不同非釀酒酵母與釀酒酵母順序發酵對茵紅李果酒風味的影響

李 甜，雷 雨，李 東，李靜雅，金 磊

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644005）

茵紅李（Prunus salicinaLindl.）是李屬中的一個優良品種，主要分布在中國四川宜賓和臥龍等地，其質地嫩脆化渣、口感酸甜適中、營養價值高等優點廣受消費者青睞[1]。隨著茵紅李的栽培面積擴大和產量提高，導致茵紅李不能及時銷售而造成大量浪費。目前，果酒是水果精深加工的主要方向之一，將茵紅李加工生產為果酒，不僅能保留茵紅李的風味，而且在發酵過程中形成多種活性物質和風味物質。有助于提高茵紅李的經濟價值[2]。然而，由于缺乏專用酵母，李子果酒的風味單一且同質化嚴重[3]，降低了其在果酒市場上的競爭力。

香氣化合物在決定果酒的質量和可接受性方面起著至關重要的作用[4]。果酒香氣受不同因素的影響，而微生物發酵是影響果酒香氣的主要因素之一[5]。在果酒發酵過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要是將糖類物質轉化為乙醇，并產生少量的風味物質。而非釀酒酵母合成一些較高活性的酶類，可將原料中的非揮發性前體物質轉化為酯類、高級醇類等香氣化合物[6]，提高揮發性化合物的氣味活性值[7-8]，改變酸類物質含量[9]和降低不良氣味活性化合物含量[10]。近年來研究表明，不同種類的非釀酒酵母參與果酒混菌發酵產生的風味物質也不相同，克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）與釀酒酵母混菌發酵有利于異戊丁酸乙酯、乙酸異戊酯等香氣物質的合成，使果酒的果香和花香味更加濃郁[11-12]。漢遜酵母屬（Hanseniaspora）與釀酒酵母混菌發酵產更高水平的果味乙酸酯，如2-苯基乙基乙酸酯和乙酸異戊酯[13]。異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）與釀酒酵母發酵葡萄酒產更高水平的乙酯和乙酸酯，賦予葡萄酒適宜的果香和花香味[14]。而戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）則會產生更高含量的有益化合物，如2-苯基乙基乙酸酯和乳酸乙酯[15]。此外，果酒混菌發酵的方式包括同時發酵和順序發酵。相比于同時發酵，順序發酵能延長非釀酒酵母在發酵體系中的存活時間，進而產生更多的甘油和揮發性風味物質[16]，降低脂肪酸含量[17]，進而更有效地改善果酒的感官品質，并縮短發酵周期[18]。因此，順序發酵是非釀酒酵母混菌發酵的較好接種方式。目前，混合發酵在葡萄酒領域得到了廣泛研究，但對于李子酒的研究則相對較少[18]。因此，有必要篩選出適宜的非釀酒酵母，用其與釀酒酵母進行混合發酵，以提高茵紅李果酒的品質。

本研究以宜賓茵紅李為原料，選用6 株本實驗室篩選出的非釀酒酵母（包括異常威克漢姆酵母1 株Wa3，葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）1 株Hu12，克魯維畢赤酵母3 株Pk2A2、PkW2、PkY2，季也蒙畢赤酵母屬（P.guilliermondii）1 株Pg1），與商業釀酒酵母FX10進行順序混合發酵，同時以釀酒酵母FX10發酵作對照。對不同非釀酒酵母混菌發酵過程中生長狀況進行評估，并對茵紅李果酒的理化性質、有機酸、香氣成分及感官特性進行比較分析。研究將有助于篩選出為茵紅李果酒增香的最優酵母組合，為提升茵紅李果酒品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茵紅李原料于2022年8月購自中國四川宜賓，挑選成熟、無病害的茵紅李用于果酒發酵。經檢測其pH 3.42，可溶性固形物為11.6 °Brix，總酸（以蘋果酸計）為5.01 g/L，還原糖為6.07 g/100 mL。

異常威克漢姆酵母（Wa3）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hu12）、克魯維畢赤酵母（Pk2A2、PkW2和PkY2）和季也蒙畢赤酵母（Pg1）為四川輕化工大學生物工程學院農畜產品精深加工實驗室2022年經從水果自然發酵汁中分離、純化得到的自選酵母，使用前均已鑒定。商業釀酒酵母FX10購自法國LAFFORT公司。

仲辛醇、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸（均為色譜純）成都德思特生物技術有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、無水葡萄糖（均為分析純）成都科隆化學品有限公司；甘油G K 法檢測試劑盒（70 assays）北京海富達科技有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基青島高科技工業園海博生物技術有限公司；WL營養瓊脂培養基 北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LB80T手持糖度計 廣東省速為電子科技有限公司；HT512ATC高精度酒精計 深圳市巴里世紀貿易有限公司；N5000PLUS紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；TSQ8000氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛公司；1260infinity I高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；UitraScan VIS色差儀 美國Hunter Lab公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗處理

酵母活化與計數：將保藏菌株接種于YPD固體培養基上，26 ℃培養24 h，再將YPD固體培養基上的單菌落接種于300 mL YPD液體培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養24 h。將培養液在5 000 r/min離心5 min并用無菌生理鹽水洗滌干凈。將酵母菌懸液為108CFU/mL（顯微鏡觀察）加入發酵。在發酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 d和10 d分別取樣并涂布在WL培養基上。通過觀察釀酒酵母FX10（淡綠奶油狀凸起）、異常威克漢姆酵母（白色褶皺凸起）、葡萄汁有孢漢遜酵母（深綠色光滑）、克魯維畢赤酵母（白色扁平褶皺）、季也蒙畢赤酵母屬（乳白光滑奶油凸起）在WL培養基上的菌落形態的差異，進行活細胞計數[19]。

對照組：接種量約為106CFU/mL的釀酒酵母FX10。

實驗組：先分別接種106CFU/mL的異常威克漢姆酵母Wa3、葡萄汁有孢漢遜酵母Hu12、克魯維畢赤酵母Pk2A2、克魯維畢赤酵母PkW2、克魯維畢赤酵母PkY2和季也蒙畢赤酵母Pg1，在24 h后以1∶1的接種比例接種106CFU/mL的釀酒酵母FX10，分別簡稱為Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10。

茵紅李果酒發酵工藝：茵紅李→清洗去核打漿酶解（加入0.1 g/L焦亞硫酸鉀和0.03 g/L果膠酶酶解2 h）→用白砂糖將糖度調整到23 °Brix→漿汁分裝于10 L可取樣發酵罐中→75 ℃水浴巴氏殺菌30 min→冷卻后接種不同處理組酵母→26 ℃下進行發酵直至主發酵結束（連續3 d發酵罐質量減少在1 g以內）→放于10 ℃恒溫箱中進行后發酵1 周（促進酒體的澄清和成熟）→再將發酵液10 000 r/min離心10 min除去酵母細胞，貯藏在4 ℃冰箱→陳釀1 個月后對其理化指標、有機酸、香氣成分以及感官特性進行分析。所有處理一式三份進行。

1.3.2 理化測定

乙醇體積分數、pH 值、揮發酸測定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]；總酸（以蘋果酸計）測定參考GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》酸堿指示劑滴定法[21]；總酚測定參考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定》分光光度法[22]；還原糖測定參考GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》直接滴定法[23]；甘油測定使用甘油GK法檢測試劑盒；色差使用色差儀進行測定。

1.3.3 有機酸

取5 mL原酒液臨用前經0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。參照段云飛等[24]有機酸測定方法，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進行有機酸含量的測定。色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長210 nm，流動相為磷酸二氫鉀（pH 2.4）100%，進樣量15 μL，流速0.4 mL/min，柱溫25 ℃。

1.3.4 揮發性風味成分測定

參考Liu Chunfeng等[7]的方法，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術進行測定。吸取5 mL茵紅李果酒于20 mL頂空瓶中，再加入1.4 g氯化鈉和無水乙醇稀釋過的10 mL/L仲辛醇溶液1 μL作為內標，于45 ℃平衡15 min，再萃取30 min。取出插入氣相色譜柱的進樣口解吸附7 min，解吸溫度為210 ℃。

色譜條件：毛細管柱為DB-WAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣為高純氦氣，恒定流速1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣模式。柱溫箱采用程序升溫，起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升到220 ℃，保持5 min，運行時間39 min。

質譜條件：電子轟擊能量為70eV；接口溫度220 ℃，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍m/z35～500，掃描頻率3.6 scans/s。

氣味活性值（odor activity value，OAV）是指某種化合物的濃度與該化合物在該試劑中可察覺的閾值之比。

1.3.5 感官評價

參考張文文等[25]研究略作修改，由8 名經驗豐富的品評員（4 名女性和4 名男性，年齡在20～36 歲之間）使用定量描述性分析進行感官評估。在正式評估之前，舉行了2 次會議。首先，品評員在評估后分別寫下有關香氣特征的詞匯，并選擇重復的詞匯（2 次以上）進行進一步分析。接下來，品評員討論了最終的香氣描述并達成共識。選擇并量化了6 種感官屬性，包括花果香味、酸味、甜味、乙醇、平衡感和整體可接受性。在正式的感官分析期間，評估員獲得了10 mL單個樣品，這些樣品在（20±2）℃下分別呈遞在20 mL透明杯中。此外，每個樣本都用3 個隨機數編碼，并按隨機順序放在表格上。最后，對指定的茵紅李果酒6 個等級打分，分別是0～5代表由弱到強。

1.4 數據處理

采用SPSS 26.0進行單因素方差分析和Duncan多重比較分析檢驗，P＜0.05，差異顯著，數據以形式呈現。采用Origin 2021進行主成分分析（principal component analysis，PCA）圖、折線圖和雷達圖的制作。

2 結果與分析

2.1 酵母發酵動力學與乙醇生成動力學

在果酒發酵過程中，酵母的數量和種群動態變化與風味的形成和變化密切相關[26]。不同酵母組合和釀酒酵母發酵過程中酵母生長情況和乙醇體積分數的變化如圖1所示。在對照組中，酵母生物量在發酵2～5 d維持在較高水平，約為7.5（lg（CFU/mL）），隨后菌體量緩慢下降，在10 d酵母的生物量為6.04（lg（CFU/mL））。然而，在混菌發酵中，盡管釀酒酵母以相同的初始接種濃度進行發酵，但其最大生物量下降了4.4%～9.1%。這一結果與Liu Chunfeng等[7]發現混菌發酵中釀酒酵母的最大生物量會下降保持一致。此外，在混菌發酵中，非釀酒酵母主要在發酵前期發揮作用，6 d未檢測到Hu12的活細胞，7 d未檢測到Wa3、PkY2和Pg1的活細胞，8 d未檢測到PkW2和Pk2A2的活細胞。表明在混合發酵中，非釀酒酵母和釀酒酵母的生長均受到一定程度的抑制。這種抑制可能是由于乙醇含量逐漸增加、溶氧量逐漸降低以及酵母菌之間的相互作用等多種因素導致[27]。通過對乙醇體積分數的監測發現，釀酒酵母FX10在發酵前5 d乙醇體積分數的增長速率最快，在5～10 d乙醇體積分數基本維持穩定，在10 d乙醇體積分數為11.85%。然而，在混合發酵中，乙醇體積分數的增長速度相對較慢，在發酵10 d乙醇體積分數為9.89%～10.94%。可能是非釀酒酵母加入混菌發酵，降低了釀酒酵母最大生物量，進而使產生的乙醇體積分數降低。

圖1 非釀酒酵母和釀酒酵母的生物量與乙醇生成量動態變化Fig.1 Dynamic changes in yeast biomass and alcohol production of non-Saccharomyces and S.cerevisiae during plum wine fermentation

2.2 基本理化指標

如表1所示，混菌發酵的茵紅李果酒乙醇體積分數范圍為10.93%～11.66%，顯著低于釀酒酵母FX10發酵果酒中的乙醇體積分數12.2%。而混菌發酵果酒中還原糖質量濃度范圍為1.95～2.75 g/L，高于釀酒酵母FX10發酵果酒中的還原糖1.88 g/L。甘油可以使果酒的口感更加圓潤，同時帶有微甜的味道。各混菌發酵酒中的甘油質量濃度范圍為6.85～7.22 g/L，均高于釀酒酵母FX10發酵6.65 g/L，其中PkY2-FX10發酵酒中甘油含量最多，這與Benito等[16]報道克魯維畢赤酵母參與順序發酵可以增加甘油含量的結果一致。可以推測，混菌發酵中乙醇含量減少的原因可能是酵母菌株受到抑制導致糖代謝受阻，也可能是糖代謝過程中使更多的糖類物質轉化為甘油等其他物質[28]。

表1 不同酵母組合發酵茵紅李果酒的理化特性Table 1 Physicochemical properties of Yinhong plum wines producing using different fermentation strategies

在長時間的貯藏過程中，果酒的pH值可能會影響其色澤。較低的pH值會導致游離花青素含量減少，而較高的pH值將導致果酒發生褐變[29]。本實驗測得的果酒pH值介于3.16～3.35之間。果酒的酸度是評估其獨特純凈和清爽特性的重要參數[30]。Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10發酵酒中總酸含量顯著高于其他發酵酒，與張文靜等[11]報道克魯維畢赤酵母具有增加總酸含量的結果一致。Wa3-FX10發酵酒中產生的揮發酸最高為0.76 g/L，其次是Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10。然而，揮發酸含量過高可能會給果酒帶來負面影響[31]，但本實驗結果均在GB 15037—2006規定范圍內（揮發酸＜1.2 g/L）。

酚類化合物是果酒中的天然抗氧化劑，對色澤、香氣、澀味和苦味等感官品質起關鍵作用[32]。本研究發現Wa3-FX10和PkW2-FX10發酵的茵紅李果酒中總酚含量顯著高于釀酒酵母FX10發酵的茵紅李酒。此外，之前報道也指出，異常威克漢姆酵母和釀酒酵母發酵能顯著增加果酒中的多酚產量[30]。在混菌發酵中，除Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發酵酒外，其他酒的ΔE*值高于釀酒酵母FX10發酵的茵紅李酒。

2.3 有機酸

有機酸對果酒的感官特性和品質起著十分重要的作用[33]。如表2所示，茵紅李果酒中蘋果酸占有機酸中的比例最高，發酵茵紅李果酒中蘋果酸質量濃度在3.16～4.99 g/L之間，顯著低于茵紅李果汁（6.84 g/L）。特別是Hu12-FX10發酵后的茵紅李果酒中蘋果酸含量最低，表明葡萄汁有孢漢遜酵母可能具有降解蘋果酸的能力，這結果與白玉峰等[34]發現葡萄汁有孢漢遜酵母能降低蘋果酸含量的結果一致。而Wa3-FX10發酵酒中乙酸和琥珀酸的含量最高，大量的乙酸具有醋酸味，而琥珀酸具有“鹽-苦-酸”的味道，可能給果酒帶來令人不愉悅的味道。與對照相比，混菌發酵的乳酸質量濃度降低了0.12～1.07 g/L，但乙酸質量濃度增加了0.14～0.91 g/L。其中Wa3-FX10發酵茵紅李果酒中乙酸質量濃度最高1.16 g/L，為釀酒酵母FX10的4.64 倍。乙酸含量的增加可能是不同種類酵母混合在一起進行發酵時，它們之間會相互抑制對方的生長和代謝，從而導致了不利條件的形成，促使了乙酸的產生增加[30]。

表2 茵紅李果酒和果汁中有機酸質量濃度Table 2 Organic acid concentrations in Yinhong plum wines and juice g/L

2.4 揮發性風味分析

香氣是影響果酒品質的重要特征之一，尤其是酯類、高級醇和揮發性脂肪酸等揮發性風味物質對果酒的次級香氣具有顯著影響[35]。本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術，在茵紅李果酒和果汁中共檢測到43 種揮發性風味物質，包括酯類18 種、高級醇類12 種、揮發性脂肪酸類5 種和其他類物質8 種，結果如表3所示。不同發酵酒中揮發性風味物質的組成和含量存在差異，在Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10和FX10發酵酒中分別檢測到32、31、35、35、34、34 種和33 種揮發性風味物質。其總量分別為5.683、5.715、6.033、7.734、7.961、3.790 mg/L和3.775 mg/L。而茵紅李果汁中檢測到28 種揮發性風味物質，總量為0.733 mg/L。果汁中含有較多的醛類香味物質，而經過發酵后，酯類、高級醇類及揮發性脂肪酸化合物的含量顯著提高，表明發酵過程增加了揮發性風味物質的種類和含量。

表3 茵紅李果酒和果汁中揮發性化合物濃度Table 3 Concentrations of volatile compounds in Yinhong plum wine and juice

酯類化合物是果酒中的重要香氣化合物之一，主要包括乙酯和乙酸酯類，對果酒的主體香氣具有重要影響[36]。在檢測到的18 種酯類化合物中，Wa3-FX10、Hu12-FX10、Pk2A2-FX10、PkW2-FX10、PkY2-FX10、Pg1-FX10和FX10發酵茵紅李果酒中分別有6、5、8、7、8、5 種和6 種為氣味活性化合物（OAV＞1）。其中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯是7 種發酵酒中共有的氣味活性化合物（OAV＞1），這些化合物是茵紅李果酒的特征風味物質。混菌發酵茵紅李果酒中酯類化合物的總量（1.293～4.842 mg/L）顯著高于對照組FX10（1.026 mg/L）。尤其是乙酸苯乙酯、乙酸己酯和乙酸異戊酯的含量顯著提高，表明混菌發酵有利于乙酸酯的形成。這與之前的研究結果一致[37]。另外，PkY2-FX10發酵的茵紅李果酒中酯類化合物總量最高，為對照菌株FX10的4.72 倍。其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發酵的茵紅李果酒，它們的酯類含量分別為對照組的4.09 倍和3.04 倍。這可能與克魯維畢赤酵母具有較高的酯酶活性有關[38]。在PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發酵的茵紅李果酒中，乙酸苯乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和乙酸順式-3-己烯酯質量濃度顯著高于其他混菌發酵組合。乙酸順式-3-己烯酯僅在克魯維畢赤酵母參與發酵的酒中檢測到，這可為茵紅李果酒帶來梨樣的水果香。乙酸苯乙酯的OAV在12.14～20.29之間，可為茵紅李果酒帶來玫瑰花香和蘋果果香[39]。此外，乙酸己酯具有較高的OAV，在30.11～44.89之間，可賦予茵紅李果帶來蘋果、梨等水果香味[40]。Wa3-FX10產水楊酸甲酯質量濃度最高，為0.079 mg/L，超過了其閾值0.071 mg/L，可賦予果酒淡淡的薄荷清香味[41]。乙酸乙酯是果酒中最重要的酯類化合物，由乙醇和乙酸脫水反應而成。在較低質量濃度水平（＜50 mg/L）下，它具有令人愉悅的果香[42]。Hu12-FX10發酵的茵紅李果酒中乙酸乙酯質量濃度最高，為1.82 mg/L，也有研究報道，葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混菌發酵會產生較多的乙酸乙酯[43]。

高級醇是由微生物通過Ehrlich途徑將相應氨基酸轉化或將糖類物質分解產生的一類化合物[44]。高級醇是愉悅酯類化合物的前體物，當高級醇總質量濃度低于300 mg/L時，可以促進果酒的風味復雜性[7]。在本實驗中，除Pg1-FX10發酵酒中高級醇總量（2.160 mg/L）低于對照FX10（2.408 mg/L）外，其余混菌發酵酒樣中高級醇總量均高于對照。特別是Wa3-FX10質量濃度（3.478 mg/L）最高。高級醇中1-壬醇、苯乙醇和苯甲醇在果汁含量較少，經發酵成果酒后，它們的含量顯著增加。均在Hu12-FX10發酵酒中含量最高，其中1-壬醇和苯乙醇可以為茵紅李果酒帶來蜂蜜、玫瑰等宜人香氣，而苯甲醇會給果酒帶來苦杏仁味。葉醇具有青香、藥草香、綠葉香香氣[40]。葉醇在果汁中質量濃度（0.047 mg/L）顯著高于其他發酵酒（0.012～0.032 mg/L），說明經發酵后的酒樣能明顯降低果汁中的青草香氣。

揮發性脂肪酸是果酒香氣復雜性和香氣平衡性的重要揮發性化合物[45]。然而，當揮發性脂肪酸的總質量濃度低于20 mg/L時，可賦予果酒豐富的果味[43]。在本研究中，發酵的茵紅李果酒中共有5 種揮發性酸類化合物，包括乙酸、丁酸、己酸、癸酸和辛酸。這些化合物的總量范圍為0.102～0.181 mg/L，均未超過于20 mg/L。在混菌發酵酒中，除Pg1-FX10和Pk2A2-FX10發酵酒中揮發性酸類物質總量略低于對照FX10外，其余混菌發酵酒樣中揮發性酸類物質總量范圍為0.136～0.181 mg/L，均高于對照（0.082 mg/L）。值得注意的是，乙酸、丁酸和辛酸是李子中本身存在的揮發性酸，經發酵后，各種揮發性脂肪酸類化合物的含量均顯著提高。乙酸具有尖銳的酸味，而辛酸、己酸和癸酸均有不愉快的氣味，如山羊臭、奶酪香和脂肪臭。然而，由于這些酸類化合物均具有極高的閾值[46]，它們不會給果酒帶來不良影響。另外，與釀酒酵母FX10相比，混菌發酵酒中辛酸的含量有所降低。這與張曼[40]在其研究中所得到的混菌發酵脆紅李果酒中辛酸含量降低的結果一致。

除了主要的酯類、高級醇類和揮發性脂肪酸類化合物外，部分醛、酮和萜烯類化合物對果酒的香氣產生一定的影響。在混菌發酵茵紅李果酒中，2-辛酮質量濃度（0.017～0.106 mg/L）顯著高于釀酒酵母發酵0.015 mg/L。混菌發酵酒中苯甲醛質量濃度（0.123～0.264 mg/L）也高于對照0.117 mg/L。2-辛酮具有花香和草香香氣，苯甲醛具有花香和香草等特殊氣味，有利于提高果酒風味的復雜性。另外，僅在茵紅李果汁中檢測到了4-乙基苯甲醛、芳樟醇、壬醛和正己醛，這表明它們是茵紅李獨特的品種香氣成分。

2.5 PCA

一般認為OAV＞1的化合物對果酒的香氣貢獻較為顯著，而OAV＞0.1的化合物可能表現出協同作用，有助于果酒的風味[49]。因此，本實驗對OAV＞0.1的20 種香氣化合物進行PCA，結果如圖2所示。PCA解釋了累計貢獻率的67.6%，PC1和PC2分別占總差異的48.7%和18.9%。可以看出，發酵過程中不同酵母組合可以產生獨特的氣味活性化合物，從而在茵紅李果酒中產生不同的風味特征。Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10與乙酸己酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸順式-3-己烯酯7 種香氣化合物聚集在右上角。這些酵母組合與對照組差異顯著，表明克魯維畢赤酵母與釀酒酵母的混菌發可以顯著影響茵紅李果酒的風味。Wa3-FX10位于PC2負軸上，FX10位于左下角，而Pg1-FX10和Hu12-FX10則位于右下角，這4 種酵母組合距離較近，說明這3株非釀酒酵母與釀酒酵母混菌發酵對果酒的風味影響不顯著。另外，果汁樣品的位置位于PC1的左上角，與壬醛、甲基戊酸乙酯和芳樟醇密切相關。

圖2 發酵結束后茵紅李果酒中OAV＞0.1的香氣化合物PCAFig.2 PCA plot of aroma compounds with OAV >0.1 in Yinghong plum wines and juice

2.6 感官分析

采用定量描述性分析對茵紅李果酒樣品進行感官評定，結果如圖3所示。與對照組相比，混菌發酵產生的乙醇味相對較弱，這與混菌發酵降低了其乙醇體積分數相關。此外，最突出的花果香味主要在PkY2-FX10發酵液中發現，其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10，這主要與它們產生大量酯類氣味活性化合物相關。Wa3-FX10和Hu12-FX10發酵酒中酸味比較明顯，可能與它們產生較多的乙酸相關。此外，雖然PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10的總酸含量高于其他發酵組，但它們的酸味強度顯著降低（P＜0.05）。這可能是因為更高的甜味和酯類化合物掩蓋了尖銳的乙酸酸味。總體而言，PkY2-FX10、Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發酵的茵紅李果酒在花果香味、整體可接受性和平衡感方面均具有較高的評分，這表明克魯維畢赤酵母與釀酒酵母混菌發酵對茵紅李果酒香氣和品質具有積極影響。

圖3 采用定量描述性分析對茵紅李果酒樣品進行感官評定結果Fig.3 Sensory evaluation results of Yinhong plum wine samples by quantitative descriptive analysis

3 結論

實驗分析了不同非釀酒酵母與釀酒酵母順序發酵對茵紅李果酒風味品質的影響。結果表明，混菌發酵中，釀酒酵母與非釀酒酵母均受到了一定程度的抑制作用，而非釀酒酵母主要在發酵初期發揮作用，6～8 d出現死亡現象。發酵組中茵紅李果酒中的各項理化指標存在差異。與釀酒酵母FX10相比，混菌發酵的茵紅李果酒中甘油產量提高，乳酸含量、乙醇含量和對還原糖的消耗降低。在風味成分方面，通過氣相色譜-質譜共檢測到43 種揮發性風味物質，茵紅李果酒中主要以酯類和高級醇類化合物為主。其中辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯被確認為茵紅李果酒的特征風味物質。與釀酒酵母FX10相比，混菌發酵的酯類化合物含量均顯著提高。其中，PkY2-FX10發酵的茵紅李果酒中酯類含量最高，為對照組的4.72 倍。其次是Pk2A2-FX10和PkW2-FX10發酵，酯類含量分別為對照組的4.09 倍和3.04 倍。PCA顯示，Pk2A2-FX10、PkW2-FX10和PkY2-FX10與辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、肉桂酸乙酯、乙酸順式-3-己烯酯和乙酸異戊酯7 種香氣化合物緊密相關，這些化合物顯著提升了茵紅李果酒中的花果香味。綜上，將克魯維畢赤酵母和釀酒酵母順序發酵是提高茵紅李果酒香氣成分的最佳酵母組合，但其增加茵紅李果酒香氣成分的機理仍需進一步研究。