過表達miR-186減弱EMT途徑抑制白血病細胞增殖、遷移及糖酵解

馮永笑 張丑丑 董艷琴 趙曉亮

急性髓系白血病(AML)是一種髓系干細胞前體(紅細胞、血小板和除B和T細胞之外的白細胞)惡性腫瘤[1];病程進展十分迅速,發病率隨著年齡的增長而增加,患者存活率較低且預后不佳[2,3]。目前,AML的臨床治療方法包括誘導分化治療、聯合化療、造血干細胞移植和免疫治療,最常見的還是藥物和化療,但由于化療耐藥性的產生導致患者預后較差,探索新的更安全而有效的治療方式已亟不可待。MicroRNAs (miRNAs)是一類短鏈非編碼RNAs,長度為18～25個核苷酸,通過靶向下游mRNAs影響細胞分化、增殖和存活[4]。越來越多的證據表明miRNAs參與了人類癌癥的發展,失調的miRNAs已被確定在AML發病中發揮關鍵作用[5];且一些miRNAs已被證明與AML患者的預后相關,例如miR-12462[6]和miR-155[7]。在miRNAs中,miR-186位于染色體1p31.1,在鋅指蛋白265基因的第8個內含子處,已在多種癌癥中得到廣泛研究,在癌癥中的作用取決于其對多種腫瘤生物學行為的影響,包括細胞增殖、遷移及細胞周期等。糖酵解是能量供應的主要方式,是腫瘤細胞的特征表型之一,miR-186可以抑制胃癌細胞的糖酵解[8]。研究報道稱miR-186在皮膚鱗狀細胞癌[9]中表達上調,而在骨肉瘤[10]、肺癌[11]及口腔鱗狀細胞癌[12]中表達下調。另有研究表明,miR-186在AML患者中低表達,并且與患者的低生存率相關[13],上皮間質轉化(EMT)能有效促進腫瘤細胞的生長、增殖和遷移,且EMT相關因子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和AML患者的不良預后相關[14-16]。觀察過表達miR-186對AML細胞增殖、遷移、糖酵解及EMT的影響,探討miR-186在白血病細胞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人白血病細胞HL-60,購自河南省工業微生物菌種工程技術研究中心。

1.1.2 藥品與試劑：miR-186 mimic、陰性對照片段(mimic NC)由北京華大基因設計合成,Lipofectamine2000陽離子脂質體(美國Invitrogen公司),胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司),活細胞計數(CCK-8)試劑盒(南京諾唯贊生物技術股份有限公司),逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(杭州主諾生物技術有限公司),萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒(美國BioVision公司),RIPA裂解液(美國ABW公司),BCA蛋白試劑盒(英國Abcam公司),鼠抗人(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(二抗)(美國CST公司)。

1.1.3 儀器：BC-J160型細胞培養箱(上海博迅實業有限公司),7500型實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀器(美國ABI公司),IX71型光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司),Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司),OI-1000型凝膠成像系統(廣州光儀生物科技有限公司),血細胞計數板(上海梵態生物科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：在37℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養箱內,將HL-60細胞培養于RPMI-1640培養基(含10% FBS)中,對數生長期HL-60細胞用于實驗。

1.2.2 分組及細胞轉染：將白血病細胞分為3組,分別為對照組、mimic NC組、miR-186過表達組,對照組細胞不做轉染處理,mimic NC組采用脂質體法將mimic NC轉染至白血病細胞,而miR-186過表達組采用脂質體法將miR-186 mimic轉染至白血病細胞。然后收集轉染24 h后的細胞用于各項實驗。

1.2.3 測定指標

1.2.3.1 RT-qPCR測定HL-60細胞中miR-186相對表達量：Trizol試劑盒提取RNA,按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應,獲取cDNA模版。然后參照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書進行RT-qPCR擴增。反應條件設置：在94℃下分別預變性5 min及變性35 s,在58℃和72℃下分別退火35 s及延伸35 s,設置40次循環。miR-186以U6為內參,E-cadherin,N-cadherin和Vimentin以GAPDH為內參,2-ΔΔCT法計算miR-186、E-cadherin,N-cadherin和Vimentin相對表達量。見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3.2 倒置顯微鏡觀察HL-60細胞的形態：細胞分組同2.2,將轉染后的HL-60細胞接種到12孔板中,每孔加約2×105個細胞,每組設置3個復孔,24 h后用倒置顯微鏡觀察細胞形態并拍照記錄。

1.2.3.3 CCK-8法測定HL-60細胞的增殖：細胞分組同2.2,將轉染后的HL-60細胞用完全細胞培養液重懸,以8×103個/孔的密度接種于96孔板,于37℃、5% CO2培養箱中培養24、48、72 h,后加入10 μl CCK-8溶液進行孵育,2 h后使用酶標儀測450 nm處各孔的吸光度值,計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(OD對照組-ODmimic NC組或miR-186過表達組)/OD對照組×100%。

1.2.3.4 Transwell實驗測定HL-60細胞的遷移能力：將轉染后的HL-60細胞接種到24孔板Transwell小室的上室中,每孔加入200 μl無血清的細胞懸液(1×106/ml),并在Transwell小室的下室中加入600 μl含10% FBS的RPMI-l640培養基;在細胞培養箱中培養24 h后,取出Transwell小室,棉簽擦去小室薄膜上層細胞,PBS清洗Transwell小室后,用4%多聚甲醛固定薄膜下層細胞,然后置于顯微鏡下觀察細胞遷移情況,隨機選取3個視野,并用血細胞計數板對遷移的細胞進行計數。遷移率=(mimic NC組或miR-186過表達組遷移細胞數)/對照組遷移細胞數×100%。

1.2.3.5 用試劑盒檢測HL-60細胞糖酵解能力：取各組干預24 h處于對數生長期的細胞,以2×105個/ml的密度接種于96孔板,待細胞融合度達約80%,收集細胞上清液,用乳酸含量檢測試劑盒檢測細胞上清液中的乳酸生成量,葡萄糖含量檢測試劑盒檢測上清液中葡萄糖消耗水平,以不含細胞的對照孔培養液作為初始濃度。葡萄糖消耗量=初始葡萄糖濃度-實測葡萄糖濃度。實驗重復3次。

1.2.3.6 蛋白免疫印跡(WB)法檢測HL-60細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平：將轉染后的HL-60細胞用RIPA液在冰上進行裂解,4℃,12 000 r/min離心20 min后,將上清蛋白變性,然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳,200 mA恒流轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后,參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin),4℃孵育過夜,隨后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h。TBST洗滌后,加入顯影液,然后凝膠成像系統進行拍照。蛋白灰度值用G表示,蛋白相對表達量=G目的蛋白/G內參蛋白(β-actin)。

2 結果

2.1 miR-186在不同腫瘤細胞中表達水平比較 根據TCGA數據庫分析miR-186在不同腫瘤組織中的表達水平,結果顯示miR-186在血液科細胞中表達水平最高,白血病屬于血液科腫瘤,所以我們選擇miR-186作為干預手段在白血病細胞中進行實驗。見圖1。

圖1 miR-186在不同腫瘤細胞中表達水平;hsa-miR-186-5p代表miR-186

2.2 HL-60細胞中miR-186表達水平比較 轉染24 h后,對照組、mimic NC組和miR-186過表達組 miR-186水平分別為1.01±0.16、0.97±0.09、1.90±0.06。與對照組和mimic NC組相比,miR-186過表達組miR-186表達水平顯著增加(P<0.05);而mimic NC組與對照組比較,miR-186表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 過表達miR-186對HL-60細胞形態的影響 轉染24 h后,對照組與mimic NC組細胞形態無明顯變化;與對照組和mimic NC組相比,miR-186過表達組細胞生長受到抑制,數量減少,形狀不規則。見圖2。

對照組 mimic NC miR-186

2.4 過表達miR-186抑制HL-60細胞的增殖 不同組別吸光度值隨著時間增長呈逐漸上升趨勢,較對照組和mimic NC組,過表達miR-186細胞增殖延緩,在48、72 h時間點,miR-186過表達組吸光度值顯著低于對照組和mimic NC組(P<0.05)。miR-186過表達組較mimic NC組在48 h和72 h細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。見圖3,表2。

圖3 過表達miR-186對HL-60細胞增殖的影響

表2 細胞增殖抑制率

2.5 過表達miR-186抑制HL-60細胞的遷移 轉染24 h后,對照組、mimic NC組和miR-186過表達組細胞遷移能力分別為(100.00±8.55)%、(99.14±3.83)%、(45.27±8.00)%。與對照組和mimic NC組相比,過表達miR-186顯著降低了HL-60細胞的遷移能力(P<0.05);mimic NC組與對照組比較,相對遷移率無顯著差異(P>0.05)。

2.6 過表達miR-186抑制HL-60細胞的糖酵解水平 相較于對照組和mimic NC組,miR-186組細胞的葡萄糖消耗水平和乳酸生成量顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05);對照組和mimic NC組葡萄糖消耗水平和乳酸生成量無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 過表達miR-186對人白血病HL-60細胞糖酵解水平的影響

2.7 過表達miR-186對HL-60細胞中EMT相關因子mRNA表達水平影響 與對照組和mimic NC組相比,miR-186組N-cadherin和Vimentin mRNA表達量顯著降低,E-cadherin mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。對照組和mimic NC組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA表達量均無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 RT-qPCR檢測HL-60細胞中EMT相關因子mRNA的表達水平

2.8 過表達miR-186抑制HL-60細胞的EMT進程 本研究用WB方法檢測了EMT相關蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表達水平。結果顯示,與對照組相比,mimic NC組HL-60細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達量均無顯著差異(P>0.05);而較對照組和mimic NC組,miR-186過表達組中E-cadherin表達顯著升高,N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 WB檢測HL-60細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平

表5 WB檢測HL-60細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達水平

3 討論

AML是成人急性白血病中最常見的類型,目前臨床上最常見治療的仍然是藥物和化療,但化療有骨髓抑制、心臟毒副作用及易復發等特點,且化療耐藥性能夠導致預后不良。有研究表明,異常表達的miRNAs參與腫瘤的發生,這些miRNAs可以作為腫瘤分子標志物,通過干擾或重建相關miRNAs可能是腫瘤治療的一種潛在途徑,過表達miR-204可以抑制AML細胞的增殖和遷移[17]。多項研究表明,miR-186在多種腫瘤細胞中異常表達,過表達miR-186能夠抑制非小細胞肺癌[18]、膀胱癌[19]細胞的增殖和遷移,提示了miR-186在腫瘤發展及抗腫瘤治療中的作用。本研究指出miR-186在血液科腫瘤細胞中表達水平最高,白血病屬于血液科腫瘤,所以選擇miR-186進行實驗,而且miR-186在AML患者中屬于低表達[13],因此本研究過表達miR-186干預AML細胞,發現miR-186組miR-186表達量顯著升高,驗證了過表達實驗轉染成功。惡性的增殖和遷移是AML細胞兩個主要的生物過程,對AML的發展起著關鍵作用。本研究通過評估miR-186對HL-60細胞的增殖和遷移的影響,發現過表達miR-186能夠顯著地抑制白血病細胞HL-60的生長、增殖和遷移能力,這與其在肝癌[20]細胞中的作用相符。腫瘤細胞的糖酵解活性顯著高于正常細胞,并且在氧含量充足條件下仍選擇糖酵解的方式進行能量代謝,主要表現為乳酸生成增多及葡萄糖消耗變快。乳酸的不斷累積會形成酸性微環境,有利于腫瘤細胞的發生發展、免疫逃逸等反應[21]。本研究結果表明過表達miR-186對HL-60細胞糖酵解的抑制作用,提示miR-186過表達通過抑制AML細胞的糖酵解,減少細胞增殖、遷移需要的能量和營養,從而抑制細胞的生長、增殖和遷移能力。

EMT是指細胞由上皮表型轉變為間質表型,激活后在生物體的發育以及上皮性腫瘤細胞的轉移方面發揮重要作用,是腫瘤細胞發生遷移和侵襲的關鍵因子[22]。EMT作為惡性腫瘤預后的主要影響因素,在AML患者中與其不良預后相關,EMT相關因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達和疾病侵略性相關,其能夠促進AML的進程[23]。并且有報道稱miRNAs能夠通過調節EMT抑制AML的發展,如miR-148a-3p和miR-608[24,25]。Lu等[20]證實miR-186通過直接靶向CDK6抑制肝癌細胞的EMT;Sun等[26]研究發現miR-186能夠通過調節Twist1表達來抑制乳腺癌細胞的EMT。與這些報道相似,本研究結果提示,過表達miR-186增加了AML細胞中上皮標志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達,減少了間充質標志物N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達,提示過表達miR-186可以通過上調E-cadherin及下調N-cadherin和Vimentin抑制AML細胞的EMT進程,這些變化可以導致細胞粘附性降低,從而抑制了細胞的增殖和遷移能力。

綜上所述,miR-186通過減弱白血病HL-60細胞EMT進程抑制細胞的增殖、遷移和糖酵解,進而抑制AML的進展。該結果為miR-186在AML治療的應用上提供了參考依據。但美中不足的是本研究僅使用了單一的白血病細胞HL-60細胞系,并未檢測miR-186在其他細胞系中的作用,且本研究僅限于體外研究,未在動物模型中進行體內驗證,這些不足將成為我們接下來要進行研究的一個方向,繼續深入探討miR-186對AML治療的作用機制。