杏鮑菇生物法絮凝斜生柵藻的工藝優化和絮凝機制

摘要： 為更好地探索生物絮凝法采收微藻細胞的可行性，考察了杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的效果，在單因素和正交試驗設計的基礎上，優化了絮凝工藝，采用Zeta電位分析法、熒光分析和傅里葉紅外光譜分析法從靜電作用、胞外聚合物等角度探討了真菌生物絮凝微藻的機制。實驗結果表明，最佳的工藝條件為：pH=3、絮凝溫度26 ℃、轉速180 r/min、藻液初始吸光度A0=0.6，此條件下絮凝率達到85.67%，且對絮凝效果的影響為藻液初始吸光度＞轉速=溫度＞時間。杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻以化學吸附為主，靜電作用、蛋白質和腐殖酸等胞外聚合物、細胞表面官能團均影響絮凝效果。本研究將為利用真菌綠色安全地絮凝微藻、提高微藻采收率提供重要參考。

關鍵詞： 斜生柵藻；杏鮑菇；生物絮凝；工藝優化；絮凝機制

中圖分類號： Q81

文獻標志碼： A

微藻有很高的利用價值，可以用于養殖廢水的凈化處理、微藻營養保健品或者醫藥產品開發、生物柴油的煉制等^［1-2］，但其大規模應用還是受到了限制，其中微藻采收成本高是重要限制因素之一^［3］。微藻采收方法主要包括：物理法，以離心和沉降為主；化學法，即在微藻培養液中加入氯化鐵、明礬等無機絮凝劑^［4］；絮凝法，包括采用殼聚糖等有機絮凝劑絮凝^［5］、電絮凝和磁絮凝及生物絮凝。物理和化學采收方法存在能源消耗大、采收效率低、引入外源化合物造成二次污染等缺點，而生物絮凝法主要利用真菌、細菌等分泌的胞外聚合物或表面電荷達到絮凝目的，具有能耗低、綠色環保且不引入化學物質因而不影響后端微藻生物質的應用等優勢，是當前微藻絮凝采收的研究熱點。譬如，CHU等^［6］用米曲霉絮凝小球藻5 h內達到了99.23%的絮凝率；BANSFIELD等^［7］研究靈芝、平菇對細小裸藻的絮凝情況，絮凝率為62%～75%。生物絮凝后形成的菌絲球體積較大，可通過簡單的過濾、沉降等方法分離，提高了采收效率。

斜生柵藻（Scendesmus obliquus）為綠藻門，綠球藻目，真集結亞目，柵藻科，柵藻屬，在廢水處理領域有很好的應用^［8］。本研究以斜生柵藻為研究對象，經過前期對5種食用菌的初步篩選，發現杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌絲球對斜生柵藻絮凝效果較好，因此，本研究利用杏鮑菇菌絲球絮凝采收斜生柵藻的工藝條件，并進一步從細胞表面電荷特征、胞外聚合物分析等角度探討了杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的機制，為采用生物法絮凝采收微藻的研究和工業應用提供理論與實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種與菌株

實驗所用斜生柵藻（S. obliquus）購自上海光語生物科技有限公司；實驗所用杏鮑菇（P. eryngii）由煙臺大學食用菌實驗室提供。

1.2 斜生柵藻和杏鮑菇菌絲球的培養

將斜生柵藻接種至含有3 L滅菌的BG-11培養液的5 L錐形瓶中，通入空氣，在培養溫度為（25±1） ℃，光照強度為3000～4000 lux，光暗比為12∶12的條件下培養。

將杏鮑菇接種到含有200 mL已滅菌PDB的錐形瓶中，置于恒溫震蕩培養箱培養，培養箱條件設置為25.0 ℃、140 r/min，培養7 d，收獲菌絲球。

1.3 斜生柵藻生物量和絮凝率的計算

斜生柵藻生物量測定采用分光光度法，通過測定斜生柵藻藻液在750 nm處的吸光度A來間接表示斜生柵藻生物量。

絮凝率R計算公式如下：

R=A0-AtA0 ×100%，

其中，A0為絮凝前斜生柵藻藻液的吸光度，At為絮凝后斜生柵藻藻液的吸光度。

1.4 絮凝工藝條件的優化

1.4.1 絮凝條件的單因素優化設計

將100 mL培養至穩定期的斜生柵藻藻液放入錐形瓶中，加入5 g（濕重）杏鮑菇菌絲球，分別考察培養液初始pH、溫度、轉速和藻液初始吸光度A0四個因素對絮凝效果的影響，單因素水平見表1。

1.4.2 絮凝條件的正交優化實驗設計 以絮凝效率為觀察指標，采用L9（34）正交試驗因素水平表（表2），考察溫度、轉速和藻液初始吸光度A0和絮凝時間對絮凝效果的影響。

1.5 吸附動力學實驗

將A0=0.6的100 mL斜生柵藻藻液置于300 mL錐形瓶中，藻液pH調為3左右，加入5 g（濕重）的杏鮑菇菌絲球，將錐形瓶置于26 ℃、180 r/min的振蕩培養箱中，測定其在0、10、20、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330 min處上清液的A0，用偽一階方程與偽二階方程對吸附過程進行擬合，探究杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的吸附特性。

偽一階動力學方程為

ln（Qe-Qt）=lnQe-K1t/2.303，

偽二階動力學方程為t/Qt=1/K2Q2e+t/Qe，

其中，Qt （ mg·g ^-1） 和 Qe （ mg·g ^-1）分別是時間 t 和平衡時菌絲球對斜生柵藻的吸附量; K1 （ min^-1）和 K2 （min ^-1） 分別是偽一階和偽二階速率常數。

1.6 表面電位的測定

采用Zeta電位儀，分別測定斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球以及藻菌球的表面電位，探究絮凝前后藻菌體系表面電位的變化。將沖洗干凈的菌絲球勻漿得到勻漿液，將勻漿液和藻液的pH分別調至3、4、5、6、7、8、9、10、11，測定各pH下的表面電位。

1.7 胞外聚合物表面官能團分析

采用熒光分光光度法測胞外聚合物，將斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球分別于60 ℃水浴鍋中加熱30 min，8000 r/min的轉速下離心10 min，獲取的上清液用0.22 μm的濾膜過濾，得到的溶液用熒光分光光度計進行測定。

采用傅里葉紅外光譜測定凍干樣品的表面官能團，將斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球和藻菌球沖洗干凈后凍干，用紅外光譜儀（島津84005）進行測定。

1.8 統計分析

數據用SPSS13.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析和LSD法檢驗。當Plt;0.05時，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 生物絮凝工藝條件的優化

2.1.1 單因素實驗結果 圖1顯示了初始pH、溫度、轉速、藻液初始吸光度A0對杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻效果的影響。由圖1（a）可見，pH對微藻絮凝效果有顯著影響，pH為3時，絮凝效果最好，5 h后絮凝率達到了73.45%，與其他實驗組之間存在顯著性差異（Plt;0.05）；絮凝時溫度升高有利于絮凝，圖1（b）結果顯示，26 ℃時絮凝率最高為83.55%，顯著高于20 ℃、23 ℃實驗組（Plt;0.05），但溫度進一步升高，絮凝效果無顯著性差異；轉速提高有利于微藻絮凝，圖1（c）顯示180 r/min下微藻絮凝率最高，達到83.55%，顯著高于其他實驗組（Plt;0.05）；藻液初始吸光度A0越高，絮凝率越低，圖1（d）顯示藻液初始吸光度A0為0.6時，絮凝率最高80.99%。

上述實驗結果分析表明，低pH、高的轉速和一定程度提高溫度有利于微藻絮凝，分析原因為：越高的轉速，微藻與菌絲球的碰撞機會越多，因此絮凝率越高，這與CHEN的研究^［9］一致；pH降低，藻菌之間的靜電斥力越低、越有利于微藻絮凝^［2］，本實驗結果中，pHgt;5的三個實驗組絮凝率比pH=5的高，分析與CHU提出的較高的pH可以刺激真菌胞外聚合物的分泌有關^［6］，藻菌絮凝受到電荷中和、胞外代謝物等多種因素的影響；低溫下絮凝率低的原因分析與杏鮑菇菌絲球和斜生柵藻在低溫下代謝受到抑制而藻菌代謝產物在藻菌絮凝中起著重要的作用有關^［11-12］；A0=1.3組在2 h后絮凝率變低，發生了解析現象，所以固定菌絲球添加量不變的情況下，過高的藻液初始吸光度A0會使達到吸附飽和的藻菌球發生解析。

2.1.2 絮凝工藝正交試驗優化結果

正交實驗結果以及方差分析如表3和表4所示，根據各試驗因子的平均數可以看出，最優的絮凝條件為：溫度26 ℃、轉速180 r/min、A0=0.6，絮凝時間5 h，此條件下絮凝率為85.67%。根據差值R可以看出，各因素對絮凝率的影響從大到小為藻液初始吸光度A0＞轉速=溫度＞時間，且轉速及藻液初始吸光度A0對杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的效果均存在顯著影響（P＜0.05）。

2.2 杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的機制分析

2.2.1 絮凝吸附動力學

杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻偽一階、偽二階動力學擬合結果如圖2所示。圖中結果顯示偽一階動力學和偽二階動力學的R2值均大于0.9，且偽二階動力學擬合方程的R2值（0.990）大于偽一階動力學方程的R2值（0.924）。偽一階動力學方程和偽二階動力學描述的分別是物理吸附和化學吸附，說明杏鮑菇菌絲球對斜生柵藻的吸附主要依靠化學吸附（共價鍵、離子鍵的作用），物理吸附（范德華力）次之。這與NIE等^［13］關于米曲霉絮凝銅綠微囊藻以化學吸附為主、物理吸附為輔的結果一致。

2.2.2 藻菌體系電位表征

圖3顯示了杏鮑菇菌絲球、斜生柵藻的Zeta電位隨pH的變化，結果表明，在pH=3時，斜生柵藻表面電位為負，杏鮑菇菌絲球表面電位為正，此時帶正電的杏鮑菇菌絲球與帶負電的斜生柵藻會發生電荷中和，促進微藻絮凝。藻菌球在pH=3時的Zeta電位為-1.51 mV，帶負電且電位絕對值小于斜生柵藻，說明杏鮑菇菌絲球表面電荷被微藻飽和。此結果與“2.1.1 ”中pH=3為最優條件的結果吻合。

隨著pH的增大，斜生柵藻和杏鮑菇菌絲球表面皆帶負電荷，導致兩者靜電斥力增大，絮凝率降低，所以理論上pH越高，絮凝率越低，但根據之前的實驗結果，斜生柵藻絮凝率并沒有隨著pH的升高而下降，反而pH為7、9、11時的絮凝率高于pH為5的絮凝率，這一現象說明在杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的過程中，不只有靜電引力的作用，藻菌表面分泌的胞外聚合物可能也會促進藻菌之間的絮凝，提高絮凝率。

2.2.3 藻菌體系胞外聚合物分析

對斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球的胞外聚合物進行三維熒光光譜分析，結果如圖4所示，其中，Ⅰamp;Ⅱ區、Ⅲ區、Ⅳ區、Ⅴ區代表的物質類型分別為熒光芳香類蛋白、類富里酸、溶解性微生物代謝產物（例如多糖、蛋白質）、腐殖酸類。由圖4可見，微藻的熒光峰出現在Ⅰamp;Ⅱ區和Ⅳ區，代表的是芳香族氨基酸色氨酸和蛋白質類可溶性代謝物類酪氨酸相關的物質^［14］；杏鮑菇菌絲球、絮凝后上清液、藻菌球的熒光峰均出現在Ⅳ區和Ⅴ區，為蛋白質峰和腐殖質峰。結果表明，在絮凝中主要起作用的胞外聚合物為藻菌分泌的蛋白質及腐殖酸類物質。真菌胞外聚合物中含有的大分子物質如蛋白質、多糖等，可以通過芳環之間的分子間力來吸附微藻，使微藻附著在菌絲球表面^［11］，腐殖質含有多種氨基，羰基和苯酚羥基，可以決定有機聚合物的遷移和隨后的轉化，轉化后的有機物可能有助于絮凝^［6，15］。另外，絲狀真菌可以表達富含半胱氨酸的蛋白質，具有疏水性、黏附性，能夠通過疏水相互作用使微藻附著在菌絲體中^［16］。

與絮凝前的微藻相比，絮凝后上清液的蛋白質峰熒光強度稍有減弱，并多出腐殖質峰，有研究表明真菌菌絲的胞外聚合物不僅能與微藻細胞相互作用，而且對微藻代謝產物的去除也有顯著影響^［13］，這可能是絮凝后上清液蛋白質峰較弱的原因；絮凝后菌絲球的蛋白質峰強度稍強，而腐殖質峰較弱，說明微藻和真菌可以互相促進代謝，驗證藻菌間存在一定的協同作用。WANG等^［17］的研究也表明，真菌-微藻相互作用會使富含色氨酸的蛋白質含量增加。

2.2.4 藻菌體系表面官能團分析 由圖5斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、藻菌球的傅里葉變換紅外光譜圖可見，藻菌球和杏鮑菇菌絲球特征峰的位置幾乎一致，絮凝形成的藻菌球特征峰峰值強度均弱于菌絲球。有研究表明，絮凝后絮凝劑中的活性位點會被微藻占據，降低官能團拉伸振動的強度^［13］，所以菌絲球表面的官能團與微藻結合導致微藻絮凝。藻菌球在3417 cm、1654 、1078 cm^-1處的特征峰比真菌弱很多，說明這三個特征峰對應的N—H、C═O、P—O在杏鮑菇菌絲球絮凝斜生柵藻的過程中起了較為重要的作用。

表5顯示了斜生柵藻、杏鮑菇菌絲球、藻菌球傅里葉變換紅外光譜中與主要振動相關的表面官能團及其振動形式。酰胺基團與真菌細胞壁中的糖胺聚糖和蛋白質有關^［18］，主要來源于N-乙酰葡糖胺和乙酰半乳糖胺半乳聚糖，酰胺帶正電，可以與帶負電的微藻結合，使微藻吸附在真菌上^［13］。苯環多存在于細胞分泌的腐殖質和大多數蛋白質中，屬于芳香環，有研究表明真菌-微藻芳香環的π-電子系統之間的相互作用（π-π*躍遷）參加了真菌對微藻的絮凝^［19］。

3 結 論

本研究利用杏鮑菇形成的菌絲球絮凝斜生柵藻，開發了一種綠色安全、能耗低的微藻絮凝方法，最佳絮凝條件為pH=3、絮凝溫度26 ℃、轉速180 r/min、藻液初始吸光度A0=0.6，此條件下經過5 h絮凝率達到85.67%。對絮凝機制的研究表明，真菌絮凝微藻過程以化學吸附為主，靜電作用、胞外聚合物的蛋白質代謝物和腐殖質以及酰胺等表面官能團在斜生柵藻的絮凝過程中起重要作用。本研究為開發經濟高效、綠色安全的微藻采收方法提供參考，有利于促進微藻生物質的工業化應用。

參考文獻：

［1］" IBRAHIM T N B T， FEISAL N A S， KAMALUDIN N H， et al. Biological active metabolites from microalgae for healthcare and pharmaceutical industries： A comprehensive review［J］. Bioresour Technol， 2023， 372： 128661.

［2］ KHOO K S， AHMAD I， CHEW K W， et al. Enhanced microalgal lipid production for biofuel using different strategies including genetic modification of microalgae： A review［J］. Prog Energy Combust Sci， 2023， 96： 101071.

［3］ MUHAMMAD G， ALAM M A， MOFIJUR M， et al. Modern developmental aspects in the field of economical harvesting and biodiesel production from microalgae biomass［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2021， 135： 110209.

［4］ CHATSUNGNOEN T， CHISTI Y. Harvesting microalgae by flocculation-sedimentation［J］. Algal Research， 2016， 13： 271-283.

［5］ RASHID N， REHMAN M S U， HAN J I. Use of chitosan acid solutions to improve separation efficiency for harvesting of the microalga Chlorella vulgaris［J］. Chem Eng J， 2013， 226： 238-242.

［6］ CHU R Y， LI S X， YIN Z H， et al. A fungal immobilization technique for efficient harvesting of oleaginous microalgae： Key parameter optimization， mechanism exploration and spent medium recycling［J］. Sci Total Environ， 2021， 790： 148174.

［7］ BANSFIELD D， SPILLING K， MIKOLA A， et al. Bioflocculation of Euglena gracilis via direct application of fungal filaments： a rapid harvesting method［J］. J Appl Phycol， 2022， 34（1）： 321-334.

［8］ SALAZAR J， SANTANA-SNCHEZ A， NKKIL J， et al. Complete N and P removal from hydroponic greenhouse wastewater by Tetradesmus obliquus： A strategy for algal bioremediation and cultivation in Nordic countries［J］. Algal Research， 2023， 70： 102988.

［9］ CHEN J， LENG L J， YE C S， et al. A comparative study between fungal pellet-and spore-assisted microalgae harvesting methods for algae bioflocculation［J］. Bioresour Technol， 2018， 259： 181-190.

［10］ BHATTACHARYA A， MATHUR M， P， et al. A rapid method for fungal assisted algal flocculation： Critical parameters amp; mechanism insights［J］. Algal Research， 2017， 21： 42-51.

［11］ LI Y， XU Y T， LIU L， et al. Flocculation mechanism of Aspergillus niger on harvesting of Chlorella vulgaris biomass［J］. Algal Research， 2017， 25： 402-412.

［12］ LI Y， XU Y T， ZHENG T L， et al. Flocculation mechanism of the actinomycete Streptomyces sp. hsn06 on Chlorella vulgaris［J］. Bioresour Technol， 2017， 239： 137-143.

［13］ NIE Y， WANG Z M， WANG W， et al. Bio-flocculation of Microcystis aeruginosa by using fungal pellets of Aspergillus oryzae： Performance and mechanism［J］. J Hazard Mater， 2022， 439： 129606.

［14］ WEN G， WANG T， LI K， et al. Aerobic denitrification performance of strain Acinetobacter johnsonii WGX-9 using different natural organic matter as carbon source： Effect of molecular weight［J］. Water Res， 2019， 164： 114956.

［15］ SHA J， LU Z Y， YE J， et al. The inhibition effect of recycled Scenedesmus acuminatus culture media： Influence of growth phase， inhibitor identification and removal［J］. Algal Research， 2019， 42：101612.

［16］ LIN W Z， CHEN L N， TAN Z X， et al. Application of filamentous fungi in microalgae-based wastewater remediation for biomass harvesting and utilization： From mechanisms to practical application［J］. Algal Research， 2022， 62： 102614.

［17］ WANG J， CHEN R， FAN L， et al. Construction of fungi-microalgae symbiotic system and adsorption study of heavy metal ions［J］. Sep Purif Technol， 2021， 268.

［18］ ZORN S M F E， REIS C E R， SILVA M B， et al. Consortium growth of filamentous fungi and microalgae： evaluation of different cultivation strategies to optimize cell harvesting and lipid accumulation［J］. Energies， 2020， 13（14）：3648.

［19］ PAN J Y， BAI X T， LI Y Y， et al. HKUST-1 derived carbon adsorbents for tetracycline removal with excellent adsorption performance［J］. Environ Res， 2022， 205： 112425.

Process Optimization and Flocculation Mechanism on Biological Flocculation of Scendesmus obliquus by Pleurotus eryngii

SUN Liqin， JI Songsong， WANG Xiangying， LI Yan

（School of Life Sciences， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：To better explore the biological flocculation effect on microalgae， the flocculation of P. eryngii mycelium pellets on S. obliquus cells is investigated. The flocculation process is optimized based on single-factor and orthogonal experimental designs， then Zeta potentiometry， fluorometric analysis and fourier infrared spectroscopy are selected to disclose the mechanisms of fungal bioflocculation on microalgae from the perspectives of electrostatic interaction， extracellular polymers. The experimental results show that the optimum flocculation process are： pH=3， flocculation temperature 26 ℃， rotational speed 180 r/min， and initial microalgae absorbance A0=0.6. The flocculation rate reaches 85.67% under the above conditions， and the impact sequence is initial microalgae absorbance gt; rotational speed=temperature gt; time. S. obliquus is flocculated by P. eryngii mycelium pellets mainly through chemisorption， and other factors including electrostatic interaction between the fungal and microalgal cells， extracellular polymers such as proteins and humic acids， functional groups of cell surface also perform important function. This study will provide important references for microalgae flocculation by fungi in a green safe way and improve the harvesting rate of microalgae.

Keywords："Scendesmus obliquus; Pleurotus eryngii; bioflocculation; process optimization; flocculation mechanism

（責任編輯 周雪瑩）