襄陽地區高溫大曲真菌群落結構及其風味品質解析

向凡舒，蔡文超，田龍新，劉菊珍，周加平，葉明波，單春會，郭 壯1,,

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市醬香型白酒固態發酵企校聯合創新中心，湖北 襄陽 441053；3.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；4.醬香型白酒固態發酵襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；5.湖北東方明珠酒業有限責任公司，湖北 襄陽 441053）

我國白酒種類眾多，包括醬香、濃香和清香等12 種香型的白酒，不同香型白酒所用酒曲的類型亦有所不同[1]。正所謂“曲乃酒之骨”，酒曲通過提供豐富的微生物及酶系推動了白酒的發酵過程[2]。醬香型白酒作為香味最豐富的白酒，其不僅釀造工藝復雜，所使用的高溫大曲亦較為特殊[3]。相較于其他酒曲，高溫大曲培菌階段的溫度最高，可達60～70 ℃[4]。較高的發酵溫度可能使高溫大曲中富集較為特殊的微生物群，又或使微生物在極端環境下的代謝產物較為特殊，最終賦予了高溫大曲較為獨特的風味品質[5]。此外，高溫大曲在白酒釀造過程中的投入量較大，與糧食的投入比例相當，因而它可能也為醬香型白酒提供了香味基底，其自身的風味品質不容忽視[4]。然而，由于受到排列方式和發酵熱的影響，曲房溫度會在空間尺度上有一定的波動，這使得排列在不同位置的高溫大曲其微生物類群和品質在空間尺度上亦會出現波動，外觀上通常出現白色、黃色和黑色3 種顏色[4]。白色高溫大曲通常產生于靠門窗和墻壁等溫度相對較低的位置，黃色高溫大曲通常均勻分布在大曲堆中，而黑色高溫大曲通常產生于溫度相對較高的大曲堆中部[6]。目前，已有許多研究人員從理化性質、微生物類群及感官特性等方面對不同顏色高溫大曲展開了研究，結果表明3 種顏色高溫大曲在以上方面均存在顯著差異[7-9]。此外，不同企業生產的高溫大曲微生物群落結構亦存在較大差異。例如貴州茅臺高溫大曲中的微生物主要以芽孢桿菌屬（Bacillus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為主，四川古藺郎酒高溫大曲中卻不含有Bacillus，安徽古井貢酒的高溫大曲中真菌主要以嗜熱真菌屬（Thermomyces）為主[10-12]。上述研究結果表明溫度差異和生產工藝的不同可能均是影響高溫大曲微生物群落結構的因素，而以往研究大多只關注到了其中的一個方面。此外，作為醬香型白酒的新產區之一，湖北襄陽地區生產的高溫大曲在上述方面的研究還尚少。

以MiSeq高通量測序為代表的第二代測序技術，在實現快速全面分析和降低實驗成本方面具有顯著優勢，目前也作為解析釀酒微生物類群的常用技術手段之一。例如使用該技術對低溫大曲微生物類群進行解析時，Cai Wenchao等[13]發現紅心曲的細菌豐度和多樣性最高，而清茬曲真菌豐度和多樣性較高；Huang Zirui等[14]使用該技術解析了不同種類的米酒曲，結果發現紅曲和白曲中的細菌和真菌類群存在顯著不同。由此可見，MiSeq高通量測序技術在解析不同分組樣品間微生物類群差異方面亦合適。電子鼻是利用電子傳感器識別食物香氣的設備，它能夠識別芳香類物質、烷烴類、萜類和有機硫化物等揮發性香氣成分大類，不需要分離和識別具體的揮發性化合物類別[15]。因而該技術具有操作簡單、檢測快速和無需特殊的樣品前處理等優點，是替代耗時且昂貴的色譜分析方法的合適方案，目前已廣泛應用于食品、飲料和醫藥保健領域，例如Viejo等[16-17]使用該技術有效識別了不同咖啡和啤酒的香氣特征和強度。

本研究首先采用MiSeq高通量測序技術與電子鼻技術對比分析襄陽地區A企業生產的3 種顏色高溫大曲真菌類群及其揮發性香氣成分；然后從MG-RAST數據庫中下載B企業高溫大曲的真菌序列數據，并對兩個企業生產的不同顏色高溫大曲真菌群落結構進行合并分析；最后采用純培養法對其中的酵母菌菌株進行分離鑒定。本研究旨在為當地醬香型白酒企業生產的高溫大曲風味品質提供數字化評價，為其配曲工藝的提升以及智能化制曲應用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）合成培養基 中國醫藥集團有限公司；Neasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；TaqDNA聚合酶和T載，正/反向引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和引物26S1/26S2（引物26S1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；引物26S2：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）上海桑尼生物科技有限公司；Illumina MiSeq測序試劑盒v3美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Vetiri聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）梯度基因擴增儀 美國AB公司；MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司；R930機架式服務器美國DELL公司；PEN3電子鼻（配備8 個傳感器）德國Airsense公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集

本研究于2022 年8 月從湖北省襄陽市（E 110°45′～113°06′，N 31°13′～32°37′）生產醬香型白酒的A企業采集到高溫大曲樣品30 份，其中白色、黃色和黑色高溫大曲（以下分別簡稱為白曲、黃曲和黑曲）各10 份，分別編號為W1～10、Y1～10和B1～10。所有樣本均由A企業同一批次生產，且儲存于同一庫房中。采樣時首先根據大曲堆的高度將大曲堆均分成上中下3 層，然后每種顏色高溫大曲從上層和下層的不同位置分別隨機選取3 塊，從中間層的不同位置隨機選取4 塊[6]。將采集到的大曲塊裝入無菌自封袋后在常溫下運送回實驗室，并在實驗室條件下將曲塊打碎至粉末狀后置于-80 ℃，以便用于后續提取宏基因組DNA、電子鼻上機檢測和酵母菌菌株分離鑒定。此前，已有研究人員對襄陽地區B企業生產的高溫大曲微生物類群展開了分析[9]。因而本研究從MG-RAST數據庫中下載了B企業高溫大曲的真菌序列數據，以探討不同企業生產的高溫大曲真菌群落結構差異。兩個企業在生產高溫大曲時使用的曲模規格、翻曲時間節點和培養溫度等工藝參數均有所差異（圖1）。

圖1 高溫大曲制曲流程圖Fig.1 Flow chart of high-temperature Daqu production

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴增及測序

高溫大曲樣品的宏基因組參照DNA試劑盒中提供的方法進行提取，參照姚衡斌等[18]的方法使用引物ITS3F/ITS4R（含有核苷酸標簽）對真菌內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）2區進行PCR擴增并純化PCR產物，純化后的PCR產物寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司完成高通量測序。

1.3.3 生物信息學分析

本研究通過高通量測序獲得的序列數據均基于QIIME（v 1.9.0）平臺完成生物信息學分析。首先使用PyNAST軟件根據核苷酸標簽信息將下機數據進行拆分和歸并至各樣品，繼而使用FLASH（v 1.2.7）軟件對雙端序列進行拼接[19]，參照Caporaso等[20]提出的標準對序列進行質控，得到的高質量序列依據97%序列相似度進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）的構建[21]，并采用Chimera Slayer軟件去除嵌合體OTU[22]，基于Unite（v 7.2）數據庫完成真菌物種信息注釋[23]。此外，真菌發現物種數和Shannon指數等α多樣性指數以及基于非加權和加權OTU的UniFrac距離主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）均依靠QIIME（v 1.9.0）平臺完成計算，最后使用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）Effect Size（LEfSe）甄別不同企業生產的高溫大曲真菌標志物。

1.3.4 基于電子鼻技術高溫大曲氣味指標分析

每份樣品均稱取8.0 g于電子鼻檢測頂空瓶中，裝樣的頂空瓶于45 ℃條件下水浴10 min后進行頂空進樣，每份樣品均設置3 組平行實驗。進樣條件參照Huang Minzheng等[24]的方法進行設置，選取49、50 s和51 s傳感器響應值的平均值作為后續分析數據。

1.3.5 酵母菌菌株的分離與鑒定

稱取10.0 g高溫大曲粉加入至90 mL無菌生理鹽水（內含10～15 顆玻璃珠）中，在28 ℃搖床中振蕩30 min后進行10 倍系列梯度稀釋，選擇10-2～10-5梯度稀釋液涂布至PDA平板中，在28 ℃條件下培養3～5 d。培養結束后挑取平板上的單菌落進行純化，已純化的菌株采用甘油保藏法將其保藏于-80 ℃。參照徐文歡等[25]的方法提取基因組DNA并對真菌26S rRNA進行PCR擴增和產物純化。純化后的PCR產物被送至上海桑尼生物科技有限公司完成測序，測序返回的序列在NCBI網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對。

1.4 數據處理與分析

采用R軟件（v 4.1.2）繪制小提琴圖和PCoA圖分別對高溫大曲真菌α多樣性和β多樣性數據進行可視化；采用R軟件（v 4.1.2）繪制氣泡圖對優勢真菌類群數據進行可視化；使用Origin 2021軟件繪制多因子箱型圖對電子鼻檢測數據進行可視化，同時采用SAS（v 8）軟件計算優勢真菌屬與氣味指標之間的相關性，并采用R軟件（v 4.1.2）繪制相關性熱圖；利用在線作圖網站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）繪制LEfSe圖；使用R軟件（v 4.1.2）繪制upset圖和瀑布圖對各樣品中的OTU數量進行統計。使用MAGE7軟件構建分離株系統發育樹；使用Past3軟件中的Mann-Whitney和Kruskal-Wallis檢驗法評估不同組數據間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 3 種顏色高溫大曲真菌群落結構的比較分析

經高通量測序共得到1 952 058 條序列，過濾掉低質量和嵌合體序列共33 041 條后，余下1 919 017 條有效序列，有效序列按97%序列相似度歸并得到8 689 個OTU，平均每個樣品含有63 595 條有效序列和2 150 個OTU。通過計算α多樣性指數發現，白曲、黃曲和黑曲的平均發現物種數分別為1 824、1 944和1 719，平均Shannon指數分別為5.67、5.40和4.94（圖2a、b）。經Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney檢驗發現，3 種顏色高溫大曲間亦或是任意兩種顏色高溫大曲間的發現物種數和Shannon指數均不存在顯著差異（P＞0.05），這表明3 種顏色高溫大曲間的真菌豐富度和多樣性差異均不顯著。基于非加權OTU的UniFrac距離PCoA顯示3 種顏色高溫大曲的95%置信區間均有重疊，且白曲和黃曲的95%置信區間完全重疊（圖2c）。此外，在基于加權OTU的UniFrac距離PCoA中，3 種顏色高溫大曲的95%置信區間亦出現較多重疊區域，且白曲和黑曲的95%置信區間完全重疊（圖2d），這表明不管考慮物種豐度與否，3 種顏色高溫大曲間真菌群落結構均無明顯差異。由此可見，3 種顏色高溫大曲的真菌α多樣性和β多樣性均較為相似。

圖2 不同顏色高溫大曲真菌發現物種數（a）、Shannon指數（b）、非加權OTU的UniFrac距離（c）和加權OTU的UniFrac距離（d）PCoAFig.2 Observed species index (a),Shannon index (b) and PCoA plots of UniFrac distance based on unweighted OTU (c) and weighted OTU (d) of different colored high-temperature Daqu

2.2 3 種顏色高溫大曲的真菌類群解析

測序獲得的所有有效序列經Unite數據庫比對后共鑒定到6 個門、14 個綱、26 個目、44 個科和71 個屬，其中平均相對含量＞1.0%的門和屬被定義為優勢門和屬。本研究進一步從優勢門和屬水平上分別解析了3 種顏色高溫大曲中的真菌類群。所有高溫大曲樣品中共有2 個優勢門，分別為子囊菌門（Ascomycota，96.67%）和毛霉菌門（Mucoromycota，2.55%）（圖3a）。經Kruskal-Wallis檢驗發現，3 種顏色高溫大曲在2 個優勢門的相對含量上均存在顯著差異，主要表現為黃曲和黑曲中的Ascomycota相對含量顯著高于白曲，而Mucoromycota相對含量則相反（P＜0.05）。所有樣品共含有7 個優勢屬，分別為隸屬于Ascomycota的嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces，36.50%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，27.15%）、酵母菌屬（Saccharomycopsis，9.23%）和雙足囊菌屬（Dipodascus，1.19%）；隸屬于Mucoromycota的曲霉屬（Aspergillus，9.36%）、根霉菌屬（Rhizopus，1.44%）和毛霉菌屬（Rhizomucor，1.03%）（圖3b）。經Kruskal-Wallis檢驗發現，3 種顏色高溫大曲在Saccharomycopsis、Rhizopus、Dipodascus和Rhizomucor的相對含量上存在高度顯著差異（P＜0.001），且這些優勢屬在黑曲中的相對含量顯著偏低（P＜0.05）。由此可見，盡管3 種顏色高溫大曲的真菌群落結構較為相似，但它們在各個優勢門和屬的相對含量分布上仍表現出了較大差異。

圖3 高溫大曲優勢真菌門（a）和真菌屬（b）相對含量分析Fig.3 Relative abundance of the dominant fungal phyla (a) and genera (b) in high-temperature Daqu

2.3 基于電子鼻技術高溫大曲氣味品質解析

本研究進一步利用電子鼻傳感器W1C（對芳香類物質靈敏）、W3C（對芳香類物質靈敏）、W6S（對氫氣有選擇性）、W5C（對芳香類物質靈敏）、W3S（對烷烴類物質靈敏）、W5S（對氫氧化物靈敏）、W1W（對有機硫化物、萜類物質靈敏）和W2S（對乙醇靈敏）對其中的揮發性風味物質進行檢測。結果顯示傳感器W1W對高溫大曲的響應值最高，傳感器W5S、W2S、W3S和W6S次之，而傳感器W5C、W3C和W1C響應值均較低（圖4a、b）。這表明A企業生產的高溫大曲中有機硫化物、萜類物質、氫氧化物、乙醇和烷烴類物質含量相對較高。此外，除了傳感器W3S以外，其他傳感器對3 種顏色高溫大曲中的響應值間均存在顯著差異（P＜0.05）（圖4a、b）。值得注意的是，對芳香類物質靈敏的WC傳感器（W5C、W3C和W1C）對黃曲的響應值均顯著高于黑曲（P＜0.05），而傳感器W1W、W5S和W2S則表現出相反的趨勢。上述結果表明，相較于黑曲，黃曲中的揮發性芳香類物質含量顯著偏高，而有機硫化物、萜類物質、氫氧化物和乙醇等含量顯著偏低（P＜0.05）。此外，絕大多數傳感器對白曲的響應值大小均位于黃曲和黑曲之間，這表明黃曲的風味品質可能相對較優，白曲次之。本研究進一步計算了優勢屬與電子鼻傳感器響應值之間的相關性（圖4c）。結果顯示，Rhizomucor與傳感器W3C 響應值之間存在顯著負相關關系（R=-0.409，P＜0.05），而其他優勢屬與傳感器響應值之間均未表現出顯著相關關系。由此可見，高溫大曲中的優勢真菌與高溫大曲氣味指標間的關聯性較弱。

圖4 3 種顏色高溫大曲的氣味指標（a、b）及其與優勢真菌屬間的相關性（c）分析Fig.4 Odor indicators (a) and their correlation with dominant fungal genera (b) in three colored high-temperature Daqu

2.4 不同企業高溫大曲真菌群落結構比較分析

本研究從MG-RAST數據庫中下載了襄陽地區B企業生產的30 份高溫大曲（白色、黃色和黑色高溫大曲各10 份）樣品序列，進一步探究了不同企業生產的高溫大曲真菌群落結構差異。結果顯示，A企業和B企業高溫大曲真菌的平均發現物種數分別為1 829和1 235，平均Shannon指數分別為5.44和4.76（圖5a、b）。經Mann-Whitney檢驗發現A企業生產的高溫大曲其平均發現物種數高度顯著高于B企業（P＜0.001），而Shannon指數極顯著高于B企業（P＜0.01），這表明A企業高溫大曲其真菌豐富度和多樣性均顯著偏高（P＜0.05）?；诜羌訖郞TU的UniFrac距離PCoA亦顯示出了A企業和B企業高溫大曲樣品點在空間結構上較明顯的分離趨勢。A企業高溫大曲樣品主要分布在2、4象限對角線的上半部分，而B企業高溫大曲樣品主要分布在2、4象限對角線的下半部分，且兩個企業高溫大曲樣品的95%置信區間重疊區域較小，這表明不同企業生產的高溫大曲真菌群落結構間差異較大（圖5c）。此外，本研究進一步將不同顏色和不同企業生產兩個因素同時考慮在內，采用馬氏距離對兩個企業生產的3 種顏色高溫大曲展開了聚類分析（圖5d）。結果顯示，來源于同一企業的3 種顏色高溫大曲距離更近，且B企業的樣品均聚在了同一大分支上。此外，兩個企業樣品分支間的差異高度顯著（P＜0.001），這表明不同企業生產工藝上的差別對高溫大曲真菌群落結構產生的影響較大。

圖5 不同企業高溫大曲真菌發現物種數（a）、Shannon指數（b）、基于非加權OTU的UniFrac距離PCoA（c）和馬氏距離聚類分析（d）Fig.5 Observed species index (a),Shannon index (b),PCoA plot of UniFrac distance based on unweighted OTU (c),cluster analysis based on Euclidean distance (d) of fungal communities in high-temperature Daqu produced by different companies

本研究進一步通過LEfSe甄別了兩個企業高溫大曲各自的生物標志物。A企業高溫大曲中的真菌標志物主要隸屬于酵母菌綱（Saccharomycetes）和毛霉菌綱（Mucoromycetes）這兩個分支，而B企業高溫大曲中的真菌標志物主要隸屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）分支（圖6a）。當LDA得分大于3.5時，A企業高溫大曲中含有7 個生物標志物，在屬水平上的生物標志物為Saccharomycopsis；B企業高溫大曲中含有5 個生物標志物，在屬水平上的生物標志物為Aspergillus（圖6b）?？梢?，相較于B企業，A企業高溫大曲中Saccharomycopsis豐度較高，而Aspergillus豐度較低。

圖6 不同企業高溫大曲基于LEfSe分析的微生物群支系圖（a）和LDA值分布柱狀圖（b）Fig.6 LEfSe analysis of fungal communities in high-temperature Daqu produced by different companies: clade diagram (a) and LDA value distribution (b)

2.5 基于OTU水平不同企業高溫大曲核心真菌類群解析

本研究進一步從OTU水平上對兩個企業高溫大曲真菌群落結構進行了解析，并將僅出現在一個企業高溫大曲中的OTU定義為該企業高溫大曲中的特殊OTU，而將出現在每一份高溫大曲（即60 份樣品）中的OTU定義為核心OTU。OTU統計結果顯示，A企業高溫大曲中含有679 個獨特OTU，B企業高溫大曲中僅含有178 個獨特OTU，而有2 001 個OTU在兩個企業生產的高溫大曲中均有出現，其中包含2 個核心OTU，即OTU 5907和OTU 10836，它們分別被鑒定為Thermomyces（23.53%）和Aspergillus（6.05%），占總OTU比例的29.58%（圖7）。可見核心真菌類群主要由Thermomyces和Aspergillus組成。

圖7 基于OTU水平不同企業高溫大曲的核心真菌類群解析Fig.7 Analysis of core fungal taxa in high-temperature Daqu from different companies based on OTU level

2.6 基于純培養技術酵母菌的分離鑒定

酵母菌通常是酒曲中極為重要的一類能夠發揮糖化作用和產酒精作用的微生物類群[26]，因而本研究采用純培養法對其中的可培養酵母菌進行了分離鑒定，以豐富大曲來源的酵母菌菌株，為后續篩選具有優良發酵特性的酵母菌菌株奠定基礎。本研究共分離出4 株酵母菌分離株，其菌落形態均為白色，呈凸起狀，且表面干燥；細胞形態呈不規則橢圓形或棒球形（圖8a、b）。由系統發育樹可知，4 株分離株與扣囊覆膜孢酵母（S.fibuligeraATCC36309）聚為一支（圖8c），且它們的序列相似度均大于99.9%，因而分離株均被鑒定為S.fibuligera。

圖8 酵母菌分離株的菌落形態（a）、細胞形態（b）及其系統發育樹（c）Fig.8 Colony morphology (a),cell morphology (b) and phylogenetic tree (c) of yeast isolates

3 討論與結論

本研究采用MiSeq高通量測序技術對湖北襄陽醬香型白酒A企業生產的3 種顏色高溫大曲的真菌群落結構進行了比較分析。結果顯示，3 種顏色高溫大曲中真菌群落的豐富度和多樣性均不存在顯著差異（P＞0.05），β多樣性分析結果也顯示3 種顏色高溫大曲在空間排布上均有較大程度的重疊。這表明發酵過程中由空間異質性所引起的溫度差異對高溫大曲真菌群落結構影響較小，前人對該地區B企業高溫大曲的研究結果與本研究結果相吻合[9]。然而，3 種顏色高溫大曲的細菌群落結構對此所表現出的結果與真菌截然不同，它們之間往往存在顯著差異[6]。值得注意的是，此前Zhou Qingfeng等[27]對低溫大曲（頂溫在40～50 ℃之間）、中溫大曲（頂溫在50～60 ℃之間）和高溫大曲（頂溫在60～70 ℃之間）的真菌群落結構進行了比較分析，結果表明上述3 種大曲的真菌群落結構之間存在顯著差異。此外，在其他已有研究中還能發現Thermomyces含量在低溫、中溫和高溫大曲中含量依次升高[13,28]，這表明大曲中的真菌類群亦會受到發酵溫度的影響，只是對溫度波動的敏感度低于細菌。

物種注釋結果顯示Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus和Saccharomycopsis等為主要的真菌類群，其中Saccharomycopsis中的部分菌種在釀酒領域的應用已十分廣泛，例如釀酒酵母（S.cerevisiae）是常見的商業釀酒菌種[26,29]。Thermomyces和Thermoascus都屬于嗜熱菌群，它們在高溫條件下仍具有優異的產酶特性，是高溫大曲中不可或缺的微生物類群[30-32]。此外，Aspergillus中的A.niger不僅能夠產酶，還能產檸檬酸，可在一定程度上為大曲增添風味物質[33-34]。通過電子鼻檢測發現，A企業高溫大曲中的揮發性有機硫化物、萜類、乙醇和烷烴類物質檢測值相對較高，芳香類物質檢測值較低。有趣的是，3個WC傳感器（對芳香類物質敏感）對黃曲的響應值均極顯著高于黑曲（P＜0.01），而W1W（對有機硫化物、萜類物質敏感）等其他傳感器對黃曲的響應值則顯著低于黑曲（P＜0.05）。揮發性有機硫化物具有低檢測閾值和強烈的感官特性，是酒精飲料中的一類重要香氣物質，但濃度較高時會產生類似洋蔥和熟白菜等令人不愉快的香氣[9,35]。這說明黃曲的風味品質相對較優，在釀造醬香型白酒時可適當提高它在3 種顏色高溫大曲中的投入比例。相關性分析結果顯示僅有Rhizomucor與傳感器W3C響應值間存在顯著負相關關系（P＜0.05），其他優勢真菌屬與氣味指標間均不存在顯著相關關系。同樣采用電子傳感技術，Cai Wenchao等[9]針對B企業高溫大曲的研究結果顯示對芳香類物質靈敏的傳感器在黑曲中的響應值最高，且優勢真菌屬與高溫大曲氣味指標間的相關性密切，這與本研究結果有明顯不同。不過，Zhu Qi等[36]在甄別貴州地區高溫大曲核心功能菌群時的結果與本研究較為相似，其研究結果顯示細菌是產生揮發性香氣成分的主要菌群，真菌與香氣成分含量間存在的相關關系較少，且大多表現為負相關關系。這些研究結果的差異體現出不同企業高溫大曲的微生物類群與其風味品質間的相關關系可能亦有所不同。此外，制曲過程中的高溫發酵會促使大曲發生美拉德反應，其產物亦可能是高溫大曲風味的主要來源之一[8]。可見，不同來源高溫大曲中的微生物類群以及發酵過程中的美拉德反應對大曲風味品質形成所產生的貢獻有所不同，這或許是不同企業生產的醬香型白酒風味特征各異的原因之一。

前人研究與本研究結果表明發酵過程中的溫度波動對高溫大曲真菌群落結構的影響較小，這與細菌群落結構對此呈現出的結果恰恰相反[6,9]。因而本研究進一步對同一地區不同企業生產的高溫大曲真菌群落結構差異進行了解析，即探討生產工藝上的差別是否會對真菌群落結構產生較大影響。α多樣性分析結果顯示，不同企業生產的高溫大曲其真菌在豐富度和多樣性上均存在極顯著差異（P＜0.01），且β多樣性分析結果與α多樣性結果相吻合。聚類分析顯示同一企業生產的3 種顏色高溫大曲間距離更近，這表明生產工藝的差異會對高溫大曲真菌群落結構產生較大影響。LEfSe結果顯示A企業高溫大曲中的生物標志物主要為Saccharomycopsis；B企業高溫大曲中的生物標志物主要為Aspergillus。核心OTU的統計結果顯示不同企業生產的高溫大曲中仍含有近三分之一的核心菌群，它們由Thermomyces和Aspergillus組成。此外，Zhu Min等[37]在探討環境因素對中高溫大曲發酵過程中微生物群落變化的影響時發現，環境濕度、CO2和水分對微生物群落的影響是顯著的，這表明在發酵過程中除溫度以外的環境因素亦會對真菌群落結構產生較大影響。

本研究通過純培養法從A企業生產的高溫大曲中僅分離到4 株酵母菌菌株，它們均被鑒定為S.fibuligera。S.fibuliger具有高效分泌α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和酸性蛋白酶等特性，是谷物發酵中重要的功能微生物[38]。然而值得注意的是，本研究并未通過純培養法分離得到較豐富的酵母菌菌種，出現這一現象的原因可能是較高的發酵溫度或是樣品經過低溫貯存后使得大多數酵母菌菌種失活或是活性較弱，而富集酵母菌常用的PDA培養基成分較為單一，并不能滿足菌株恢復活性所需的全部營養組分。此前，其他研究人員亦關注到了純培養法的不足之處，并開發出了培養組學技術以更多地從樣品中獲得微生物資源[40]。例如，Lagier等[39]通過培養組學技術使從人類腸道中分離出的物種數量增加了一倍。此外，Yao Su等[40-41]從高溫大曲中先后發現了兩個新物種，它們分別被命名為大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）和大曲巖石芽孢桿菌（Scopulibacillus daqui）。因而，高溫大曲中目前仍可能含有大量未知物種，采用培養組學技術挖掘出更多的大曲源物種是極為必要的。綜上所述，襄陽地區A企業生產的3 種顏色高溫大曲在部分優勢真菌類群含量和風味特征上存在顯著差異，且該地區A企業和B企業生產的高溫大曲真菌群落結構間亦存在顯著差異。由此可見，襄陽地區高溫大曲中的真菌在發酵過程中受到溫度波動的影響較小，而受到生產工藝的影響較大。