基于雙菌耦合發酵策略的煙酰胺單核苷酸合成

孫 婷，張洪濤, ，楊 峰，柴文剛，薛皓陽，譚淑引

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.海軍軍醫大學藥學系無機化學教研室，上海 200433；3.倫敦帝國理工學院醫學院，糖科學實驗室，英國 倫敦 HA13UJ；4.江南大學化工學院，江蘇 無錫 214122）

煙酰胺單核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種自然存在的生物活性核苷酸[1]，它廣泛分布在人體的所有細胞內，是細胞內完成生命活動必不可少的輔因子[2]。研究發現NMN在改善衰老血管的血流量[3]、減少腦出血后腦損傷[4]、提高胰島素敏感性、促進肌肉重塑[5]等方面發揮著重要作用，值得一提的是NMN可以通過減少DNA損傷防治新冠、加速新冠患者的康復[6-7]。2020年，日本厚生勞動省將NMN列入“非醫療清單”，允許其在食品生產中使用。NMN已成為食品、醫學、保健品領域的研究熱點[8]。

目前，NMN的合成方法主要有化學合成、酶法合成和生物合成3 種途徑[9]。化學合成NMN需要先合成煙酰胺核苷，通常從核糖衍生物和煙酸衍生物開始，成本高、環境污染嚴重[10]；酶法合成效率較高，但存在操作復雜、成本高等缺陷[11]；生物發酵法是利用細胞將底物轉化為特定產物的過程[12]，由于減少了傳統酶催化細胞裂解和蛋白質濃縮等步驟[13]，因此具有選擇性高、催化活性強、成本效益高等獨特優勢[14]。據2021年研究報道，以煙酰胺和葡萄糖為底物，發酵法生產NMN最高產量為6.79 g/L[15]。目前發酵液中NMN產品濃度較低，嚴重阻礙了發酵法合成NMN技術的產業化。因此，亟需開發一種更高效的NMN生物合成工藝。

細胞內NMN的合成路線主要有兩條途徑：1）以煙酰胺核糖（nicotinamide riboside，NR）為底物，ATP作為輔因子，通過煙酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）催化直接實現NMN合成[16]；2）以核糖和ATP為底物，先在核糖磷酸焦磷酸激酶（phosphoribosylpyro phosphate，PRPP）催化下生成5-磷酸核糖-1α-焦磷酸，后者在煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）催化下與煙酰胺合成NMN[17]。第2條途徑為多酶催化體系，需要酶的種類較多，中間產物多，總體收率低[18]，而第1條途徑只需要一步酶催化即可完成，且能夠避免使用價格較高、來源受限的PRPP[19]。因此，本研究建立以NR和ATP為底物，通過NRK一步法直接轉化為NMN的全細胞合成體系。考慮到該反應需要由ATP提供一個磷酸基供體，而單純外源添加造成生產成本高[20-21]，因此構建ATP再生系統是提高生物合成反應經濟性的一個有效措施[22]。由于多聚磷酸酶（polyphosphate kinase，PPK）可催化無機多聚磷酸鹽（inorganic polyphosphate，Poly-P）和ATP之間的磷酸鹽可逆轉化，實現ATP的循環再生[23]，故將該系統引入NMN的合成體系，用以實現ADP到ATP再生。

本研究構建基于大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）-pET28a-NRK、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細胞雙菌耦合發酵體系（圖1），實現基于工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的ATP再生系統在E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK合成NMN中的應用。構建的雙菌耦合發酵系統可以通過ATP再生實現ATP持續供給，降低整個發酵體系的生產成本，實現NR到NMN的連續化合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

E.coliBL21（DE3）天根生化科技（北京）有限公司；表達載體pET28a質粒由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，調節pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；固體培養基添加瓊脂粉2%。將工程菌接種到LB瓊脂平板上，37 ℃培養12 h。

1.1.3 試劑

卡那霉素（kanamycin，Kan）、DNA Marker及蛋白Marker 翌圣生物科技（上海）股份有限公司；質粒提取試劑盒、限制性內切酶、Taq酶、T4 DNA連接酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；NMN標準品 海軍軍醫大學趙慶杰教授贈送；NR、ADP、ATP標準品 杭州鎧朋生物技術有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）北京伊諾凱科技有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicaci，HEPES）北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

C1000 TouchTM聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Mini-PROTEAN Tetra蛋白電泳儀美國Bio-Rad公司；高效液相色譜儀 日本島津公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；三重四極桿液相色譜-質譜聯用儀 賽默飛科技有限公司；超聲波破碎機寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的構建

將編碼NRK1基因序列（Gene ID：54981）、NRK2基因序列（Gene ID：6787）、PPK基因序列（Gene ID：VLKR01000001.1）進行大腸桿菌偏好性密碼子優化，由天霖生物公司合成，獲得重組質粒pET28a-NRK1（圖2a）、pET28a-NRK2（圖2b）和pET28a-PPK（圖2c），然后分別轉化到E.coliBL21（DE3）感受態細胞中，并利用Kan選擇性培養基，37 ℃培養12 h，篩選出陽性克隆。設計引物NRK1-F、NRK1-R，NRK2-F、NRK2-R和PPK-F、PPK-R（表1），挑取單菌落進行菌落PCR驗證，由天霖生物公司對條帶大小正確的轉化子進行測序驗證。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR in this study

圖2 重組質粒構建Fig.2 Recombinant plasmid construction

1.3.2 重組蛋白的表達

分別挑取工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的單菌落接入10 mL含有20 μg/mL Kan的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養12 h。再以2%接種量轉接到150 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖瓶培養至OD600nm約為0.7后加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃、200 r/min條件下過夜誘導培養后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體備用，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白表達情況。

1.3.3 NMN的生物合成及結構鑒定

NMN合成體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L NR、40 mmol/L ATP、NRK菌體質量濃度100 g/L，18 ℃、100 r/min反應12 h。

薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）檢測：展開劑1,4-二氧環烷∶水∶氨水∶異丙醇=4∶2.5∶3∶2（V/V），254 nm波長紫外照射顯色。

液相色譜-質譜檢測條件：大氣壓電噴霧電離源H-ESI II probe；色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；液相流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；吸收波長254 nm。流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸，程序：0～2 min，0% A、100% B；2～6 min，0%～90% A、100%～10% B；6～7.5 mim，90% A、10% B；7.5～8 min，9 0%～0% A、10%～100% B；8～11 min，0% A、100% B。

1.3.4 NMN的定量分析

配制6 組NMN標準溶液1、2、3、4、5、6 mg/mL，通過高效液相色譜對NMN標準溶液進行定量分析，以NMN標準品的濃度為橫軸，色譜中相應的峰面積為縱軸，對液相色譜結果進行線性回歸分析，繪制NMN的標準曲線，根據標準曲線計算得到相應樣品質量濃度。

高效液相色譜條件：色譜柱為Unitary C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%高氯酸溶液；流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；紫外檢測波長257 nm；柱溫30 ℃；洗脫時間20 min。

1.3.5 ATP的生物合成及鑒定

ATP的合成體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L ADP、20 mmol/L Poly-P、PPK菌體質量濃度100 g/L，18 ℃、100 r/min反應12 h。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀對合成的ATP進行鑒定：采用反射陰離子模式，2,5-二羥基苯甲酸作為輔助基質，掃描分子質量范圍為470～600 Da。

1.3.6 單菌合成體系的優化

1.3.6.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的誘導表達條件優化

在搖瓶發酵培養過程中，設置不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、誘導時長（8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）、誘導溫度（16、20、25、28、30、37 ℃）和誘導劑IPTG終濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1 mmol/L）依次進行梯度實驗，以期獲得更多的目的蛋白。

1.3.6.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN的條件優化

對單一工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物合成NMN過程中的菌體質量濃度（25、50、75、100、125、150 g/L）、時長（8、10、12、14、16、18、20 h）、溫度（18、30、37 ℃）、底物ATP（20 mmol/L）與NR濃度比（1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶2）進行優化。

1.3.7 雙菌耦合發酵體系的建立及優化

構建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1及工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細胞雙菌耦合發酵體系：20 mmol/L HEPES（pH 7.2）、5 mmol/Lβ-巰基乙醇、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L NaCl、30 mmol/L NR、20 mmol/L ATP、40 mmol/L Poly-P、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、100 g/LE.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，18 ℃、100 r/min反應12 h。

對雙菌耦合發酵體系從ATP與NR濃度比（1∶1.5、1∶2.5、1∶3.5、1∶4.5、1∶5.5）、菌體質量濃度比（1∶0、1∶2、1∶1、1∶0.67、1∶0.5）及發酵時長（6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）進行優化，獲得耦合發酵的最適條件。

2 結果與分析

2.1 工程菌的構建及誘導表達

重組表達質粒pET28a-NRK1經過PCR驗證結果見圖3a泳道1，得到的片段長度與目的基因NRK1（610 bp）大小一致；重組質粒pET28a-NRK2的PCR驗證結果見圖3a泳道2，得到的片段長度與目的基因NRK2（703 bp）大小相同；對重組質粒pET28a-PPK進行PCR驗證，結果如見圖3a泳道3，得到的片段長度與目的基因PPK（801 bp）大小一致。經測序驗證正確，得到重組質粒pET28a-NRK1、pET28a-NRK2和pET28a-PPK。將重組質粒分別導入E.coliBL21（DE3）中，對得到的工程菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK進行SDS-PAGE分析，結果如圖3b所示，誘導20 h的全細胞在25～35 kDa均有明顯的表達條帶，與NRK1目標蛋白（26 kDa）[24]、NRK2目標蛋白（26 kDa）[24]、PPK目標蛋白（29.7 kDa）[25]大小一致，成功構建工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2和E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK。

圖3 重組質粒電泳圖Fig.3 Electrophoretograms of recombinant plasmids

2.2 單菌法合成產物NMN的鑒定

2.2.1E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK生物合成產物NMN的分析鑒定

人體細胞內的NRK1和NRK2均具有催化NR和ATP合成NMN能力，構建了E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1和E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2工程菌株，進行NMN的全細胞合成。用TLC法對發酵液進行檢測，結果見圖4a，發現樣品中有與NMN標準品相同Rf值的產物生成，初步判斷有產物NMN生成。

圖4 NRK合成NMN的產物分析Fig.4 Product identification of NMN synthesis by NRK

為進一步驗證產物，對產物進行刮板回收，進行液相色譜-質譜分析，從圖4c總離子流圖可以看出樣品只有一個離子化峰，出峰時間為1.95 min，進一步分析該峰顯示m/z334.95，均與NMN標準品相同。通過液相色譜-質譜分析可以判斷生成的產物為NMN，因此認為E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK具有合成NMN的活性。

2.2.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK再生產物ATP的分析鑒定

以ADP、Poly-P為底物，在E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的作用下合成ATP，TLC檢測結果如圖5a所示，樣品的Rf值與ATP標準品相同。對產物進行刮板回收，進行基質輔助激光解析電離飛行時間質譜檢測，結果如圖5b、c所示，生成的ATP樣品與ATP標準品分子質量相同，說明E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK可以實現ATP的再生。

圖5 PPK合成ATP的產物分析Fig.5 Product identification of ATP synthesis by PPK

2.3 單菌誘導及生物合成NMN條件優化

2.3.1 NMN標準曲線的建立

NMN標準品溶液經高效液相色譜檢測（圖6），以NMN濃度為橫坐標，液相色譜圖中對應的峰面積為縱坐標，繪制NMN的標準曲線，經線性回歸后得到標準曲線方程的R2=0.995 4，說明NMN濃度和液相色譜圖中的峰面積有良好線性關系。

圖6 NMN標準品液相出峰時間Fig.6 Chromatographic peak time of NMN standard

2.3.2E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK高活性工程菌株的篩選

在哺乳動物體內存在兩種NRK酶NRK1和NRK2，分別由Nmrk1和Nmrk2兩種基因編碼。NRK亞型的表達分析表明NRK1無所不在，而NRK2主要存在于骨骼肌中，兩種酶均具有催化NR反應生成NMN的能力。為從兩者中篩選出高產NMN的工程菌株，進行3 組NMN的全細胞合成。對產物進行高效液相色譜定量分析，如圖7所示，3 組均可以合成NMN，其中E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1反應液中NMN產量最高為5.17 g/L，產率77.4%，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2反應液中僅為1.12 g/L，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1與E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2菌株混合反應液中產量為4.09 g/L。因此選取工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1為最優合成NMN的工程菌株，用于后續雙菌耦合發酵系統的構建與優化探索。

圖7 不同工程菌對NMN產量的影響Fig.7 Effects of different engineered bacteria on NMN yield

2.3.3E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1誘導表達NRK1條件優化

相同細胞濃度下工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的生物轉化效果明顯優于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2，但蛋白電泳圖比較發現（圖3），在同等誘導表達條件下，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的蛋白表達量明顯少于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK2。因此為提高工程菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1誘導表達NRK1酶的蛋白表達量，從接種量、誘導時間、誘導溫度和誘導劑濃度等角度進行NRK1誘導表達條件的優化。

接種量過大易產生代謝副產物，影響產物合成；接種量過小則會使細胞濃度增殖減緩，進而造成目標產物產量降低。因此，首先從接種量對蛋白表達的影響進行探索，當接種量為3%時，NRK1的蛋白表達量明顯高于其他條件（圖8a）。為了選擇最佳誘導時間，研究了8 個不同誘導時間對蛋白表達的影響，隨著誘導時間的延長，蛋白的表達量逐漸增加，誘導時間22 h與誘導時間24 h的蛋白表達量相當，因此選擇22 h作為最佳的誘導表達時間（圖8b）；由于溫度較高時會使表達蛋白形成包涵體，導致酶活性降低，當誘導溫度為16 ℃時，NRK1蛋白表達量最高（圖8c）；誘導劑IPTG有細胞毒性，過高會造成細胞死亡導致酶表達終止，而IPTG過低則又會導致酶的誘導表達受阻，因此探索了IPTG對NRK1表達的影響，當IPTG終濃度為0.7 mmol/L時，NRK1的蛋白表達量最高（圖8d）。因此，確定E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的最優誘導表達條件為：接種量3%、誘導時間22 h、誘導溫度16 ℃、IPTG 0.7 mmol/L。

圖8 不同誘導條件對誘導效果的影響Fig.8 Influence of different induction conditions on protein expression

2.3.4E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1生物轉化NMN的條件優化

由于E.coli底盤細胞壁上沒有NMN由細胞內向細胞外分泌的外排蛋白，為使細胞內合成的NMN可以高效外排到細胞外，探索了細胞壁通透性處理對促進NMN外排的影響。菌體細胞在反復凍融過程中細胞內部會形成冰晶，導致剩余液體中鹽濃度的增高造成細胞被膜結構的破壞，從而提高細胞膜通透性[12]。因此，在反應前對細胞進行反復凍融處理，NMN細胞外排結果如圖9所示，可以看出，未凍融細胞NMN產量僅為0.79 g/L，與未凍融細胞相比，經反復凍融的細胞NMN產量為5.33 g/L，產率80.19%。因此，在后續合成反應中需要對細胞進行反復凍融處理，使細胞膜通透性增加。

圖9 通透性處理對NMN產量的影響Fig.9 Effect of permeability treatment on NMN yield

為進一步探索單菌E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1合成NMN的最優體系，從單細胞菌體質量濃度、反應時長、反應溫度和底物ATP與NR比例進行探索。由圖10a可知，當菌體質量濃度為100 g/L時，NMN產量明顯高于其他菌體質量濃度，因此選取菌體質量濃度100 g/L為后續實驗的最適菌體質量濃度；圖10b說明，當時長為10 h時，NMN產量最高，選取10 h為合成體系的最適時長；溫度對產物得率的影響如圖10c所示，溫度越高，產量明顯減少，當溫度為18 ℃時，NMN產量最高，因此選取18 ℃為最佳的反應溫度；在確定最佳菌體質量濃度、時間、溫度的基礎上，研究ATP與NR比例對產物合成的影響，如圖10d所示，ATP與NR比例為1∶1.5時（20 mmol/L ATP、30 mmol/L NR），NMN產量最高為5.73 g/L，轉化率為85.78%。因此，單菌合成NMN的最優體系為菌體質量濃度100 g/L、反應時長10 h、反應溫度18 ℃、ATP與NR比例1∶1.5。

圖10 不同因素對NMN產量的影響Fig.10 Influence of culture conditions on NMN yield from E.coli BL21 (DE3)-pET28a-NRK1

2.4 雙菌耦合發酵產NMN體系的建立及優化

2.4.1 雙菌耦合發酵體系的建立

為降低合成NMN的成本，在以NR和ATP為底物，E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1單菌合成NMN優化體系的基礎上，引入ADP到ATP的循環再生菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK，用于實現以NR、ATP和Poly-P為底物，通過雙工程菌株耦合發酵來合成NMN，結果如圖11所示。雙菌株耦合發酵體系中當ATP添加量為12 mmol/L（單菌體系的60%），NMN產量與單菌體系持平為5.7 g/L。隨著ATP的繼續添加，NMN的產量也逐漸增加，最終NMN產量為6.45 g/L。這表明，在發酵體系中添加E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK菌株可以實現ATP的循環再生，不僅減少了外源供應ATP的需求，而且使NMN的產量增加。

2.4.2 雙菌耦合發酵體系的優化

為進一步提高雙菌耦合發酵生成NMN的產量，從最適ATP與NR濃度比、菌體質量濃度比及發酵時間角度對發酵條件進行優化。在耦合發酵體系中，底物ATP與NR初始濃度比對NMN合成影響較大，由圖12a可知，在ATP與NR濃度比為1∶3.5時，NMN的產量最高，因此，選取1∶3.5為耦合發酵的最佳底物濃度比；在此濃度比的基礎上，研究了菌體質量濃度比對產物合成的影響，控制菌株E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1的菌體質量濃度為100 g/L，改變E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的菌體質量濃度，由圖12b發現，當菌體質量濃度比為1∶2時，NMN的產量最高；在最佳底物濃度比與菌體質量濃度比的基礎上，又進一步研究耦合發酵時間對反應體系的影響，從圖12c可以看出，隨著發酵時間的延長，NMN產量逐漸上升，發酵時間為16 h，NMN產量最高為11.81 g/L，隨著時間的繼續增加，NMN產量逐漸趨于平緩下降，因此選取16 h為最佳發酵時間。綜上可得，雙菌株耦合發酵合成NMN最佳生產工藝為ATP與NR濃度比1∶3.5、菌體質量濃度比1∶2、耦合發酵時長16 h。

圖12 不同因素對耦合發酵產NMN的影響Fig.12 Influence of culture conditions on NMN production by coupled fermentation

3 討論

近年來，不僅NMN的生理活性及功能受到了廣泛的研究和關注，NMN的合成工藝也成為了合成生物學領域的研究熱點。目前，NMN雖然可以通過不同途徑、不同原料轉化而成，但其產率和生產成本仍有改善的空間。在生物法合成NMN方面，廖一波等[26]經過同源建模和底物煙酰胺（nicotinamide，NAM）分子對接等方式評估后，選擇在E.coli中過表達紅色稍棲熱菌（Meiothermus ruber）來源的Nampt，以PRPP和NAM為底物進行酶催化反應10 min，NMN產量可達34 mg/L，生產效率約為3 mg/（L·min）；吳旻暉等[27]建立了細胞外酶法合成技術體系：在E.coli系統成功實現了NMN合成途徑酶的分泌表達，但表達所得酶量較低，NMN產量為5.50 μmol/L，且合成NMN所需要的ATP完全依賴于外源ATP添加量，使得成本較高。在本研究中，通過引入基于PPK的ATP再生系統，構建了全細胞雙菌耦合發酵體系，不僅減少了傳統酶催化過程破碎、提取、純化等步驟所需要的成本，而且用更便宜的材料Poly-P將ADP磷酸化為ATP，實現ATP的循環，減少了對外源ATP的需求量，使生產成本大大降低，且雙菌株優化后的NMN發酵產量達11.81 g/L，這是目前耦合發酵法合成NMN的最高產量報道。與2021年日本報道的6.79 g/L高出了73.93%[15]。

本研究構建了基于E.coliBL21（DE3）-pET28a-NRK1、E.coliBL21（DE3）-pET28a-PPK的全細胞雙菌耦合發酵體系，不僅具有即插即用的優點，而且可以根據每個批次全細胞的酶活性不同，針對性地對細胞添加量進行調整，從而實現整個發酵體系的最優，對NMN的高效、低成本合成具有重要意義。目前雙菌耦合發酵體系屬于高密度發酵，與酶法相比，產量仍相對較低，這可能與產物在細胞壁的分泌受阻相關。另外，細胞內NMN的一小部分將被消耗以合成NAD＋用于細菌生長，這對NMN的積累不利[28]。Shoji等[15]發現pnuC轉運蛋白可以有效地將NMN從細胞內轉移到細胞外。因此，在后續完善NMN合成時將從以下3 個方面進行優化：1）從菌株構建角度進行，通過引入產物NMN外排出細胞的“膜蛋白（pnuC）”，構建出產物可以快速外排的“細胞門通道蛋白”工程菌；2）阻斷NMN生成NAD＋的合成通路，實現NMN的積累[29]；3）從發酵工藝優化角度，探索分批發酵和連續流加模式對NMN產量的影響。