強度降低幅度較小，而加熱到50 ℃時，熒光強度下降幅度明顯增加，說明未進行pH值堿性偏移處理加熱到50 ℃時對PLP三級結構有較大影響。未處理PLP的熒光強度最高，這可能由于PLP分子結構有序折疊有助于內部芳香族氨基酸的包埋，而pH 11-50處理組的內源熒光強度明顯降低，波長明顯后移。內源熒光強度的減弱以及最大波長的后移表明PLP的三級結構被破壞，導致氨基酸暴露在極性溶劑中。總之，上述結果說明溫和熱輔助pH值堿性偏移處理使PLP蛋白結構進一步展開，改變蛋白的高級結構。王健等[39]在對pH值偏移結合熱處理大豆蛋白的研究中也有類似發現。Yu Yali等[6]通過研究溫和加熱輔助堿性pH值偏移對蛋清蛋白的影響，發現在堿性pH值偏移條件下，隨著加熱溫度的升高，蛋清蛋白的內源熒光強度逐漸下降，最大波長出現后移，這與本研究結果一致。

圖9 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP三級結構的影響Fig.9 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on tertiary structure of PLP

2.9 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP表面疏水性的影響

表面疏水性可以表征疏水基團在蛋白質表面分布情況，與乳化性和起泡性等依賴于蛋白質界面性質的功能特性有關[6]。蛋白質的表面疏水性對PLP在油/水界面的吸附行為起著重要作用，可以促進蛋白質在油滴表面的吸附作用，防止其聚集和絮凝。

如圖10所示，溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP表面疏水性的影響總體趨勢是表面疏水性隨著熱處理溫度、pH值堿性偏移處理程度的增加而升高。未進行pH值堿性偏移處理時，溫和熱處理后PLP的表面疏水性較對照組有所增加，這可能是因為PLP在熱誘導作用下蛋白分子相互碰撞而破壞蛋白疏水相互作用，使疏水氨基酸暴露在溶液中。蛋白表面疏水性的增加使得蛋白溶解度降低，從而可能導致PLP更容易聚集，乳液穩定性會變差而出現分層。堿性pH值偏移處理的PLP的表面疏水性也明顯高于未處理的PLP，這可能與堿性pH值偏移過程中蛋白質發生去折疊與重折疊使蛋白結構發生重排有關，原本在疏水相互作用下形成的蛋白聚集體被破壞，蛋白粒徑減小，暴露出內部包裹的疏水基團。在堿性pH值偏移條件下，溫和熱處理使PLP的表面疏水性相較于對照組進一步增加，繼續提高熱處理溫度，表面疏水性的增加幅度變小，這表明蛋白質在堿性環境和熱作用下，蛋白質進一步展開暴露出更多的表面疏水基團。表面疏水性的增強改善了界面活性和表面膜的形成，從而使界面上的分散性和乳化性更好，這與乳化活性的變化趨勢一致。Ma Wuchao等[40]研究發現對鱈魚蛋白預熱處理后，預熱溫度的增加提高了鱈魚蛋白的表面疏水性，與本實驗結果一致。

圖10 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP表面疏水性的影響Fig.10 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on surface hydrophobicity of PLP

2.10 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳液顯微結構的影響

如圖11所示，未處理PLP形成的乳液和溫和熱輔助pH值堿性偏移處理后蛋白形成的乳液顯微結構有明顯差異，可以清晰地看到對照組中的乳液液滴聚集體大小不一，加熱到40 ℃（pH 7-40）時，乳液液滴粒徑與對照組相比有所減小，但仍有較大粒徑，加熱到50 ℃（pH 7-50）時，乳液液滴不規則且發生明顯的絮凝現象。在pH 9偏移條件下，相較于對照組，乳液尺寸逐漸減小。加熱到40 ℃（pH 9-40）時，形成的乳液液滴尺寸比pH 9-25更小，加熱到50 ℃（pH 9-50）時，乳液仍然出現少許絮凝現象，但pH 7-50組絮凝現象更為嚴重。在pH 11偏移條件下，乳液液滴尺寸小且呈現規則的球狀，均勻分布在載玻片上，隨著熱處理溫度的提升，乳液液滴尺寸進一步減小且分布均勻。乳液的顯微結構變化與PLP粒徑檢測的結果略有不同，這可能是不同測定方法造成。對于粒度分布結果而言，樣品混合步驟以及較低的蛋白濃度使得PLP顆粒難以聚集，而在顯微鏡觀察中，熱處理后PLP形成的乳液液滴相互排列，可能以更高的速率重新合并從而產生更多的絮凝[41]。

圖11 溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP乳液顯微結構的影響Fig.11 Effect of mild heating assisted alkaline pH shift treatment on microstructure of PLP emulsion

總的來說，pH 11-50組制備的乳液液滴尺寸最小且液滴分布狀態均勻，單位面積內乳液液滴數量較多。有研究表明液滴粒徑均勻分布和較小尺寸的液滴對于乳液的穩定至關重要[21]。李凌云[42]發現在pH 9條件下將肌球蛋白于75 ℃加熱30 min后調回中性，相較于對照組直接加熱，有更均勻和更小的乳液形態，表明堿性條件下的熱處理相較于單獨熱處理可以改善乳液的穩定性。以上結果說明，較高的熱處理不利于乳狀液的穩定性，但堿性pH值偏移與熱處理結合可以改善蛋白在油水界面的穩定性。

3 結論

在溫和的溫度變化范圍內，單獨熱處理對PLP的溶解性無顯著影響、對乳化活性及穩定性有不利的影響，單獨熱處理并不能有效展開蛋白的結構，僅是加速蛋白分子碰撞、減小粒徑。溫和熱處理輔助pH值堿性偏移處理能有效地提高PLP的溶解性及乳化性質，特別是50 ℃熱處理輔助pH 11偏移處理后，所得的PLP溶解度高、乳化性能穩定，且粒徑小、Zeta電位絕對值大，形成的乳液分布均勻。此外，蛋白質的活性巰基含量減少，α-螺旋和β-轉角結構相對含量下降，而β-折疊相對含量上升、表面疏水性提高，表明蛋白質發生一定程度的變性，其高級結構發生較大程度的改變。

綜上所述，溫和熱輔助pH值堿性偏移處理對PLP進行處理能通過蛋白質分子結構和膠粒特性的改變使其水合性質和表面性質顯著改善，溫和熱輔助pH值堿性偏移處理作為一種經濟、安全且有效的改性手段，具有良好的應用前景。