不同參數顯微鏡對外周血細胞復檢計數的影響

楊洪樂 楊麗妙 杜歡歡 張曼娜 胡蕊 郝麗穎

白細胞和血小板是血液中的重要成分,其數量和功能是臨床密切關注的內容,在血液凝血、溶血和免疫系統中發揮了很重要的作用,因此其數量準確與否對于臨床用藥、診斷、監控、療效等非常關鍵。血細胞分析常見方法包括電阻抗法,射頻電導法,激光散射法,流式細胞術法[1,2]等。但是由于諸多因素的影響,如有核紅細胞造成白細胞計數假性增高[3]、原始和幼稚細胞增多、黃疸、冷凝集、溶血、儀器異常提示、人體細胞的多樣性和復雜性以及血細胞分析儀工作原理的局限性[4-6],會出現血常規檢測結果與臨床癥狀不相符的情況[7],這時復檢就顯得尤為重要。其中血涂片復檢中的的細胞計數是通過正確合理使用顯微鏡觀察外周血涂片內定量區域定量細胞的形態和計數,得到更為準確的細胞計數結果[8]。但在使用顯微鏡進行復檢時,人工計數的質量和數量會受到各方面因素的干擾,除人員操作等因素外[9],顯微鏡的不同視場數也是差異因素之一。因此,本研究探討不同視場數顯微鏡計數白細胞和血小板與經典方法間的差異。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2021年11月至2022年5月河北醫科大學第二醫院門診就診患者進行血常規檢測完畢后的標本,選取白細胞和血小板低值(白細胞<3.5×109/L、血小板<125×109/L)、正常值(白細胞3.5×109/L～9.5×109/L、血小板125×109/L～350×109/L)、高值(白細胞>9.5×109/L、血小板>350×109/L)的標本各100例(非血液病,儀器無異常報警)。

1.2 儀器與試劑 Beckman Coulter Unicel DxH 800全自動血細胞分析儀及其相關原裝配套試劑、質控品、校準品等;視場數為18的Olympus CX21顯微鏡,視場數為26.5的Olympus BX70顯微鏡;改良牛鮑計數板、白細胞稀釋液(2%乙酸溶液)、血小板稀釋液(10 g/L草酸銨溶液),瑞氏-姬姆薩染色液。

1.3 方法

1.3.1 血涂片制備：使用清潔、干燥一次性載玻片,距離玻片磨砂面端1 cm處,加1滴(約5～10 μl)充分混合均勻的外周靜脈抗凝血液標本,握住另一張邊緣光滑的推片,保持推片與載玻片呈30°～45°角,使血滴與推片快速散開,勻速、平穩的推動推片至載玻片的另一端。制好的血涂片在空氣中晃動干燥,血膜由厚到薄逐漸過渡,呈“子彈頭”狀,頭、體、尾分明[11]。

1.3.2 血涂片染色：制好的干燥血涂片水平放到染色架上,加瑞氏-姬姆薩染色液覆蓋整個玻片,產生輕微的表面張力,染色3～5 min后加入適量緩沖液,用吸耳球把染液和緩沖液吹均勻,再染色15～20 min。染色結束后,用流水緩慢沖洗玻片,直至不再有帶顏色的水滴,把血涂片背面染料殘渣擦拭干凈,晾干備用[11]。

1.3.3 白細胞計數

1.3.3.1 血涂片法：采用目鏡視場數18與26.5的顯微鏡分別計數血涂片30個高倍鏡視野下的白細胞數量并計算每個視野下的白細胞均值。根據公式估算白細胞數值,系數R為2,白細胞估測數值=30個高倍鏡視野下白細胞均值×R。

1.3.3.2 血細胞分析儀法：血標本經儀器檢測后記錄Beckman Coulter Unicel DxH 800全自動血細胞分析儀測得的白細胞計數。

1.3.3.3 改良牛鮑計數板法：在潔凈的小試管中加入配制好的白細胞稀釋液0.38 ml,用一次性清潔干燥的微量吸管準確吸取20 μl EDTA抗凝全血,擦去吸管外余血后將其插入白細胞稀釋液底部,輕輕將血放出,并吸取上清液清洗吸管3次,輕輕震蕩混勻。待紅細胞被完全破壞,液體變為棕褐色后,再充分混勻,用一次性清潔微量吸管充入改良牛鮑計數板的計數池中,充池時避免氣泡和外溢,充池后靜置沉淀2～3 min,等待細胞自然下沉。用顯微鏡40×高倍鏡計數計數室四角大方格內的白細胞數量。公式：白細胞/L=N/4×10×20×106=N/20×109(其中N表示四個大方格中白細胞數,/4表示平均數量,×10表示換算成1 μl血液,×20表示稀釋倍數,×106表示換算為1 L)[12]。

1.3.4 血小板計數

1.3.4.1 血涂片法：采用目鏡視場數18與26.5的顯微鏡分別計數血涂片內紅細胞分布均勻的30個100×油鏡視野下血小板數量,并計算每個視野下血小板均值。根據公式估算出血小板數(30個油鏡視野下血小板均值×R系數,系數R為2種①r=10;②r=15)。

1.3.4.2 血細胞分析儀法：血標本經儀器檢測后記錄Beckman Coulter Unicel DxH 800全自動血細胞分析儀測得的血小板計數。

1.3.4.3 改良牛鮑計數板法：在潔凈的小試管中加入配制好的血小板稀釋液 0.38 ml。準確吸取EDTA抗凝靜脈血 20 μl,擦去管外余血,置于血小板稀釋液內底部輕輕將血放出,吸取上清液清洗吸管3次,立即充分振蕩混勻。待完全溶血后再次混勻1 min。后將其注入改良牛鮑計數板計數池內,靜置 10～15 min,待血小板下沉。用顯微鏡高倍鏡計數計數室中央大方格內的四角和中央共5個中方格內血小板的數量。根據公式換算,血小板/L=N×5×10×20×106=N×109。(其中N表示5個中方格內數得的血小板數,×5表示換算為一個大方格,×10表示換算為1 μl血液,×106表示換算為1 L,×20表示稀釋倍數)[12]。

1.3.5 血小板估算公式：采用目鏡視場數為18和26.5的顯微鏡分別計數血涂片內的30個油鏡視野下紅細胞總數,然后計算每個視野下紅細胞均值;采用全自動血細胞分析儀進行紅細胞計數;通過血小板和紅細胞間比例,還有儀器檢測的紅細胞數目來估算血小板數值。血小板估算數目(109/L)=全自動血細胞分析儀計數紅細胞數目(1012/L)×20個視野血小板平均數/20個視野紅細胞平均數。

1.3.6 質控方法：全自動血細胞分析儀日常質控的常規操作方法：對儀器進行清洗和維護后,將質控品按低值、中值、高值水平放入全自動血細胞分析儀進行檢測。結果在控(質控失控規則為13 s、22 s)后方可進行,如出現失控,應及時分析失控的原因,找到問題根源,排除后重新進行質控直至結果符合正常范圍[13]。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件,對不同視場數顯微鏡計數白細胞、血小板的實驗數據與對照方法間進行秩和檢驗,采用Excel軟件進行線性回歸相關性分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種視場數顯微鏡白細胞計數結果 視場數為18與26.5的顯微鏡每高倍鏡視野(/HPF)下低值、中值、高值白細胞計數平均值秩和檢驗的結果差異有統計學意義(P<0.05)。低值、正常值、高值標本在相關性分析中的相關系數分別為0.911、0.994、0.692,和低值、正常值的相關性較好。見表1、2。

表1 視場數為18顯微鏡白細胞的平均值/HPF與視場數為26.5顯微鏡白細胞的平均值間的分析結果(秩和檢驗)

表2 視場數為18顯微鏡白細胞的平均值/HPF與視場數為26.5顯微鏡白細胞的平均值間的分析結果(相關性分析)

2.2 血涂片法白細胞計數與全自動血細胞分析儀、改良牛鮑計數板對比結果 視場數為18和26.5的顯微鏡估算白細胞數與全自動血細胞分析儀、改良牛鮑計數板法的結果進行秩和檢驗,差異有統計學意義(P<0.05)。2臺顯微鏡估算的白細胞數與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的結果進行相關性分析,表現出一般的相關性。見表3、4。

表3 視場數為18和26.5顯微鏡估算白細胞數與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的結果(秩和檢驗)

表4 視場數為18和26.5的顯微鏡估算白細胞數與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的結果(相關性分析)

2.3 2種視場數顯微鏡血小板計數結果 視場數為18與26.5的顯微鏡每油鏡視野下低值、正常值、高值白細胞計數平均值,差異有統計學意義(P<0.05);低值、正常值、高值標本的相關系數分別為0.915、0.851、0.626,具有良好的相關性。見表5。

表5 視場數為18與26.5的顯微鏡計數血小板值的分析結果(秩和檢驗)

2.4 血涂片法血小板估算值與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法結果分析

2.4.1 以r=10系數估算血小板值：將視場數為18和26.5的顯微鏡估算血小板數與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法低值、正常值、高值標本的分析結果差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 血涂片法血小板估算值(r=10)與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的分析結果(秩和檢驗)

2.4.2 以r=15系數估算血小板值：用r=15估算18視場數顯微鏡的低值與正常值血小板與全自動血細胞分析儀法的血小板值的差異無統計學意義(P>0.05),高值血小板的差異有統計學意義(P<0.05)。用r=15估算的18視場數顯微鏡的血小板值與改良牛鮑計數板法的血小板值差異均無統計學意義(P>0.05)。r=15時,視場數為26.5的顯微鏡與全自動血細胞分析儀法和改良牛鮑計數板法的低值、正常值、高值的差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表7 血小板估算值(r=15)與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的分析結果(秩和檢驗)

2.5 改良牛鮑計數板法與全自動血細胞分析儀法計數分析結果 改良牛鮑計數板法與全自動血細胞分析儀法計數的白細胞值和血小板值進行相關性分析,一致性良好。見表8、9。

表8 改良牛鮑計數板法與全自動血細胞分析儀法的白細胞計數分析結果(相關性分析)

表9 改良牛鮑計數板法與全自動血細胞分析儀法的血小板計數分析結果(相關性分析)

2.6 血小板估算公式結果 與全自動血細胞分析儀法間低值標本的差異有統計學意義,正常值和高值標本的差異均無統計學意義(P>0.05)。與改良牛鮑計數板法間的低值、正常值、高值標本的差異也均無統計學意義(P>0.05)。視場數為26.5的顯微鏡血小板估算值與全自動血細胞分析儀法、與改良牛鮑計數板法的正常值標本的差異均有統計學意義(P<0.05),低值和高值標本差異無統計學意義(P>0.05)。視場數為18和26.5顯微鏡血小板估算公式與全自動血細胞分析儀法的低值、正常值、高值的結果中除視場數為18的顯微鏡血小板估算公式計數高值標本外,均具有良好的相關性。見表10、11。

表10 血小板估算公式與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的分析結果(秩和檢驗)

表11 血小板估算公式結果與全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法的分析結果(相關性分析)

2.7 2種視場數顯微鏡計數白細胞與血小板的范圍 視場數為18的顯微鏡計數白細胞低值、正常值和高值標本范圍分別為0～2、0～4、0～9(單位為/HPF),計數血小板的低值、正常值和高值標本范圍分別為1～13、8～26、11～43(單位為/油鏡視野);視場數為26.5的顯微鏡計數白細胞的低值、正常值和高值范圍分別為0～5、0～6、0～19(單位為/HPF),計數血小板的低值、正常值和高值范圍分別為3～27、27～51、38～110(單位為/油鏡視野)。見表12。

表12 2種視場數顯微鏡計數白細胞與血小板的范圍結果

2.8 視場數為18和26.5顯微鏡計數血小板時的換算系數 當視場數為18的顯微鏡進行正常值、低值標本血小板計數時,建議r值為15;當血小板為高值時,建議的r值為16.21。當視場數為26.5的顯微鏡進行血小板計數時,正常值標本建議的r值為6.02;低值血小板標本建議的r值為7.33;高值血小板標本建議的r值為6.55。見表13。

表13 2種視場數顯微鏡計數血小板時的換算系數

3 討論

血常規檢測是臨床最常見的檢測項目之一,白細胞和血小板是其中的重要內容[14-16]。白細胞主要用于了解機體有無感染以及感染類型與程度,了解骨髓中造血以及監測臨床用藥情況等。血小板在各種血栓性和出血性疾病中具有重要意義[17, 18]。隨著醫學科技的不斷發展,全自動血細胞分析儀在臨床血常規檢測中的應用越來越廣泛,其便捷快速和準確率高的特點極大方便了血常規檢驗工作的開展[19]。

但血液中的很多異常情況會導致白細胞和血小板計數的異常(如淋巴細胞聚集、巨大血小板會造成白細胞計數假性降低或升高;血小板凝集會造成血小板假性降低等)[20, 21],需要我們進行復檢,以便得到更為準確可信的檢測結果[22]。復檢常用的血涂片法和改良牛鮑計數板法都需要使用顯微鏡,而顯微鏡鏡頭又有目鏡、物鏡、低倍鏡(10×)、高倍鏡 (40×)、油鏡(100×)之分,不同的品牌、不同規格的顯微鏡其鏡頭的參數又不盡相同,這些均會對檢驗結果產生直接影響。本次研究的主要內容是顯微鏡目鏡相關參數視場數對白細胞和血小板計數的影響。

在使用顯微鏡時看到的圓形視野稱為視場。視場數是各制造廠家公布的數字,標刻在目鏡的鏡筒外側側面。不同廠家制作的目鏡和不同類型的目鏡的視場數不同,且倍率高的目鏡,視場數則小。目鏡視場數越大,視場也就越大,越便于微觀觀察。

本實驗結果表明,顯微鏡的視場數不同,白細胞和血小板的計數結果存在統計學差異。這次實驗采用全自動血細胞分析儀法、改良牛鮑計數板法和血涂片法計數3種方法分別計數300例樣本的白細胞和血小板。其中血涂片法計數用視場數為18和26.5的顯微鏡分別在高倍鏡下計數30個視野的白細胞數量、在油鏡下計數30個視野的血小板數量和紅細胞數量均求出均值。將實驗數據進行統計學分析(秩和檢驗與相關性分析),視場數為18的顯微鏡計數白細胞和血小板與視場數為26.5的顯微鏡間差異有統計學意義,說明兩者的數據差異明顯。

根據血小板平均值、紅細胞平均值、全自動血細胞分析儀法的紅細胞計數結果3個數值,利用血小板估算公式估算血小板數量。與全自動血細胞分析儀法進行比較,視場數為18的顯微鏡計數的正常值標本和高值標本差異無統計學意義(P>0.05),視場數為26.5顯微鏡計數低值標本和高值標本,其差異無統計學意義。由此可驗證血小板估算公式：血小板估測數量(109/L)=30個顯微鏡視野血小板的平均數/30個顯微鏡視野的紅細胞平均數×全自動血細胞分析儀法計數紅細胞的數量1012/L,對于18視場數的顯微鏡計數正常值和高值血小板來說,和26.5視場數的顯微鏡計數低值和高值血小板,計數都具有一定的參考意義,可以推廣臨床使用。此外,本次實驗還采用了另一種血小板估算方法,30個油鏡視野下血小板均值×R(設定每油鏡視野的平均血小板值與儀器計數的血小板值的轉換系數為R)[24],關麗君[25]建議采用r=10,朱建鋒等[26,27]建議使用r=15。三人均未對顯微鏡視場數進行標注,其參數差異源于不同的視場數。本研究中：(1)當r=10時,18和26.5視場數的顯微鏡血小板估算值與全自動血細胞分析儀法及改良牛鮑計數板法的分析結果均為P<0.05,說明用r=10估算18和26.5視場數顯微鏡的血小板值的參考意義不大。(2)當r=15時,視場數18的顯微鏡血小板估算值與全自動血細胞分析儀法的分析結果為低值和正常值標本P>0.05,高值標本P<0.05;與改良牛鮑計數板法的分析結果均為P>0.05。說明r=15參數能較好的適用于18視場數顯微鏡低值和正常值血小板的估算。26.5視場數的顯微鏡血小板估算值與全自動細胞分析儀法及改良牛鮑計數板法的分析結果仍均為P<0.05,說明r=15參數估算26.5視場數顯微鏡的血小板值的參考意義不大,不建議使用。

本實驗表明,隨著視場數增大,估算的血小板數越大,推測r值與視場數的大小有關,視場數越大r值越小,視場數越小則r值越大。究其原因,視場數越大,視場直徑越大,相同放大倍數下的視野越大,從而計數到相對更多的血小板,最后計數的每油鏡視野下血小板平均值就越大,以全自動血細胞分析儀法計數結果作為標準的前提下,會導致r值變小;反之同理。

本實驗得到2種視場數的顯微鏡在血涂片法中計數白細胞與血小板的范圍,在我們日常的復檢工作中,此范圍可作為顯微鏡進行白細胞和血小板復檢計數時的參考。對于血涂片法的白細胞計數,不建議采用白細胞估算方法(30個高倍鏡視野下白細胞均值×2)來進行白細胞估測計數。對于血涂片法中的血小板計數,當使用視場數為18的顯微鏡時,對于血小板數正常值或低值標本,可以通過計數每油鏡視野下的血小板均值,乘以R(r=15)進行血小板數值的估測;當血小板數高于正常值時,建議采用的r值為16.21。當使用視場數為26.5的顯微鏡計數正常值血小板時,建議的r值為6.02,計數低值血小板時,建議的r值為7.33;計數高值血小板時,建議的r值為6.54。

雖然全自動血細胞分析儀進行血常規檢測更為快速便捷,但當檢驗結果存在異常時,則需要使用顯微鏡進行血涂片復檢,以彌補血細胞分析儀檢測中的不足和誤差。因顯微鏡的視場數參數的不同,復檢時要選擇不同的平均視野計數所得的血小板數量與實際血小板數量轉換之間的關系系數R,避免因為不同參數的顯微鏡帶來的計數結果之間的差異,為臨床提供更為客觀的檢測數據。