利用微載體系統規模化生產雞成肌細胞

劉屹森，蔡佳琦，李石磊，李瑩瑩，王守偉，楊 峰，胡海娟，劉文婷，李雨爽，董圣艷，陳嘉璇，梁 俊,

（1.天津科技大學 省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京食品科學研究院，北京 100068）

細胞培育肉又稱作細胞培養肉、生物培育肉、培育肉等[1]，是利用動物細胞體外培養的方式控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一種新型肉類食品[2]，該技術被認為是未來緩解環境污染、可持續發展、解決全球公共健康和動物福利等問題的潛在方案[3]。細胞培育肉的生產需要借助細胞大規模體外培養實現[4]，然而細胞貼壁培養所需相對較大的表面空間，從而限制了細胞培育肉工業化生產的規模。貼壁生長的細胞能否有效地附著取決于細胞的特性、細胞與載體表面之間的有效接觸面積及微載體材料本身的生物相容性水平[5-8]。長期以來，傳統的Dish培養皿適合于基礎科學研究，然而，對于大規模的細胞培養，Dish培養皿的比表面積利用率已成為“瓶頸”。因此，為提升細胞大規模培養效率，研究人員將重點轉向了可用于細胞3D培養的微載體開發以及生物反應器相關培養工藝的開發領域[9]，通過不斷提升微載體的比表面積利用率和生物相容性，從而提高細胞的綜合培養效率、不斷降低細胞培養所需空間體積。

如今微載體得到了廣泛研究，其材料主要包括殼聚糖[10]、水凝膠[11]、海藻酸鹽[12]、膠原[13]、透明質酸[14]和聚苯乙烯等。微載體的實用性主要反映在它們的機械性能[15]、生物相容性[16]、沉降系數[17]、能否降解以及物理和化學刺激。在大規模細胞培養中，微載體的培養效率因研究目的、細胞類型和培養環境的不同而有所差異[18]。微載體的選擇按細胞直徑分類：胚胎干細胞為50～100 μm，間充質干細胞為100～300 μm，多細胞混合物為200～600 μm，在使用過程中也依據細胞的類型進行選擇[19]。優化基于微載體的細胞培養條件對于其大規模應用非常重要[20-22]。一種常用方法是利用微載體、生物反應器、細胞和培養基構建細胞微生態系統，旋轉燒瓶反應容器被廣泛用于細胞培養，因為它可以提供均勻的培養環境[23]，在培養過程中，細胞也受外界因素的影響，例如培養條件、轉瓶的轉速和微載體的類型[24-26]。目前為止，有關成肌細胞大規模培養用于細胞培育肉生產的研究鮮有報道。

本研究對Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體進行對比，篩選出更為適合大規模培養成肌細胞的微載體。以3D TableTrixTM微載體為研究對象，探討起始攪拌條件、細胞接種密度、微載體質量濃度、攪拌速率、不同補料方式、血清、珠對珠轉移等因素對細胞大規模培養的影響，并采用單因素變量法優化細胞三維培養的重要參數。通過珠對珠轉移進行細胞更大規模的培養，并將帶有細胞的微載體進行凍存和復蘇，對比觀察帶有細胞的微載體和解凍細胞之間的增殖狀況和形態差異，旨在為大規模細胞培養提供理論基礎和探索性實踐，為細胞培育肉的工業化生產提供前提條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3D TableTrixTM北京華龕生物科技有限公司；Cytodex 1美國Sigma公司。

DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶消化液、杜氏磷酸緩沖鹽溶液（Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI）溶液、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）標記鬼筆環肽溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT噻唑藍、臺盼藍染色液 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國Gibco公司；50 mg/dL和100 mg/dL谷氨酸-葡萄糖標準液 山東省科學院生物研究所；3D FloTrixTMDigest 北京華龕生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

3D FloTrix? mini SPIN單通道生物反應器 北京華龕生物科技有限公司；真空凍干機 德國Christ公司；生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；pH計 奧豪斯儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡 日本Nikon公司；掃描電子顯微鏡 捷克Tecan公司；自動細胞計數器 美國Thermo Fisher公司；多探測器酶標儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 微載體的預處理

Cytodex 1：稱量干燥的微載體置于玻璃瓶中，加入DPBS進行水合，4 h后去除上清液，加入新鮮的DPBS（50 mL/g），121 ℃高溫滅菌，放置在4 ℃冰箱備用；3D TableTrixTM：將微載體直接加入培養基水合使用即可。

1.3.2 微載體的結構測定

1.3.2.1 掃描電子顯微鏡

將Cytdex 1 粉末樣品鍍金后上機觀察。將3D TableTrixTM片劑溶于去離子水并置于10 cm培養皿中，在-20 ℃下冷凍2 h，真空冷凍干燥5～6 h，得到粉末狀3D TableTrixTM微載體樣品，鍍金后上機觀察。

1.3.2.2 粒徑分析

使用光學顯微鏡觀察Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體的結構，并使用顯微鏡自帶的軟件測量微載體的孔徑大小。

1.3.3 成肌細胞的平皿培養

細胞取自25 日齡雞胚。在細胞提取中，將肌肉組織剪碎，0.25%胰酶消化30 min，每隔10 min觀察一次，之后加入2 倍體積的培養基（含10%胎牛血清）以終止消化。收集消化液，1 500 r/min離心5 min，去上清液，將細胞重新懸浮在新的培養基中，并轉移到培養皿中培養，24 h后更換培養基，觀察細胞生長情況，細胞覆蓋度達到80%后傳代。

1.3.4 成肌細胞在3D TableTrix?和Cytodex 1兩種微載體的增殖效率測定

將3D FloTrix-mini SPIN平臺安裝在細胞培養箱內，并與旋轉速率控制器相連，將125 mL轉瓶中的磁葉輪調整到適當高度，將轉瓶高壓滅菌，并在65 ℃烘箱中干燥后使用。

將3D TableTrixTM和Cytodex 1以質量濃度2 mg/mL加入125 mL無菌轉瓶中，從培養皿中收獲細胞，在轉瓶中加入適當數量的細胞懸液，將培養基加至最終體積為100 mL。單獨設置一個微載體混合培養組，將3D TableTrixTM和Cytodex 1分別以質量濃度1 mg/mL混合加入125 mL無菌旋轉燒瓶中，培養條件與上述相同。將旋轉燒瓶放置在3D FloTrix-mini旋轉平臺上，設置轉瓶轉速為40 r/min，每48 h從轉瓶中吸取1 mL樣品，對樣品進行熒光染色并計數，觀察對比細胞在兩種微載體上的貼附情況。

1.3.5 基于微載體的成肌細胞最佳培養條件的測定

1.3.5.1 最佳起始條件的確定

取成肌細胞置于普通培養皿中，使用0.25%胰酶消化5 min，加入2 倍體積的細胞培養基終止消化。收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入培養基使細胞重新懸浮。將3D TableTrixTM加入到含10 mL培養基的轉瓶中，最后把細胞懸液加入到轉瓶中，使細胞與微載體充分混合。攪拌速率設置為0（靜止）、40 r/min（連續攪拌）和24 個周期（40 r/min×10 min和0 r/min×50 min）（間隔攪拌）。接種24 h后，攪拌速率恒定為40 r/min。從轉瓶側臂取1 mL樣品，監測細胞生長情況，對樣品染色和計數。為確保采樣均勻，在吸取微載體樣品時保持40 r/min的持續攪拌。通過測定接種后2、12 h和24 h樣本上清液中的細胞數評估細胞貼附效率。

1.3.5.2 最佳細胞接種數量的確定

3D TableTrixTM用量為2 mg/mL，培養基體積為100 mL，轉速為40 r/min。細胞接種數量分別為1×104、5×104、1×105、2×105個/mL。將細胞接種到轉瓶中，在37 ℃培養箱中攪拌懸浮培養，每隔48 h采集1 mL樣品監測細胞生長情況，對樣品進行染色和計數，繪制細胞在微載體上的生長曲線，篩選出細胞的最佳接種數量。

1.3.5.3 最佳微載體質量濃度的確定

3D TableTrix?以0.5、1、2、4 mg/mL 4 個不同質量濃度接種到轉瓶中，細胞接種數量為1×105個/mL，培養基體積為100 mL。將細胞接種到轉瓶中，在37 ℃培養箱中攪拌懸浮培養，每隔48 h采集1 mL樣品，監測細胞生長情況，對樣品進行染色和計數并繪制細胞在微載體上的生長曲線，確定3D TableTrix?的最佳使用量。

1.3.5.4 最佳攪拌速率的確定

將細胞接種于轉瓶中，細胞接種密度為1×105個/mL，微載體質量濃度為2 mg/mL，培養基體積為100 mL，24 h間隔攪拌后，細胞基本完全貼附在微載體上，分別設置轉速為20、40、60 r/min 3 種攪拌速率進行持續攪拌培養，每隔48 h觀察細胞在3D TableTrixTM上生長情況并計數，確定最佳攪拌速率。

1.3.5.5 血清對細胞懸浮培養的影響

首先將10 片微載體和一定數量細胞轉移到轉瓶中，加入血清體積分數為5%、10%和20%的培養基將細胞重懸，并轉移到轉瓶中，加入培養基使最終體積均為100 mL，同時以40 r/min的速率進行攪拌，每次攪拌10 min后，靜置50 min。在循環第2、12、24次后，吸取轉瓶中上清液并測定其中的細胞數，評估血清體積分數對細胞貼附微載體效率的影響，并使用DAPI染液對細胞在不同血清體積分數下培養24 h后吸取的樣品進行染色觀察，每隔48 h采集1 mL樣品觀察細胞在微載體上的生長情況，并繪制細胞生長曲線，以血清體積分數10%的培養基作為對照，分析血清含量對細胞增殖效率的影響。

1.3.5.6 補料方式對細胞懸浮培養的影響

取細胞接種于轉瓶中，細胞接種數量為1×105個/mL，接種微載體質量濃度為2 mg/mL，使用含20%胎牛血清（V/V）的DMEM培養基為初始培養基，接種24 h后加入相同體積的無血清培養基稀釋為含有10%胎牛血清的DMEM培養基，使得培養基最終體積為100 mL。分別采用每天更換20%培養基、接種后隔天更換50%培養基、接種后每3 d更換80%培養基3 種不同補料策略進行培養，每隔48 h取樣觀察細胞在微載體上的生長狀況，并繪制細胞生長曲線。

1.3.5.7 珠對珠轉移

將細胞接種于兩個轉瓶中，細胞接種數量為1×105個/mL，接種微載體質量濃度為2 mg/mL，培養基體積均為100 mL。細胞在37 ℃、5%的CO2環境中培養8 d，第8天分離轉瓶中攜帶細胞的微載體，加入至一個新的125 mL轉瓶中，該瓶內有10 片新鮮的3D TableTrixTM，加入培養基至最終體積為100 mL，另一個轉瓶培養微環境保持不變，細胞在40 r/min的恒定攪拌速率下繼續培養6 d。每48 h對細胞進行計數，采用細胞的熒光染色量化細胞生長。

1.3.5.8 基于微載體的細胞培養過程中葡萄糖和乳酸濃度的變化

從普通培養皿中收獲成肌細胞，轉瓶中的細胞接種數量為1×105個/mL，微載體質量濃度為2 mg/mL，培養基最終體積為100 mL。將細胞在37 ℃、5%的CO2環境中培養，每隔12 h，從轉瓶中吸取上清液1 mL，將吸取的上清液用生化分析緩沖液稀釋5 倍，加入到生物傳感分析儀中，記錄所取上清液中葡萄糖和乳酸的濃度。

1.3.5.9 細胞轉瓶培養體系的擴大

按1.3.5.7節方法，將1×107個細胞在100mL培養基中培養8 d，將載有細胞的微載體從轉瓶中分離出來，用于珠對珠轉移到1 L轉瓶中。將90 片新鮮的3D TableTrixTM、載有細胞的微載體和1 L培養基通過容器的側臂添加到2 L轉瓶中，每96 h取樣并進行細胞計數，觀察細胞在更大規模的轉瓶中的生長情況。

1.3.5.10 微組織的凍存和復蘇

從轉瓶中取出含有細胞的微載體樣品，離心去上清液，加入含10% DMSO、20%血清和70% DMEM的1 mL冷凍保存劑，將凍存樣品封裝到凍存管中，并將凍存管置于凍存盒內存放到-80 ℃冰箱中冷凍24 h，之后轉移到液氮中長期儲存。

將凍存盒中的微組織從液氮中取出，立即浸入37 ℃的水浴中2 min，輕輕晃動凍存管以促進解凍。解凍完全后，轉移至15 mL離心管中，緩慢加入10 mL培養基，1 000 r/min離心5 min，沉淀微組織，棄上清液。從解凍的微組織中獲取細胞，并對凍存3、7、14、30 d的細胞進行活性檢測。使用顯微鏡對從解凍后微組織中獲取的細胞和普通細胞進行觀測，并使用MTT法對其增殖效率進行對比。

1.3.5.11 細胞的收獲和計數

吸取攜帶細胞的微載體到EP管中，微載體沉降后去除上清液。3D FloTrixTMDigest裂解液以0.15 mL/mg微載體的比例加入，37 ℃孵育30 min，用臺盼藍染色法通過自動細胞計數器對細胞計數，根據式（1）計算細胞回收率，式（2）計算細胞存活率：

2 結果與分析

2.1 Cytodex 1和3D TableTrixTM的結構分析

2.1.1 Cytodex 1和3D TableTrixTM的外觀表征

3 D Table TrixTM是一種新型的大孔明膠微載體，這種微載體以固定質量的片劑狀態存在，厚度為（1.57±0.01）mm，直徑為（8.01±0.05）mm（圖1A1）。而Cytodex1是一種帶正電、無孔的聚乙烯微載體，以粉末狀態存在（圖1B1），經常用于在攪拌式生物反應器中培養細胞[27]。圖1A2、A3和圖1B2、B3分別顯示了3D TableTrixTM片劑和Cytodex 1粉末在顯微鏡以及掃描電鏡下的放大圖像。3D TableTrixTM是一種表面多孔且孔隙較大的不規則球體，這種多孔結構為細胞在微載體上的附著和生長提供了較大的可用面積。Cytodex 1是一種表面光滑的球體，無大孔結構。

圖1 3D TableTrix?片劑（A）和Cytodex 1粉末（B）目測及其微觀圖Fig.1 Visual measurement and electron microscopic images of 3D TableTrix? (A) and Cytodex 1 powder (B)

2.1.2 微載體的粒徑分布

通過顯微鏡測量相同質量的兩種微載體水合后的粒徑分布情況，結果如圖2所示，Cytodex 1的平均粒徑為265 μm，明顯高于平均粒徑為195 μm的3D TableTrixTM，而且3D TableTrixTM的粒徑大小相比Cytodex 1更加不均勻。

圖2 微載體的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of microcarriers

2.2 細胞在兩種微載體的生長情況分析

2.2.1 細胞在兩種微載體的增殖效果分析

基于微載體的細胞生長曲線如圖3a所示，在接種最初的24 h內，大部分細胞都貼附在微載體上。基于兩種微載體培養的細胞均在第2天進入指數期，在第7天進入平臺期，細胞生長曲線之間的生長趨勢沒有區別，均呈S型曲線。然而，細胞在微載體上的分布不同，從細胞附著在微載體上生長的第4天開始，細胞在兩種微載體上的增殖效率有顯著差異（圖3b），并且隨著時間的延長，細胞數量在兩種微載體上的差異越來越大。最終細胞的收獲量如圖3b所示，3D TableTrixTM顯著高于Cytodex 1，為8.97×105個/mL，細胞在3D TableTrixTM比Cytodex 1有更高的增殖效率。

圖3 細胞生長曲線（a）和差異性分析（b）Fig.3 Cell growth curves (a) and difference analysis (b)

2.2.2 細胞在兩種微載體的附著效果分析

細胞在微載體上附著48 h后，通過使用DAPI和FITC標記的鬼筆環肽兩種染液對微載體進行染色觀察，圖4A1～A4表明細胞可以較好附著在Cytodex 1上，圖4B1～B4表明細胞同樣可以附著在3D TableTrixTM上。將兩種微載體以相同質量與細胞混合培養，培養4 d后，取混合液染色觀察，結果發現，細胞在兩種微載體上的附著有顯著差異（圖4C1～C4）。

2.2.3 細胞在兩種微載體的存活率和回收率分析

Cytodex 1由于其表面剛性強，不容易被裂解，因此，使用差速離心法對Cytodex 1附著的細胞進行收集；3D TableTrixTM可以通過用其特定的裂解試劑3D FloTrixTMDigest實現完全裂解，并且裂解后細胞的收獲效率更高。在顯微鏡下觀察到，3D TableTrixTM在30 min內完全溶解（圖5），細胞回收率達到（98.6±0.1）%，細胞存活率維持在（94.2±0.1）%。雖然Cytodex 1可以通過差速離心法實現對細胞的收集，但在胰酶消化和離心過程中對細胞的收獲效率存在很大影響，而3D TableTrix?通過其特定的裂解液實現對細胞的高效回收。綜合來看，3D TableTrixTM相比Cytodex 1更適合進行成肌細胞的大規模培養，后續實驗對3D TableTrixTM微載體細胞培養體系進行優化和完善。

圖5 3D TableTrixTM溶解的明場圖Fig.5 Bright field images of cells during the dissolution of 3D TableTrixTM

2.3 攪拌方式對細胞轉瓶培養體系的影響

本研究測定了3 種不同的攪拌模式（即靜止（不攪拌）、持續攪拌和間隔攪拌）在接種的前24 h內對細胞附著的影響，結果如圖6a所示。2、12 h和24 h細胞的貼附率并沒有顯著差異（P＞0.05）。對吸取的樣品進行染色觀察結果見圖6b～d，發現細胞懸浮培養24 h后，間隔攪拌使細胞在微載體上的分布更加均勻，有利于細胞的增殖。有研究發現，細胞接種后在高速和低速之間（或攪拌和非攪拌周期的間隔）間隔攪拌，可最大限度地提高細胞與微載體的相互作用，促進細胞均勻分布，同時在低速攪拌或不攪拌期間將細胞貼附在微載體上[28-30]。因此，采用間隔攪拌用于后續實驗，以促進細胞均勻貼附在微載體上。

圖6 攪拌方式對細胞轉瓶培養體系的影響Fig.6 Effects of stirring methods on cell culture in spinner flasks

2.4 細胞接種密度對細胞培養結果的影響

為了探索適合微載體培養的最佳細胞接種密度，本實驗使用固定質量濃度的微載體，并將不同數量的細胞與微載體混合，以探索適合微載體細胞培養的細胞數量。結果表明在細胞增殖過程中，不同數量接種的細胞生長有顯著差異（P＜0.05）（圖7A）。接種數量為1×104個/mL的細胞在培養10 d后未能進入指數期。按照其增殖趨勢，細胞進入指數期需要較長時間，不利于細胞大規模培養。當接種數量為5×104個/mL時，細胞正常增殖進入指數期，達到有效增殖，其擴增倍數明顯高于其他細胞接種的密度，但第10天細胞生長曲線尚未到達平臺期（圖7B）。雖然5×104個/mL可以實現細胞的大規模培養，但所需時間較長，效率較低。相比之下，1×105個/mL和2×105個/mL兩組效果好于其他組。由于接種數量的差異，1×105個/mL組在第8天達到平臺期，2×105個/mL在第6天達到平臺期。但是2×105個/mL組因為接種數量較多，其擴增倍數相較于其他幾組比較低，同時細胞在微載體上出現大量聚團，導致細胞大量脫落死亡（圖7F2）。接種數量為1×105個/mL時，細胞呈現良好增殖，細胞微載體聚團較少（圖7E2）。因此，細胞接種數量為1×105個/mL適合細胞的大規模培養。

圖7 細胞接種數量對細胞培養結果的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on cell culture

2.5 微載體質量濃度對細胞培養結果的影響

在細胞生長過程中，不同微載體質量濃度環境下的細胞生長有著較大差異。如圖8A所示，0.5 mg/mL組微載體質量濃度較低，細胞在貼附微載體后，在第4天達到平臺期，細胞數量和細胞擴增倍數相比其他組少（圖8B），不適于細胞的大規模培養。4 mg/mL組，由于微載體質量濃度比較高，大量微載體空載（圖8F2），導致細胞在微載體上生長效率較低，考慮到細胞接種到生長抑制的周期為7 d，因此，4 mg/mL也不適于細胞的大規模培養。1 mg/mL和2 mg/mL組細胞在微載體上生長情況好于其他兩組，通過圖8A發現2 mg/mL組細胞數量顯著高于1 mg/mL組。因此，確定最佳微載體質量濃度為2 mg/mL。

圖8 微載體質量濃度對細胞培養結果的影響Fig.8 Effect of microcarrier concentration on cell culture

2.6 攪拌速率對細胞培養結果的影響

為了評估攪拌速率對細胞增殖的影響，在轉瓶中以20、40 r/min和60 r/min進行培養。當攪拌速率為20 r/min時，細胞生長較快，最大細胞數量為8.91×105個/mL，但在轉瓶培養過程中，微載體無法實現懸浮失重，在顯微鏡下觀察細胞在微載體上生長分布不均勻且細胞微載體聚團較多，因此在20 r/min攪拌速率下不利于細胞在轉瓶中實現大規模培養。攪拌速率為40 r/min和60 r/min時，細胞最大數量分別為9.86×105個/mL和7.92×105個/mL。攪拌速率為60 r/min時，細胞數量從1×105個/mL增加到第8天的7.92×105個/mL，顯著低于其他兩組（圖9），而且細胞增殖速率較慢，同時觀察到部分細胞從微載體上脫落。提高轉瓶的轉速可以增加細胞與微載體的接觸率，然而這一過程也會增加剪切力，降低細胞活力[31]，并且不利于細胞與微載體的貼附。因此，采用40 r/min為細胞培養的最佳攪拌速率。

圖9 不同轉速下細胞數量的差異性分析（a）和生長曲線（b）Fig.9 Differential analysis of cell number at different rotation speeds (a) and cell growth curves (b)

2.7 補料方式對細胞培養結果的影響

在細胞轉瓶培養體系中，為避免吸出微載體導致細胞的損失，無法進行100%培養基的交換。本研究中采用每天更換20%培養基、隔天更換50%培養基以及第3天一次性更換80%培養基3 種不同的補料方式，細胞的生長曲線如圖10所示。在整個培養過程中，3 種補料方式最終所收獲細胞密度差異較為顯著。其中每天更換20%培養基的補料方式獲得的細胞密度最低，收獲細胞數量為7.41×105個/mL；第3天一次性更換80%培養基略優于每天更換20%培養基的補料方式，其獲得的細胞數量為7.79×105個/mL；隔天更換50%培養基的補料方式獲得了最多的細胞數，細胞收獲數量達8.84×105個/mL，并且收獲的細胞密度顯著高于其他兩組，其他兩組因為在細胞培養過程中產生了更多有害的代謝物質，因此，選擇隔天更換50%培養基為最優補料方式。

圖10 不同補料方式下細胞的生長差異性分析（a）和生長曲線（b）Fig.10 Effect of different feeding methods on cell growth

2.8 血清體積分數對細胞培養結果的影響

在體外培養中，血清中必須含有大量的生長因子才能維持細胞活力，促進細胞生長[32]。較高的血清體積分數可維持細胞的良好狀態，促進細胞增殖[33]。細胞使用含5%、10%、20%血清的培養基進行培養，分析不同血清體積分數對細胞的影響，以此來探索合適的培養方法。圖11a表明，隨著初始血清含量的增加，細胞在微載體上的貼附率顯著增加，細胞生長狀況有了明顯改善，從圖11c細胞的染色結果中也可以發現，隨著血清含量的增加，每個微載體上的平均細胞貼附數量也顯著增加，20%血清組細胞貼附率顯著好于其他兩組（P＜0.05）。根據細胞貼附數量的不同，20%初始血清是較優方案。而在之后細胞培養過程中，在達到細胞最大濃度之前，雖然細胞生長速率隨著血清體積分數的增大而加快，但是10%血清和20%血清兩組間細胞密度無顯著差異（P＞0.05）（圖11b），分別為9.1×105個/mL和9.25×105個/mL。在細胞培養過程中，較高的血清體積分數可以有效地確保細胞的活性和增殖能力[34]，但成本會相應增加。通常情況下，細胞培養過程使用血清體積分數為10%的培養基。一方面，初始培養過程中高血清含量提高了細胞和微載體之間的生物相容性；另一方面，增加了細胞的活力，促進了細胞貼壁的效率。在本實驗中，當大多數細胞在24 h內貼附在微載體上時，逐漸增加培養基，將血清稀釋到10%，降低培養成本的同時又可以提高細胞貼附和增殖效率。

圖11 血清體積分數對細胞培養結果的影響Fig.11 Effect of serum volume fraction on cell culture

2.9 珠對珠轉移

細胞增殖與其生長所需的表面積息息相關，為促進細胞增殖以獲得更高的產量，提供更大的表面積至關重要。在常見的單層培養中需從培養皿消化收集細胞，再接種到更多的新培養皿中，而微載體培養是在適當時間提供新的微載體，從而擴大細胞生長所需的表面積，實現細胞連續擴增，不需要采集細胞和重新接種，這種擴增效果需要珠對珠轉移技術的應用，該技術可使細胞在培養過程中轉移到新的微載體上[35]。本研究的珠對珠轉移效果如圖12a所示，加入了新的微載體后細胞開始進一步生長。由于細胞在微載體間的轉移，細胞的染色圖像出現了細胞橋（圖12c4）。添加新微載體后隔天的染色圖像可以進一步證實這種轉移（圖12c1～c3）。同時利用珠對珠轉移實現了細胞的連續擴大培養，由圖12b可以看到，當微載體質量濃度為2 mg/mL時，最大細胞數量可達到7.42×105個/mL；微載體質量濃度為4 mg/mL時，最大細胞數量可達到1.08×106個/mL；而當微載體質量濃度增加到6 mg/mL時，最大細胞數量可達1.74×106個/mL，利用珠對珠轉移實現了細胞的連續擴增培養。

圖12 珠對珠轉移對細胞轉瓶培養的影響Fig.12 Effect of bead-to-bead transfer on cell culture

2.10 細胞轉瓶培養過程中的生長和代謝分析

在細胞轉瓶培養過程中，培養基中葡萄糖和乳酸濃度的變化直接反映了細胞在微載體上增殖的代謝情況[36]。基于上述優化后的細胞轉瓶培養體系進行代謝分析，主要代謝產物的變化如圖13所示，細胞的代謝產物質量濃度隨著細胞培養的進程而變化。由圖13可知，在細胞貼附微載體的初期，葡萄糖的消耗量較低，同時乳酸的累積量也很低，在細胞進入活躍的指數增長期后，葡萄糖的消耗量增大，產生的乳酸量也快速升高，培養120 h后隨著細胞在微載體表面生長密度的增加細胞生長進入平臺期，這時雖然細胞的密度不再增加，但葡萄糖的消耗和乳酸的分泌在更新培養基后仍然呈現快速變化，這說明動物細胞的葡萄糖代謝與細胞的數量之間呈現正相關，葡萄糖代謝不僅可以為細胞生長提供所需的能量和原料，也可以維持細胞的正常生命活動，因此，在培養過程中調控這兩者間的平衡對于提高葡萄糖的綜合利用至關重要。

圖13 轉瓶培養中細胞的葡萄糖代謝情況Fig.13 Glucose metabolism of cells in spinner flask culture

2.11 微載體轉瓶培養體系的擴大

通過對3D TableTrixTM進行珠對珠轉移的可行性驗證，進行更大規模的培養。將1×107個細胞和10 片（0.2 g）微載體加入到125 mL的轉瓶中，培養8 d后一共收獲9.81×107個細胞（9.81 倍擴增）。將含有9.81×107個細胞的微載體接種到100 片（2 g）微載體上，置于2 L轉瓶中繼續培養。最終獲得的細胞總數達到1.07×109個，存活率達到95%以上（圖14）。因此，在24 d內細胞實現了107 倍的擴張。

圖14 細胞在2 L轉瓶中的生長曲線Fig.14 Growth curves of cells in 2 L spinner flasks with 3D TableTrixTM

2.12 顯微組織的冷凍保存

在冷凍保存3、7、14 d和30 d后解凍，細胞仍保持80%以上的存活率（圖15a），使用解凍微載體后的細胞（微組織）也成功進行了細胞擴增，這與正常解凍細胞作為開始擴增的種子細胞增殖狀況（圖15b）和形態（圖1 5 c1、c2）沒有顯著差異（P＞0.0 5），3 D TableTrixTM可與傳統的冷凍保存技術兼容，細胞復蘇后仍然附著在微載體上（圖15c3、c4），從而證明了將微組織凍存作為后續大規模培養中種子細胞的可行性。

圖15 微組織凍存對細胞的影響Fig.15 Effect of microtissue cryopreservation on cell survival

3 結論

雞成肌細胞是生產細胞培育肉的細胞來源，將細胞培養應用于細胞培育肉中，需要大量細胞，因此細胞的大規模培養至關重要。本研究分析了細胞在Cytodex 1和3D TableTrixTM兩種微載體上的生長情況，篩選出3D TableTrixTM作為成肌細胞大規模培養的微載體。3D TableTrixTM是一種可分散、可溶解的多孔微載體片劑，操作簡單，可通過珠對珠的轉移消除細胞傳代過程中的酶解離過程，極大簡化了成肌細胞擴增的流程。此外，細胞可以在3D TableTrixTM微載體上冷凍保存，解凍后仍具有高活力且保留了3D宏觀結構。微載體作為種子細胞在后續批次的培養中進行珠對珠轉移，可用作植入性載體進行細胞培養。然而，微載體Cultispher-G和3D TableTrixTM具有相似的化學組成和宏觀結構。3D TableTrixTM相比Cultispher-G主要優勢如下：1）3D TableTrixTM孔隙更大，細胞生長更多；2）細胞在3D TableTrixTM相比Cultispher-G生長效率更高[37-38]；3）3D TableTrixTM可以通過特定的裂解液3D FloTrixTMDigest進行裂解，從而實現細胞的高效回收。因此，在符合生產質量管理規范下，使用這種高效的微載體，以工業化規模生產成肌細胞產品（如細胞培育肉）成為一種可能。

微載體通常在攪拌式生物反應器中使用，因為微載體具有高的表面積-體積比，所以細胞的增殖效率高，同時微載體的沉降系數也很關鍵，微載體既要在一定時間實現沉降，又要在生物反應器的一定轉速下實現懸浮。相比于無孔球形微載體，使用大孔微載體可以提供更高的表面積-體積比，從而獲得更高的細胞密度，對3D TableTrixTM的研究可支持這一理論，即多孔微載體更能促進細胞培養，這為細胞培育肉的生產提供了新思路，將微載體用于細胞培育肉的有3種可能情況：1）作為支持細胞增殖的臨時載體，之后細胞被取出并進一步加工；2）被溶解或降解以釋放細胞的臨時載體；3）與最終產品相結合的可食用載體。目前為止，專為細胞培育肉行業開發的商用微載體尚無，該領域有很大的需求和潛力，開發可食用的或可被降解和溶解的微載體至關重要。