膠質瘤化療耐藥機制的表觀遺傳學調控研究進展△

陳曦，王雅梅

首都醫科大學12021級臨床醫學“5+3”一體化專業一班，2基礎醫學院生化與分子生物學系，北京 1000690

膠質瘤是發生于神經外胚層的顱內腫瘤，占腦部腫瘤的70%以上，其隱匿性較強，惡性程度、復發率及病死率均較高[1]。臨床上將膠質瘤分為4 個級別，Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤稱為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤稱為高級別膠質瘤，級別越高，惡性程度就越高。低級別膠質瘤患者不常見，大多為年輕患者，這些患者有較好的預后，并對治療表現出一定的敏感性[2]。多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是Ⅳ級星形細胞腫瘤，也是病死率最高、最難治愈的腫瘤。高級別膠質瘤的治療以手術切除為主，放化療為輔。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種口服烷基化藥物，也是唯一可以跨越血腦屏障對膠質瘤起作用的藥物，可將細胞周期阻斷在G2/M 期，導致膠質瘤細胞凋亡[3]。鉑類藥物如順鉑、卡鉑等是一類影響細胞周期的化療藥物，也是臨床上治療膠質瘤的常用化療藥物，其主要靶點是DNA，通過與DNA結合破壞其結構，最終導致膠質瘤細胞周期中斷或凋亡[4]。經過多年研究發現，膠質瘤對化療具有很強的耐藥性，這也導致患者治愈率不高，生存期較短，預后較差。越來越多的研究表明，表觀遺傳學調控因子的改變對膠質瘤的發生發展及耐藥具有重要影響。因此，研究膠質瘤的耐藥機制，探索減少膠質瘤產生耐藥的方法對提高抗腫瘤藥物的療效具有重要的臨床意義。本文從膠質瘤耐藥的產生機制及表觀遺傳學調控對膠質瘤耐藥的影響等方面進行綜述，旨在對膠質瘤的治療、藥物的合理使用和研發以及后續的相關研究提供參考依據。

1 表觀遺傳學調控對膠質瘤耐藥的影響

表觀遺傳修飾參與多種生命活動的調控過程，常見的修飾類型包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 調控和染色質重塑，表觀遺傳修飾異?？赡苷T導膠質瘤發生發展與耐藥的產生。

1.1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是一種在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下進行的化學修飾過程。在這個過程中，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體，在胞嘧啶的嘧啶環上的5'位置添加一個甲基，形成5-甲基胞嘧啶，從而使基因沉默，該過程主要發生在CpG 二核苷酸上，也可見于非CpG 序列，但較為罕見[5]。DNMT 的表達與膠質瘤細胞對TMZ 的敏感性有關。研究發現，DNMT1 在對TMZ 耐藥的膠質瘤細胞中表達下調，其表達水平越高，膠質瘤細胞對TMZ 的敏感性越強[6]。DNA 甲基化異常還涉及藥物外排轉運體的啟動子、促凋亡基因和DNA 損傷修復基因。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一種關鍵的DNA 損傷修復基因，其表達產物負責修復TMZ 造成的DNA 損傷，當MGMT啟動子區域發生高度甲基化時，該基因會被沉默，從而增強GBM對TMZ 的臨床反應。MGMT 表達上調可使膠質瘤對TMZ 造成DNA 損傷的修復能力增強，從而使膠質瘤產生耐藥性。在復發性膠質瘤臨床樣本中，MGMT啟動子容易建立非甲基化狀態，MGMT表達出現上調[7]。另一方面，即使MGMT啟動子未發生改變，基因組重排列也可導致復發性膠質瘤中MGMT 過表達[8]。Lu 等[9]研究小核仁RNA 宿主基因12（small nucleolar host gene 12，SNHG12）在GBM 耐藥中的作用，以及表觀遺傳學調控對其異常表達的影響，結果發現，在對TMZ 耐藥的膠質瘤細胞中，SNHG12 表達顯著上調，且啟動子處DNA甲基化水平異常低。DNA 甲基化缺失使SNHG12的啟動子區域更容易被特異性蛋白1（specificity protein 1，SP1）接近，SP1 可激活SNHG12 并促使其表達。除上述基因外，p17、大腫瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）、大腫瘤抑制激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）等基因啟動子區域CpG 島（基因中富含非甲基化CpG 的區域）的甲基化也與膠質瘤的發生發展和復發耐藥密不可分[10-11]。DNA 高甲基化與耐藥性有關，因此，去甲基化藥物在逆轉GBM 中與DNA高甲基化相關的耐藥性方面具有潛在的應用價值。但由于缺乏選擇性，去甲基化劑可能會產生廣泛的全身不良反應，該類藥物的臨床應用還需要進一步的研究。

1.2 組蛋白修飾

組蛋白是一種蛋白質，可與DNA 形成核小體。核小體是染色質的基本結構單位，是由4 個核心組蛋白（H2A、H2B、H3 和H4）的2 個分子和147個堿基對長度的DNA 形成的組蛋白八聚體。常見的組蛋白表觀修飾方式包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和類泛素蛋白修飾等，其中對膠質瘤耐藥影響的研究較為深入的是乙?；痆12]。

1.2.1 組蛋白乙酰化修飾對膠質瘤耐藥的調控組蛋白乙?；梢哉{節染色質結構和基因表達。在這個過程中，組蛋白乙酰轉移酶將乙酰基添加到組蛋白上的賴氨酸殘基上，從而形成有利于轉錄激活的開放染色質狀態。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）可以從賴氨酸上去除乙?；瑥亩纬捎欣谵D錄沉默的致密染色質[13-14]。在GBM 中，一些特殊的HDAC 表達上調，促進了膠質瘤細胞耐藥。研究表明，Ⅰ類HDAC的催化活性可促進E3 泛素連接酶RAD18 表達上調，避免細胞發生TMZ 導致的DNA 損傷[15]。Yang 等[16]研究發現，GBM 細胞可以通過HDAC1/2/6 去乙酰化調控SP1的轉錄活性，使B 細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1（B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI1）和人端粒酶逆轉錄 酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）表達上調，并改變多種基因的表達，調節細胞周期G2/M 期和DNA 損傷修復，促進膠質瘤細胞自我更新，從而產生耐藥性。組蛋白修飾基因zeste增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）、zeste 12 同源物抑制因子（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）和AT 豐富結構域1A（ATrich interaction domain 1A，ARID1A）在對TMZ 耐藥膠質瘤細胞中的表達水平明顯高于對TMZ 不耐藥的膠質瘤細胞[17]。與組蛋白修飾相關的酶，如蛋白質精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT）和賴氨酸去甲基化酶（lysine demethylase，KDM）均在膠質瘤的發生發展與耐藥過程中發揮重要作用，對患者的生存具有負面影響。PRMT 抑制劑目前正在開發中，泛KDM 抑制劑以及選擇性賴氨酸去甲基化酶5A（lysine demethylase 5A，KDM5A）抑制劑等小分子抑制劑可有效抑制TMZ耐藥膠質瘤細胞繼續生長[6]。維持乙?；胶鉅顟B對于基因轉錄調節至關重要。未來需要進一步的研究確定HDAC 的最佳組合策略，以確保其在逆轉GBM耐藥治療中的有效性和安全性。

1.2.2 膠質瘤的組蛋白修飾調控新機制 隨著表觀遺傳修飾研究的不斷深入，很多非乙?；慕M蛋白?；{控，如組蛋白巴豆?；揎棥⒆貦磅；揎椇顽牾；揎棇δz質瘤發生發展影響的研究取得了突破性進展。巴豆酰化修飾主要是在巴豆?；D移酶的作用下以巴豆酰輔酶A 為底物，將巴豆?；D移到賴氨酸殘基，其修飾位點主要富集在基因的啟動子區域和潛在的增強子區域[18]。研究表明，GBM 干細胞通過調節賴氨酸代謝產生大量的巴豆酰輔酶A，從而增加細胞整體巴豆?；健＝M蛋白H4 的巴豆酰化修飾通過影響H3K27乙?；虷3K9 三甲基化限制免疫原性轉座因子，抑制干擾素信號，減少CD8+T 細胞浸潤，最終減弱抗腫瘤免疫反應并促進腫瘤生長[19]。琥珀?；侵哥牾；w在琥珀酰輔酶A 的介導下將琥珀酰基團共價結合到賴氨酸殘基的過程。研究報道，α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH）通過與賴氨酸乙酰轉移酶2A（lysine acetyltransferase 2A，KAT2A）結合形成復合物，從而發揮琥珀酰轉移酶的功能，進一步使組蛋白H3K79 琥珀?；瑥亩龠M膠質瘤生長[20]。Zhang 等[21]研究證實了膠質瘤內皮細胞中轉膠蛋白2（transgelin 2，TAGLN2）基因K40 位點高度琥珀酰化，在體內外均顯著促進膠質瘤血管生成和腫瘤轉移。棕櫚?；且环N可逆的蛋白質翻譯后修飾，通常指棕櫚酰基團與蛋白質的半胱氨酸殘基共價連接，形成不穩定的硫酯鍵。Chen 等[22]研究發現，與正常腦組織相比，膠質瘤組織中棕櫚酰化修飾程度明顯增加，如果抑制膠質瘤組織中的棕櫚?；揎椝?，將會激活膠質瘤細胞凋亡信號通路，并且引發內質網應激反應，這為探索棕櫚酰化與膠質瘤的關系提供了重要依據。八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）基因多在腫瘤組織和細胞系中表達，在腫瘤干細胞維持和自我更新過程中發揮重要作用。化療耐藥性是腫瘤干細胞的重要特征之一，研究表明，OCT4 表達水平與化療耐藥呈正相關，OCT4能夠作為化療耐藥和預后預測標志物[23-24]。研究發現，棕櫚?；疧CT4 易與性別決定區Y 框蛋白4（sex determining region Y-box 4，SOX4）結合，共同維持膠質瘤干細胞持續增殖，促進膠質瘤的發生發展[25]。目前已經證實巴豆?；揎?、棕櫚?；揎椇顽牾；揎椃绞娇赡芘c膠質瘤的進展有關，并且為進一步開發修飾相關的腫瘤治療藥物提供了可能，然而這些修飾方式對膠質瘤耐藥的調控尚未見報道，還有待于進一步的研究加以證實。

1.3 非編碼RNA 調控

1.3.1 長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）對膠質瘤耐藥的調控 lncRNA 是長度＞200 個核苷酸的異質RNA，可以影響細胞增殖、分化、凋亡，在誘導腫瘤的發生、發展、侵襲、遷移等生物學行為方面發揮著重要作用。lncRNA 沒有編碼蛋白質的能力，但是可以調節基因的表達。其中，肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）和H19在膠質瘤細胞對TMZ 耐藥中的作用得到了充分研究。MALAT1 又稱核富集豐富轉錄本2（nuclear enriched abundant transcript 2，NEAT2），是膠質瘤組織中高表達的一種致癌lncRNA。研究表明，在TMZ 耐藥GBM 患者的GBM 組織中，MALAT1 表達顯著上調，其通過抑制微小RNA（microRNA，miRNA）-203 的表達，導致GBM 對多種藥物產生耐藥性[25]。Li 等[26]研究表明，下調MALAT1 的表達可抑制多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）和多藥耐藥相關蛋白5（multidrug resistance association protein 5，MPR5）等多藥耐藥相關基因的表達，從而達到使膠質瘤細胞對TMZ 增敏的目的。MALAT1 過表達可通過上調鋅指E 盒結合同源框1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）等E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，促進上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），提高膠質瘤的耐藥性。另一項研究表明，MALAT1 表達下調可導致耐藥的膠質瘤細胞中miRNA-101 表達上調，糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β表達下調，克服膠質瘤細胞對TMZ 耐藥[27]。H19 是另一種常見的致癌lncRNA，常在膠質瘤組織和細胞中過表達，尤其在TMZ 耐藥的膠質瘤U251 和M059J 細胞中表達高度上調[28]。H19 可使細胞周期蛋白（cyclin）D1 基因表達上調，影響細胞周期轉變，促進膠質瘤細胞增殖，并防止膠質瘤細胞周期停留在G2/M 期，從而抑制TMZ 誘導的細胞凋亡[3]。抑制H19 的表達可使耐藥基因MDR、MRP、三磷酸腺苷結合盒亞家族G成員2（adenosine triphosphate binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）表達明顯降低，也可通過上調E-cadherin 的表達，降低波形蛋白（vimentin）和ZEB1 的表達水平，從而抑制EMT 過程，使膠質瘤細胞對TMZ 更加敏感[29]。除上述兩種lncRNA 外，還有一系列其他lncRNA 以多種不同途徑參與調控膠質瘤耐藥[30-46]（表1），這些lncRNA 可以作為克服TMZ 耐藥性的有希望的治療靶點，從而提高TMZ 化療的臨床療效。

表1 lncRNA 對膠質瘤耐藥的調控

1.3.2 miRNA 對膠質瘤耐藥的調控 基因翻譯水平可影響各種細胞進程[47]。單個miRNA 可以同時影響GBM 中多個mRNA，而GBM 的單個mRNA也可被一個或多個miRNA 調節[48]。近年來的研究表明，miRNA 異常表達與膠質瘤耐藥密切相關，且其調控機制錯綜復雜，常見的調控方式主要包括介導細胞凋亡、MGMT 對DNA 損傷的修復以及EMT 等[49]。例如，miRNA-221 通過使其靶點磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）表達下調，激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路，并調控EMT 相關基因的表達，促進膠質瘤耐藥[50]。研究表明，靶向動力蛋白3（dynamin 3，DNM3）可誘導膠質瘤發生發展及對TMZ 耐藥[51]。Areeb 等[52]研究表明，miRNA-221 還可以通過下調表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達增強膠質瘤對TMZ 和放療的耐受性。其他多種miRNA 也可通過靶向不同的mRNA 以多種不同途徑參與膠質瘤耐藥[53-62]（表2）。miRNA 表達與膠質瘤化療耐藥密切相關，目前的研究表明，利用miRNA 抑制劑或類似物降低因miRNA 表達失調引起的耐藥，有望成為逆轉膠質瘤耐藥的有效方法。

表2 miRNA 對膠質瘤耐藥的調控

1.4 染色質重塑

染色質重塑是由三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供給能量，在染色質重塑復合體的介導下，使得核小體移動或解離的過程。染色質重塑復合體具有ATP 酶活性，根據發揮催化作用的ATP 酶亞基的不同，可以將復合體分為4 類：交配型轉換（mating type switching，SWI）/蔗糖不發酵（sucrose non-fermenting，SNF）復合體、模擬開關（imitation switch，ISWI）、染色質域-解旋酶-DNA 結合蛋白（chromodomain helicase DNA binding protein，CHD）、INO80。這些復合體及其相關蛋白與細胞周期的激活和抑制、DNA 修復、DNA 甲基化及DNA 轉錄有關[12]。染色質重塑復合體關鍵基因的突變可使核小體無法定位，導致染色質重塑失敗，基因表達異常，最終可能導致腫瘤的發生發展及耐藥的產生[47]。其中，SWI/SNF 復合體得到了較為充分的研究，SWI/SNF 復合體的Brahma 相關基因1（Brahma-related gene 1，BRG1）催化亞基可促進GBM 細胞的惡性表型及對TMZ 耐藥。研究顯示，敲除BRG1增加了GBM 細胞對TMZ 和順鉑的敏感性，BRG1 表達下調也增加了GBM 干細胞在體外對TMZ 的敏感性。含BRG1 的SWI/SNF 復合體可調控多種DNA 修復途徑，包括通過同源重組修復DNA 雙鏈斷裂[63]。Ganguly 等[64]敲低膠質瘤起始細胞（glioma-initiating cell，GIC）X16 中的BRG1，并采用TMZ 處理，結果發現，敲低BRG1后，GIC X16 中MGMT 表達降低，且對TMZ 的敏感性顯著提高。由于染色質結構的復雜性，靶向染色質重塑研究GBM 的化療耐藥是一項艱巨的挑戰，目前的研究集中在利用抗染色質重塑劑防止動態染色質重排來克服GBM 的耐藥性。

2 逆轉膠質瘤耐藥的表觀遺傳學方法及前景

隨著對表觀遺傳學與膠質瘤耐藥機制關系研究的不斷深入，從表觀遺傳的角度治療膠質瘤，逆轉膠質瘤耐藥的前景變得更為明朗。如前所述，MGMT 表達上調可促進膠質瘤對TMZ 耐藥，抑制MGMT 的表達為逆轉TMZ 耐藥提供了一種可能。β干擾素可通過下調MGMT 的表達抑制膠質瘤細胞對TMZ 耐藥，與TMZ 聯合治療膠質瘤為未來的臨床應用提供了廣闊的前景[65]。一氧化氮供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetyl penicillamine，SNAP）也可通過下調MGMT 的表達抑制TMZ 耐藥[66]。另有研究表明，白藜蘆醇可通過抑制WNT 信號通路激活、下調MGMT 的表達增加膠質瘤細胞對TMZ 的敏感性[67]。高選擇性磷酸甘油酸脫氫酶抑制劑NCT503 能夠抑制絲氨酸合成途徑，可能通過干擾WNT/β-聯蛋白（β-catenin）通路和活性氧介導的DNA 損傷，降低MGMT 的表達。因此，NCT503 和TMZ 聯合治療可能是一種新的治療策略[68]。小分子抑制劑EPIC-0412 可通過影響p21-E2F 轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）軸抑制GBM 細胞的DNA 損傷修復，還可以通過與MGMT啟動子區域的激活轉錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）-p-p65-HDAC1軸相互作用使MGMT基因沉默，以增強膠質瘤細胞對TMZ 的敏感性[69]。在膠質瘤中，一些特殊的HDAC 也可促進膠質瘤耐藥。Yelton 和Ray[70]的研究顯示，HDAC 抑制劑可引起組蛋白或非組蛋白乙酰化增加，使膠質瘤細胞染色質構象更為開放，更易于TMZ 破壞DNA，這也提供了一種繞開TMZ 耐藥治療膠質瘤的方法。妥巴他汀A 是一種HDAC抑制劑，可以逆轉膠質瘤EMT 進程，進而增強TMZ 誘導的細胞凋亡[71]。NBM-BMX 是一種HDAC8 抑制劑，可通過下調β-catenin/c-Myc/SOX2信號通路促進細胞凋亡，這種抑制劑也可以抑制MGMT 的表達，使膠質瘤細胞對TMZ 增敏[72]。下調SWI/SNF 復合體的BRG1 催化亞基的表達也為逆轉膠質瘤耐藥提供了一種可能，BRG1 溴結構域抑制劑PFI-3 增強了TMZ 在GBM 細胞中的抗腫瘤活性，也可達到克服耐藥的目的[73]。研究表明，仿生納米聲敏劑系統與無創超聲驅動相結合，可有效穿過血腦屏障，靶向遞送化療藥物，產生的活性氧不僅可以誘導膠質瘤細胞凋亡，還可以下調耐藥相關因子的表達，增強化療敏感性[74]。另外，一系列非編碼RNA 也為逆轉膠質瘤耐藥提供了可能的位點，這有待于進一步的研究。

3 小結與展望

近年來，研究者對表觀遺傳學在膠質瘤耐藥中調控機制的不斷深入研究，為未來膠質瘤的治療提供了新的方向，為逆轉膠質瘤耐藥提供了新的可能。MGMT、HDAC等基因表達上調、SWI/SNF復合體的BRG1 催化亞基以及一系列非編碼RNA都可以促進膠質瘤耐藥，同時也為逆轉膠質瘤耐藥提供了可能。MGMT、BRG1 以及一些特定的HDAC 抑制劑對逆轉膠質瘤耐藥、提高治愈率具有重要作用。TMZ 與抑制劑聯合治療可更好地發揮TMZ 的療效，達到治療膠質瘤的目的。然而膠質瘤的耐藥機制錯綜復雜，在表觀遺傳學的影響下膠質瘤的發展及預后更加難以預測，未發現的耐藥機制以及各種機制間的補償作用也導致目前解決膠質瘤耐藥的效果不是很理想。因此今后的研究可以著手于目前尚不明確的耐藥機制以及耐藥機制間的補償作用，為逆轉膠質瘤耐藥提供更多可能，并開發更多可逆轉膠質瘤耐藥的藥物或其他化療藥物。希望未來能夠早日突破膠質瘤耐藥難題，改善患者預后。