基于HS-SPME-GC-MS分析不同基酒裝量對美樂葡萄蒸餾酒揮發性成分的影響

郭亞蕓，邵學東，張正文，李 勃，薛 偉，史紅梅,

（1.山東省葡萄研究院，山東 濟南 250100；2.君頂酒莊有限公司，山東 蓬萊 265607；3.煙臺誠達蒸餾設備有限公司，山東 煙臺 264000）

葡萄蒸餾酒是以葡萄為原料，經發酵、蒸餾、調整勾兌而成的飲料酒[1]。蒸餾酒不經橡木桶陳釀，因此，很好的保留了葡萄的品種香和發酵香，且生產周期遠低于白蘭地產品[2]，因具有純正優雅的果香，清爽舒適的口感，與高度糧食白酒相比，辛辣刺激感輕微，深受消費者喜愛。對于釀酒原料的選擇，應該選擇具有弱香或者中性香的釀酒葡萄[3-4]。“美樂”作為世界栽種面積第2大的釀酒葡萄品種，在膠東半島產區廣泛種植，但其品種特性在該產區沒有較好的表現，酒體偏瘦弱，特征香氣不突出。因此，本研究試圖以膠東半島產區“美樂”為釀酒原料，嘗試開發具有典型特性的葡萄蒸餾酒產品。

葡萄蒸餾酒是一個由水、乙醇和微量揮發性成分組成的一個相當復雜的混合體系[5]，而微量的揮發性成分決定著葡萄蒸餾酒的獨特風味，也是決定葡萄蒸餾酒感官和質量參數的重要指標[5-6]，在蒸餾酒的風格與質量方面起著重要作用。然而，影響蒸餾酒揮發性成分的因素很多[7]，比如葡萄品種及成熟度[8-9]、發酵條件[10]、蒸餾工藝[11-13]等。其中，蒸餾工藝對蒸餾酒香氣起著至關重要的作用，蒸餾工藝不當或設備有缺陷，葡萄蒸餾酒會喪失典型性，產生缺陷，從而降低葡萄蒸餾酒品質[14]。中鏈脂肪酸乙酯是含6～12 個碳原子的脂肪酸乙酯，如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯等[15-16]。中鏈脂肪酸乙酯作為酵母次生代謝產物，具有果香，甜香和濃郁的發酵香，對酒體呈香有非常重要的貢獻[17]。此外，中鏈脂肪酸乙酯，這類獨特的芳香物質，可以幫助減輕飲酒者的壓力，給人一種愉悅感[18]。相比于其他酵母源香氣，中鏈脂肪酸乙酯具有較低的閾值[19]，它們濃度的微小變化也會強烈影響其最終風味和口感[17]。因此，考察酒身中鏈脂肪酸乙酯的含量和香氣活性值（odor activity values，OAV）對蒸餾酒新產品的開發具有重要意義。

薛氏壺式蒸餾器[20]由煙臺誠達蒸餾設備有限公司生產的專利產品，近幾年在葡萄和其他水果蒸餾酒的生產企業里得到廣泛的應用。該設備在構造上借鑒了夏朗德壺式蒸餾器和阿爾馬涅克蒸餾器的優點，創造性地采用多蒸餾釜，熱能回收，多管路協同的蒸餾方式，即先將其中一釜加熱，形成蒸發及回流過程，產生的酒頭由酒頭出酒管排出，之后的酒氣經酒身出酒管通過預熱器，對葡萄酒基酒進行預熱的同時自身冷凝，得到原葡萄蒸餾酒。酒尾直接通過酒尾管路串入下一個蒸餾釜，以此實現多釜間的間歇性蒸餾轉換，進行連續一次蒸餾。薛氏雙釜蒸餾設備的蒸餾效率是傳統夏朗德壺式蒸餾設備的3～4 倍，冷卻水能耗節省約70%，真正實現了低耗、高效蒸餾[14]。酒身相當于最終的商業產品，是餾分的重要部分。蒸餾釜基酒裝量是蒸餾前需要考慮的一個必要的蒸餾酒工藝參數，基酒裝量不同，可以引起蒸餾酒揮發性成分的不同，并且影響蒸餾效率和能耗，傳統壺式蒸餾的原料裝量為鍋容的2/3～4/5[14,21-22]，目前，國內外蒸餾酒方面的研究還鮮見薛氏蒸餾基酒裝量對酒身揮發性成分影響的報道。因此，本研究考察薛氏蒸餾的原料裝量對酒身揮發性成分的影響，進而為美樂蒸餾酒產品的開發提供理論依據。

本研究采用單釜實際體積330 L的薛氏雙釜蒸餾器對美樂葡萄酒進行蒸餾，頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用（headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）技術對基酒裝量分別為150、200、250 L的美樂葡萄蒸餾酒酒身（簡稱酒身）的揮發性成分進行分析，并結合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）兩種統計學方法對3 種裝量的酒身揮發性物質進行分析。以期獲得美樂葡萄蒸餾酒的最佳蒸餾工藝條件，并為今后深入研究美樂葡萄蒸餾酒品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄：美樂，栽種時間2003年，砧木SO4，品系M181，氣候條件為受海洋影響的溫帶季風大陸性氣候，土壤條件為沙質棕壤土。

NaCl（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；標準品：己酸丁酯（內標）、4-甲基-2-戊醇（內標）、2-辛醇（內標）、叔戊醇（內標）、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸異戊酯、正構烷烴（C7～C30）美國Sigma-Aldrich公司；標準品：十二酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯 中國上海源葉生物科技有限公司；超純水由Millipore-Q超純水系統制得。

1.2 儀器與設備

QP2010 ULTRA氣相色譜-質譜聯用儀及工作站（配AOC-6000多功能自動進樣器）日本Shimadzu公司；80 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭 瑞士CTC Analytics公司；HP-INNOWax毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890B 氣相色譜儀（配CPWA X-57CB capillary column（50 m×0.25 mm，0.2 μm）毛細管柱）美國Agilent公司；CD-GC300 L薛氏雙釜蒸餾器（主體設備包括：蒸餾釜二臺，基酒介質熱能交換器一臺，二次水冷卻塔一臺，整體操作平臺車一套。蒸餾單釜體積330 L，電加熱內加裝3 根各5 kW 380 V電加熱管、蒸汽紫銅盤管各一套。頂端配回流提純球及鵝頸管，設備整體長2 m、寬900 m、高度2 m）。

1.3 方法

1.3.1 美樂葡萄酒釀造工藝

葡萄采收→原料篩選→除梗破碎→氣囊壓榨取汁→清汁入罐→接種酵母菌→控溫發酵→監測溫度和密度→發酵結束→自然澄清。

1.3.2 美樂葡萄酒蒸餾工藝

澄清后的美樂葡萄酒采用薛氏雙釜蒸餾器（標為A、B釜）進行蒸餾，基酒裝量分別為150、200、250 L，蒸餾時蒸汽流量為20 L/h。首先加熱A釜，計為第1釜，掐去占總乙醇體積分數1.5%的酒頭，繼續蒸餾，當餾出物的乙醇體積分數降到55%時，中餾分蒸餾結束；低度酒液通過酒氣管進入B釜基酒內繼續蒸餾，掐去占總乙醇體積分數1.5%的酒頭，當餾出物的乙醇體積分數降到55%時，中餾分蒸餾結束，計為第2釜；低度酒液通過酒氣管進入A釜基酒內繼續蒸餾，計為第3釜，繼續蒸餾。以此A、B釜循環蒸餾至第5釜，當餾出液乙醇體積分數降至55%以下時計為酒尾，餾出液乙醇體積分數降至1.0%時蒸餾結束。將所得蒸餾酒密封后，于常溫下儲藏，用于后續的分析檢測。

1.3.3 美樂葡萄酒理化指標的測定

總糖、總酸、揮發酸、乙醇體積分數等常規理化指標參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；pH值用pH計直接測定。每個樣品做3 個平行實驗。

1.3.4 美樂葡萄蒸餾酒甲醇的測定

蒸餾過程中，酒身甲醇含量的動態監測按照GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》要求的內標毛細管柱定量分析。取酒身樣品10 mL于試管中，加入0.1 mL叔戊醇內標溶液，混勻，1.0 μL直接進樣，進樣口溫度：250 ℃，分流比（20∶1，V/V），載氣流量：1.0 mL/min，FID檢測器溫度：250 ℃，柱溫采用程序升溫：起始柱溫40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至130 ℃，最后，以20 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min。每個樣品做3 個平行實驗。

1.3.5 美樂蒸餾酒揮發性組分的測定

酒身揮發性成分的測定采用HS-SPME-GC-MS法，取6 mL稀釋至乙醇體積分數10%的酒樣加入到20 mL頂空瓶中，同時加入1.5 g NaCl、10 μL己酸丁酯（質量濃度0.251 4 g/L）、10 μL 2-辛醇（質量濃度0.105 0 g/L）、10 μL 4-甲基-2-戊醇（質量濃度1.020 0 g/L）3 種內標。用螺紋瓶蓋封閉，放入自動進樣器托盤，振搖器轉速為450 r/min，50 ℃平衡10 min，通過隔墊插入萃取頭，萃取30 min，插入GC-MS進樣口解吸10 min，進行GC-MS分析。每個樣品做3 個平行實驗。GC條件：高純氦氣，分流進樣（5∶1），進樣口溫度250 ℃，柱溫采用程序升溫：起始柱溫45 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至130 ℃，最后，以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，恒流模式，流量1 mL/min。MS條件：色譜-質譜接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，電離模式為電子電離源（electron ionization，EI），轟擊能量70 eV，全掃描模式，質量數范圍m/z30～500。

利用質譜數據庫NIST 17和NIST 17S進行相似度檢索，通過計算保留指數（retention index，RI），并參考相關文獻報道的RI進行綜合定性酒樣中揮發性成分。對有標準品的10 種揮發性化合物，通過在體積分數10%乙醇溶液中稀釋5 級得到標準溶液，通過繪制目標香氣化合物的內標標準曲線進行定量分析（表1）。其余無標準品的揮發性化合物通過內標4-甲基-2-戊醇進行半定量分析，計算方式如下：

表1 HS-SPME-GC-MS 法揮發性化合物的標準曲線Table 1 Standard curves for volatile compounds determined by HS-SPME-GC-MS

1.4 統計學分析

本研究使用WPS軟件，對不同裝量的葡萄蒸餾酒樣品中揮發性組分進行T檢驗（P＜0.05）分析，使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），使用SIMCA 14.1軟件進行PCA和OPLS-DA，其余圖形使用Graph Pad Prism 9.4.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 美樂葡萄酒理化指標

測得葡萄酒總糖質量濃度1.6 g/L，總酸質量濃度6.2 g/L，pH值為3.12，揮發酸質量濃度0.29 g/L，乙醇體積分數13.56%。

2.2 不同基酒裝量酒身中甲醇含量分析

甲醇在人體內氧化為甲醛、甲酸，具有很強的毒性，尤其對視神經的毒性作用最大[23]。前人的研究發現，色譜法檢測蒸餾酒中甲醇時，內標毛細管柱法優于外標填充柱法[24]，因此，本研究在檢測甲醇時，按照GB 5009.266—2016《食品中甲醇的測定》提供的內標毛細管柱法檢測。

本研究考察了蒸餾工藝中150、200 L和250 L 3 個基酒的不同裝量，每個裝量條件下第1～5釜酒身甲醇的含量，結果顯示，所有酒身樣品中甲醇質量濃度在（177.35±0.49）～（198.06±1.16）mg/L之間，遠低于國標規定的2.00 g/L（以無水乙醇計）[1]，符合國家標準要求。

2.3 不同基酒裝量酒身揮發性物質分析

為研究不同基酒裝量對蒸餾酒酒身揮發性物質的影響，本研究利用HS-SPME-GC-MS法對3 種不同基酒裝量蒸餾酒酒身的揮發性物質進行定性和定量分析。由表2可知，3 種基酒裝量酒身揮發性物質共檢測出74 種。基酒裝量為150 L時的酒身共檢測出67 種，總質量濃度（127 042.12±5 595.27）μg/L。其中，酯類37 種，醇類8 種，醛酮類4 種，酸類2 種，萜烯類與C13-降異戊二烯類5 種，縮醛類4 種，萘及萘的衍生物4 種，其他類3 種；基酒裝量200 L時酒身共檢測出67 種，總質量濃度（117 371.70±2 904.73）μg/L，其中酯類37 種，醇類10 種，醛酮類3 種，酸類2 種，萜烯類與C13-降異戊二烯類5 種，縮醛類3 種，萘及萘的衍生物4 種，其他類3 種；基酒裝量為250 L時酒身共檢測出64 種，總質量濃度（128 683.95±3 599.54）μg/L，其中酯類37 種，醇類10 種，醛酮類2 種，酸類2 種，萜烯類與C13-降異戊二烯類6 種，縮醛類3 種，萘及萘的衍生物2 種，其他類2 種。不同基酒裝量蒸餾酒酒身總揮發性物質含量無顯著差異。

表2 酒身中揮發性物質含量和RITable 2 Concentrations and RI of volatile compounds in distilled wine samples

酯類物質是蒸餾酒香氣最主要的貢獻物質[25]，主要通過發酵和蒸餾過程中醇類和有機酸酯化作用生成，大部分酯類化合物呈現花香和果香。結果顯示，基酒裝量為150、200 L和250 L時蒸餾酒酒身中酯類物質均為37 種，其質量濃度分別為（47 608.96±2 714.04）、（33 640.96±677.75）μg/L和（40 205.53±291.52）μg/L，150 L 時酯類物質含量顯著高于200 L 和250 L（P＜0.05）。雖然醇類物質總含量在酒體中占比最大，但是3 個不同酒身樣本中醇類物質總質量濃度分別為（70 593.84±2 531.84）、（74 909.78±2 111.17）、（79 354.43±3 842.86）μg/L，無顯著差異。

2.4 基酒裝量對酒身中鏈脂肪酸乙酯的影響

本研究以HS-SPME-GC-MS法對基酒裝量為150、200、250 L的酒身中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯進行了定量分析（表1），含量如圖1所示。不同酒身中4 種中鏈脂肪酸乙酯含量和OAV大小均為150 L＞250 L＞200 L。其中癸酸乙酯含量最高，辛酸乙酯含量次之，這與前人的研究結果一致[16]，但是，辛酸乙酯OAV最大，達到411.84，依次是己酸乙酯、癸酸乙酯和十二酸乙酯，4 種中鏈脂肪酸乙酯中癸酸乙酯雖然含量高，但是，最主要的特征風味物質是辛酸乙酯，賦予酒體濃厚的花香和果香。當基酒裝量為150 L時，酒身中辛酸乙酯的OAV顯著高于其他兩個裝量（P＜0.05）。因此，基酒裝量為150 L時的酒身花香果香更加濃郁。

圖1 酒身中鏈脂肪酸乙酯含量（a）和OAV（b）Fig.1 Contents (a) and OAV (b) of medium-chain fatty acid ethyl esters in distilled wine samples

2.5 不同基酒裝量酒身揮發性物質的統計學分析

由于3 個基酒裝量條件下的蒸餾酒酒身中揮發性化合物的總含量無顯著差異，因此，本研究采用多元統計分析方法對各揮發性化合物進行了具體鑒別。為了觀察揮發性化合物的分布，本研究采用PCA對其進行分析，如圖2a所示，位于不同象限的3 個樣本分別相距較遠，說明不同基酒裝量的酒身的揮發性成分存在顯著差異，PC1對整體方差的貢獻率是41.8%，PC2對整體方差的貢獻率是30.7%，累計貢獻率為72.5%。對150 L酒身樣品有積極影響的高含量物質有A16、A33、A19、A11和A6，低含量物質有A35、C6、F2、C3、E6、A36、A14和A13，其中本研究2.4節著重討論的4 種中鏈脂肪酸乙酯與150 L酒身樣品有強烈的相關性，這些發現與前人研究[14,26]一致，己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯是蒸餾酒酒身的關鍵揮發性化合物。對200 L酒身樣品有積極影響的物質僅有C5，對250 L酒身樣品有積極影響的物質僅有E1。

圖2 蒸餾酒樣品中揮發性化合物的PCA圖Fig.2 PCA plots of volatile compounds in distilled wine samples

PCA結果顯示，對150 L酒身樣品有積極影響的化合物包括酯類9 種、醛酮類2 種、萜烯類化合物1 種和縮醛類化合物1 種，對200 L和250 L酒身樣品有積極影響的揮發性物質都僅有1 種，分別為醛酮類、C13-降異戊二烯類。結果顯示，蒸餾工藝中，隨著填料量的增加，對酒身樣品有積極影響的揮發性物質逐漸減少，這可能因為蒸餾過程中，填料量越大，受熱越不均勻，塔頂溫度偏低、塔底液位波動較大，導致香氣的釋放受到影響。

如圖2b所示，PC1對整體方差的貢獻率是49.5%，PC2對整體方差的貢獻率是35.3%，累計貢獻率為84.8%。研究發現，醇類豐富的蒸餾酒中，酸類物質也更加豐富，且與醛酮類物質呈負相關，這可能與醇類物質氧化形成了醛酮類物質有關。在發酵期間酯類物質主要由醇類物質和酰基輔酶A通過酶促反應與酸生成[25,27]，因此，醇和酸在蒸餾酒樣品中與酯呈負相關，與前人的研究結果一致[28]。

為進一步識別樣本特征，驗證PCA結果的合理性，建立了OPLS-DA模型，本模型解釋變異數＝0.997，預測能力Q2＝0.969，說明模型優秀。在OPLS-DA得分圖中（圖3），基酒裝量分別為150、200、250 L的酒身被清晰地分開，說明該模型可將3 種工藝的酒樣明顯分離，與上述PCA模型一致。

圖3 不同填料量的蒸餾酒樣本的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plot of distilled wine samples

為進一步分析兩組之間的差異揮發性化合物，進行了變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）分析，VIP值可以量化每個變量對樣品分類的貢獻，VIP＞1可認為該變量為該判別模型的潛在差異物質[29]，VIP值越大說明該物質在判別過程中的貢獻越大[30]。

根據OPLS-DA模型VIP值（＞1）和T檢驗的P值（P＜0.05），確定了不同基酒裝量的蒸餾酒酒身的潛在差異物質（表3）。

表3 3 種不同填料量酒身的差異揮發性物質Table 3 Differential volatile compounds in distilled wine samples

由表3可知，基酒裝量150 L vs 200 L的酒身樣品中，共鑒定出19 種潛在差異揮發性物質，其中，酯類9 種，醇類2 種，羰基化合物6 種，萜烯類1 種，縮醛類1 種。基酒裝量150 L vs 250 L的酒身樣品中，共鑒定出14 種潛在差異揮發性物質，包括酯類4 種，醇類2 種，羰基化合物3 種，萜烯類1 種，萘及其衍生物2 種，縮醛類1 種和其他物質1 種。基酒裝量200 L vs 250 L的酒身樣品中，共鑒定出13 種潛在差異揮發性物質，其中，酯類7 種，羰基化合物3 種，萜烯類1 種，萘類1 種和其他物質1 種。因此，200 L vs 250 L酒身樣品中差異揮發性化合物最少，150 L vs 200 L酒身樣品中差異揮發性化合物最多。研究結果進一步表明OPLS-DA結果與PCA結果一致，可以證明其合理性。

3 結論

本研究考察不同基酒裝量對美樂葡萄蒸餾酒酒身揮發性物質的影響，旨在探究使用薛氏雙釜蒸餾器時美樂葡萄蒸餾酒的最佳蒸餾條件。通過氣相色譜-氫火焰離子化檢測器法分析蒸餾酒酒身樣本中甲醇含量遠低于國家標準。HS-SPME-GC-MS法對3 個不同基酒裝量條件下的蒸餾酒進行分析，裝量為150、200、250 L時的酒身，分別檢出67、67、64 種揮發性化合物。為了進一步研究不同基酒裝量對揮發性物質的影響，利用SIMCA 14.1軟件對揮發性成分進行PCA和OPLS-DA。PCA結果顯示，對基酒裝量150 L蒸餾酒酒身有積極影響的揮發性化合物共13 種（酯類9 種、醛酮類2 種、萜烯類化合物1 種和縮醛類化合物1 種），對基酒裝量200 L和250 L的蒸餾酒酒身有積極影響的揮發性化合物都僅有1 種，分別為醛酮類和C13-降異戊二烯類。研究發現，蒸餾工藝中采用150 L的基酒裝量為最佳，OPLS-DA結果與PCA結果一致。該結果可用于美樂葡萄蒸餾酒生產過程中基酒裝量的確定，以獲得更高品質的成品美樂葡萄蒸餾酒，此外，本研究采用膠東半島產區美樂葡萄為原料進行葡萄蒸餾酒產品開發，為膠東半島產區美樂葡萄蒸餾酒香氣化合物的研究提供了理論指導。